Mercan Kolonilerinde Polip Kefalinin Laboratuvar Deneysel Kullanımı için Bireyselleştirilmiş Mikropropagatlar Elde Edilmesini İndüklemek

Skleraktin veya resif oluşturan mercanlar, karbonat iskeletleri oluşturabilen, resifler oluşturabilen ve derinlerden sığ su ortamlarına kadar bulunabilen yapısal olarak karmaşık ekosistemler oluşturabilen cnidarianlardır¹. Tropikal mercan resifleri yüksek biyolojik çeşitliliğe ev sahipliği yapar ve kıyı koruma ve balıkçılık bakımı gibi temel ekosistem hizmetleri sunar². Sığ su resifi oluşturan mercanların çoğu, mercanların iskeletlerini oluşturmak için ihtiyaç duydukları enerjiyi sağlayan Symbiodiniaceae familyasının algleriyle karşılıklı bir ilişkiye dayanır. Mercan ve algler arasındaki simbiyoz, çevresel stresle kırılabilir ve mercan ağartmasına neden olabilir ^3,4,5,6. Son zamanlardaki sıcaklık anomalileri, dünya çapında büyük mercan ağartma olaylarına neden olmuş, kitlesel mercan ölümlerine ve kalıcı resif bozulmasına yol açmıştır 7,8,9,10,11. Bu fenomen, simbiyontların apoptoz, otofaji ve ekzositoz gibi ısı stresi ile ilişkili hücresel mekanizmalar tarafından atılmasına dayandığından, mercan ağartma, ekosistem ölçeğinde sonuçları olan hücresel bir süreç olarak tanımlanabilir 5,6,12, yani mercan hücrelerinin veya dokularının in vitro kültürlerine sahip olmak^, bu fenomeni yakından incelemek için uygulanabilir.

Mercan resiflerinin önemi ve özellikle son yirmi yılda karşı karşıya kaldıkları büyük tehditler^nedeniyle2, mercanlar dünya çapında koruma ve restorasyon amaçlı araştırmaların odağı haline gelmiştir¹³. Bununla birlikte, güvenilir, tekrarlanabilir ve mercanları incelemek için minimum çevresel etki sunan yaklaşımların ve deneysel sistemlerin geliştirilmesi bu alanda büyük bir mücadeledir.

Mikropropagasyon, bir organizmanın genotipinin, biyolojik materyalinin kontrollü kaplarda kültürlenerek in vitro çoğalması olarak tanımlanır^14,15. Hücrelerin, dokuların ve organların kültürlenmesi, son yıllarda bitki ve hayvan biyolojisi için çok önemli olmuştur. Organizmaların laboratuvarlarda kitlesel üremesine, farklı tedavilerin (ilaçlar ve farmasötikler gibi) hızlı bir şekilde değerlendirilmesine ve hücre fonksiyonunun doğrudan incelenmesine izin verir^14,15,16,17. Genel olarak, in vitro modeller, daha iyi kontrol edilen fiziksel ve kimyasal koşullar altında farklı organizmaların çalışmalarını tamamlamak ve derinleştirmek için yararlı olmuştur. İn vitro kültürleme tekniklerinin avantajları nedeniyle, farklı hayvan hücresi ve doku kültürü teknolojileri geliştirilmiş, optimize edilmiş ve çok sayıda uygulama için çoklu hücre hatlarının çalışıldığı ve ticarileştirildiği birçok araştırma alanında önemli araçlar olarak kullanılmıştır^16,17,18.

1882'deki ilk hayvan doku kültüründen bu yana, hücre ve doku kültürü bilgisindeki birçok ilerleme kaydedilmiştir 17, doğal ve sentetik ortamın kullanılması, yerleşik hücre hatlarının icadı ve çok sayıda hücre tipini daha iyi bir şekilde yetiştirmek için 3D ortamın geliştirilmesi gibi^{16,17, 18,19}. Bununla birlikte, hücre biyolojisi alanı çoğunlukla seçilmiş bir model organizma grubuna odaklanırken, birçok takson hala hücre, doku veya organların in vitro kültürlerine sahip değildir²⁰. Örneğin, mercan araştırmalarında, mercan hücresi araştırmalarını birincil hücre kültürlerinin kullanımıyla sınırlayan araştırma için ölümsüzleştirilmiş hücre hatları yaygın olarak kullanılmamıştır. Bu kültürlerin yaşayabilirliği birkaç hafta 21 ile sınırlıdır,^2021'in başına kadar 13 günden fazla bir süre boyunca tüm mercan dokularından bireysel hücrelerin hayatta kalmasını kaydeden hiçbir çalışma yoktur²². Yayınlanacak sürdürülebilir mercan hücresi hatlarının ilk raporu, 6 aya kadar yaşayan Acropora tenuis hücreleri ile yapıldı ve bu hücrelerin gelecekteki araştırmalar için faydası araştırılmaya devam ediyor²³.

Mercan hücre kültürlerinin kültürlenmesindeki sınırlamaların üstesinden gelmek ve mercanların genel doku organizasyonunu koruyan bir laboratuvar kültürünü sürdürmek için, izole poliplerin kullanımı son zamanlarda mercan biyolojisi araştırmaları için bir model olarak önerilmiştir^24,25. Polipler, mercanların anatomik birimleridir ve her birinin oral disklerinin merkezinde bulunan bir ağzı vardır ve aboral bölgesindeki koenosark tarafından diğer poliplere bağlanır²⁶. Canlı poliplerin ayrılması, doğal olarak, akut stresin polipler arasındaki koenosarkın sindirimine neden olduğu ve daha sonra koloninin iskeletinden ayrılabildiği polip kurtarma işlemi ile gerçekleşir^25,27,28. Bu fenomenin, oktomercanlar^29,30,31, siyah mercanlar 32 ve skleraktin mercanları 25,27,28,32,33 dahil olmak üzere çeşitli taksonlara dahil olduğu bildirilmiştir ve sudaki kalsiyum eksikliği ^24,34, artan asitlik ³⁵ gibi çoklu çevresel stresörlerle ilişkilendirilmiştir. hiperozmotik koşullar 25,27,32,36, yüksek sıcaklıklar 36,37, açlık 33, havaya maruz kalma^25,30 ve insektisit kontaminasyonu ^28,38. Polip kurtarma paketi, örneğin, dünya çapında yaygın olarak dağıtılan ve mercan araştırmalarında model olarak yaygın olarak kullanılan pocilloporid mercanlar^19'da bildirilmiştir. Pocillopora damicornis ve Styllophora pistillata gibi bu gruba ait türler, 5 mm'lik bir parçadan yaklaşık 30-40 mikropropagat üretmiştir²⁵. Bu sayı, küçük bir mercan parçasından genetik olarak özdeş birçok birey üretme imkanı yarattığından, mercan mikropropagasyonu için bir yöntem olarak polip kurtarma işleminin kullanılmasının avantajını vurgulamaktadır. Araştırma için izole poliplerin kullanılması, şişeler ve Petri yemekleri gibi kontrollü laboratuar ortamlarında kültürlenme olasılığı ile ilgili hücre kültürleriyle aynı avantajlara sahiptir. Ek olarak, canlı polipleri korumak için mikroakışkan platformlar, bu mikropropajların kontrollü su akışı, yüzey ve sıcaklık^24,25 ile nispeten ucuz ve çoğaltılması kolay ortamlarda tutulabileceğini göstermiştir. Bu mikroakışkan platformlar, canlı mercan yapılarını mikroskop altında doğrudan^24,25 görselleştirmek için de kullanılabilir.

Bu makalede, bireysel mercan poliplerini kolonilerinden izole etmek için geliştirilen teknikleri özetlemekte ve göstererek, uzun süreli kültür için laboratuvar koşullarında nasıl korunacaklarını göstermekteyiz. Tartışılan yöntemler arasında buharlaşma ve yüksek tuzlulukta deniz suyunun pompalanması yoluyla hiperozmotik koşullar yoluyla polip kurtarma ve kalsiyum içermeyen deniz suyunda inkübasyon bulunmaktadır.

Bu çalışma için Al Fahal resifinden (22.305118 N; 38.964568 E) Pocillopora verrucosa mercan türlerine ait bir koloni SCUBA tarafından çekiç ve keski kullanılarak dalış yapılarak toplanmıştır. Koloninin cinsi morfolojik olarak tanımlandı ve türleri, Kızıldeniz'den Pocillopora da dahil olmak üzere daha önce yayınlanmış çalışmalara dayanarak P. verrucosa olarak sınıflandırıldı, bu da genetik açıdan bu alanda bulunan türlerin P. verrucosa^39,40 olduğunu gösteriyor. Al Fahal resifi, korunan bir çevre alanının parçası değildir ve mercan toplama için özel bir izne gerek yoktur. Koloni, parçalanmadan ve poliplerinin "kurtarılmasından" önce bir ay boyunca 300 L'lik bir akvaryumda tutuldu. Akvaryum, iki akvaryum ısıtıcısı, üç pompa ve iki ışık kaynağı ile 26 ° C'de tutuldu (bkz. Akvaryumun sıcaklığı, iki ısıtıcının her birini bir sıcaklık kontrol cihazına bağlayarak korunmuştur. Işık emisyonu sabah 6'da başlayıp akşam 6'da bitecek şekilde programlandı ve 230 μmol foton m-2 ^{s-1 ile 12}:00'de zirveye ulaşan bir ışıma eğrisi ^üretti.

1. Su buharlaşmasından sonra yüksek tuzluluk ile polip kurtarma

NOT: Bu yöntem Shapiro ve ^ark.25'ten uyarlanmıştır. Pocillopora verrucosa'dan farklı türler kullanılıyorsa, kesilecek parçanın boyutunu belirlemeden önce poliplerin boyutu dikkate alınmalıdır.

1. Çapraz kesme penseleri kullanarak bir mercan kolonisinden küçük parçaları (uzunluğu 1 cm'den az) kesin (bkz.
   NOT: Kesici aletleri kullanılan mercan türlerine göre uyarlayın. Diyagonal pense, mercanları ince dallarla kesmek için kullanışlıdır. Mevcut çalışmada, her tedavi için bir parça kesilmiştir, ancak parçaların sayısı ve boyutu, istenen polip sayısına bağlı olarak değişebilir. Kesilen parçaların boyutu, buharlaşmadan sonra suyun derinliğini geçmemelidir, bu nedenle mercanlar işlem yapıldıktan sonra tamamen suyun içinde kalır.
2. Kesilen parçaları, mercan kolonisinin alıştığı 12 mL deniz suyuyla doldurulmuş küçük Petri kaplarına yerleştirin. Bu, yapay deniz suyu ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya mercan kolonisinin parçalanmadan önce yerleştirildiği tuzlulukla aynı tuzlulukta filtrelenmiş deniz suyu olabilir.
   NOT: Parçanın tamamen su ile kaplanması önemlidir. Bir Petri kabındaki 12 mL, kesilen parçayı örtmek için yeterli değilse, kabı ve hacmi buna göre optimize edin. Bu çalışmada, kullanılan su Kızıldeniz'den toplandı ve tuzluluğu, çok parametreli bir sayaçla ölçülen 40 PSU idi (bkz.
3. Plakayı ortam sıcaklığında ~ 24 saat açık bırakın, böylece su buharlaşabilir ve tuzluluğu yavaş yavaş artabilir. Polipler arasında doku sindirimi gözlenebildiğinde, Adım 1.4'e geçin.
   NOT: Kuluçka süresi geçtikten sonra, suyun tuzluluğu başlangıçtan yaklaşık% 40 daha yüksek olmalı ve poliplerin iskeletten ayrılmaya hazır olması gerekir.
4. 1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak, mercan dokusuna yakın nazik bir akış oluşturun. Akış, etraflarındaki dokuyu iskeletten zaten sindirmiş olan poliplerin tamamen ayrılmasına yavaşça yardımcı olacaktır.
   NOT: Pipetle birlikte su akışı oluşturulduğunda, ayrı polipler veya polip grupları iskeletten pul şeklinde çıkmalıdır. Bunun yerine bulutlu bir madde çıkarsa, doku ölümünü veya parçalanmasını gösterir, bu da mercanların çok uzun süre veya çok stresli bir durumda (bu durumda, yüksek tuzluluk) inkübe edildiği anlamına gelir. Polipleri ayırmak için yumuşak bir su akışı yapmak çok önemlidir, çünkü daha güçlü bir akış onlara fiziksel zarar verebilir.
5. Petri kabındaki suyu bir pipet kullanarak yavaşça izosmotik suyla değiştirin (Adım 1.2'deki ile aynı suyu kullanın). 10 dakikadan fazla% 50'lik bir su değişimi, polipleri stresli olmayan bir tuzluluk durumuna geri alıştırmak için yeterlidir.
   NOT: Kızıldeniz'den Pocillopora verrucosa pocilloporid türünün mercan kolonileri kullanıldığından, bu eşsiz ortamdaki mercanların hangi özel koşullar altında kurtarılacağını belirlemek için testler yapılmıştır. Diğer resif ortamlarının çoğuna kıyasla Kızıldeniz'in yüksek tuzluluğunu vurgulamak önemlidir.

2. Yüksek tuzlulukta deniz suyu temini ile polip kurtarma

NOT: Bu yöntem Chuang ve ^ark.27'den uyarlanmıştır.

1. Bir tuzluluk probu ile ölçülen tuzluluk% 85 oranında artana kadar deniz suyuna NaCl ekleyerek 3 L yüksek tuzluluk deniz suyu hazırlayın.
   NOT: Mevcut çalışmada, Kızıldeniz'den gelen 40 PSU deniz suyundan 74 PSU yüksek tuzlulukta deniz suyu hazırlanmıştır.
2. Adım 1.1'de açıklandığı gibi küçük mercan parçalarını kesin.
3. Kesilen parçaları, peristaltik bir pompaya bağlı 3 L izosmotik deniz suyu (bu durumda, mercanlar için stresli olmayan tuzluluğa sahip deniz suyu, Adım 1.2'de kullanılanla aynı) ile doldurulmuş 10 L'lik bir kaba yerleştirin (bkz.
   NOT: Mercan sağlığının daha iyi korunması için, koloninin daha önce maruz kaldığı aynı akvaryum koşullarını simüle etmek için sıcaklık kontrolörleri, hava pompaları ve ışıklar eklenebilir. Mevcut çalışmadaki inkübasyon sırasında, mercan parçaları günlük 12 saatlik bir ışık döngüsü altında, 26 ° C'de kaplarda tutuldu. Su hareketi ve sıcaklığın homojenizasyonu hava pompaları tarafından sağlandı.
4. Mercan parçaları içeren kabı, 126 mL / s hızında peristaltik pompayı kullanarak 24 saat boyunca Adım 2.1'de hazırlanan yüksek tuzluluktaki deniz suyuyla doldurun. Yaklaşık %40'lık artan bir tuzlulukta toplam 3 L su ekleyin.
   NOT: Yüksek tuzluluklu su, amaçlanan tuzluluğa ulaşana kadar deniz suyuna NaCl eklenerek üretilebilir.
5. Polipleri iskeletten serbest bırakmak için pipetle nazik bir su akışı oluşturun (Adım 1.4.).
6. Poliplerin bulunduğu suyu izosmotik su ile yavaşça değiştirin (Adım 1.5.). Ardından, Adım 4 veya Adım 5'e geçin.

3. Kalsiyumsuz deniz suyu inkübasyonu ile polip kurtarma

NOT: Bu yöntem Pang ve ^ark.24'ten uyarlanmıştır.

1. 1 L deiyonize suya 26.29 g NaCl, 0.872 g KCl, 2.16 g MgSO 4, 11.94 g MgCl 2, 3.42 g Na₂SO ₄ ve 0.286 g NaHCO₃ (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek kalsiyum içermeyen yapay deniz suyu (CaFSW) çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Bu çözüm, 40 PSU'luk bir tuzluluğa uyarlanmış mercanlar için daha uygun olacak şekilde önceki protokollerden ayarlanmıştır. Diğer tuzluluk koşullarına uyarlanmış mercanlar için, aynı oranda tuz kullanın, ancak kullanımdaki mercanlara daha uygun tuzluluğu elde etmek için toplam çözünen kütlesini ayarlayın.
2. Adım 1.1'de açıklandığı gibi küçük mercan parçalarını kesin.
3. Mercan parçalarını daha önce hazırlanan CaFSW ile doldurulmuş Petri kaplarına batırın (Adım 3.1.) ve yörüngesel inkübatörlerde 3 saat boyunca 80 rpm dönme hızında inkübe edin.
   NOT: Yine, parçayı tamamen suyla örtmek önemlidir. Bir Petri kabı parçayı örtmek için yeterli değilse, kabı ve hacmi deneysel ihtiyaca göre optimize edin.
4. Parçaları, Petri kaplarına veya 40 PSU yapay deniz suyu ile hazırlanan %20 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ve 100 mg/mL ampisilin çözeltisi ( bakınız Malzeme Tablosu) ile doldurulmuş 6 delikli plakalara aktarın. Parçaları 26 ° C ve 80 rpm'de inkübe edin, polipler arasında doku sindirimi gözlenene ve bireysel polipler iskeletten ayrılmaya başlayana kadar her gün medyayı değiştirin.
   NOT: Çoğu durumda, doku sindirimi bu ortamda inkübasyondan sonraki 20 saat içinde tamamlanır ve değişim gerekmez.
5. Bir pipet kullanarak ilk geri kazanım için polipleri sterilize edilmiş deniz suyuna aktarın. 1 saatlik inkübasyondan sonra, Adım 4 veya Adım 5'e geçin.

4. Petri kaplarında polip bakımı

1. Polipler stressiz tuzluluk ile filtrelenmiş deniz suyuna geri döndükten sonra, stereomikroskop altında siliyer akışın neden olduğu doku bütünlüğünü ve hareketini gözlemleyerek canlı polipleri seçin.
2. Seçilen polipleri bir cam veya plastik Petri kabına yerleştirin ve Petri kabını bir plankton ağı (200 μm ağ boyutu, bkz.
   NOT: Ağ ağının boyutu, poliplerin boyutuna göre değişebilir. Ağların poliplerden daha küçük gözeneklere sahip olması ve su değişimine ve ışık penetrasyonuna izin vermesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.
3. Petri kabını, kullanılan mercan türleri için uygun koşullara sahip bir akvaryumun içine yerleştirin.
   NOT: Bu çalışmada, koşullar 26 ° C'de 40 PSU filtrelenmiş deniz suyu ve 12 saatlik bir ışık döngüsü idi.
4. Suyu yenilemek ve bulaşıkları temizlemek için Petri bulaşıklarını haftada en az bir kez açın. Bu adım, yerel olarak toksik bileşikleri serbest bırakarak mercan polipleriyle rekabet edebilecek veya zarar verebilecek alg aşırı büyümesini ortadan kaldırmak için önemlidir.

5. İnkübatörlerde polip bakımı

1. Adım 4.1'de açıklandığı gibi uygulanabilir polipleri seçin.
2. Polipleri, transfer pipetleri kullanarak 50 mL izosmotik deniz suyu ile doldurulmuş 75^cm2 yüzey hücre şişelerine yerleştirin.
   NOT: Mevcut çalışmada, polip bakımı için Kızıldeniz'den toplanan filtrelenmiş deniz suyu kullanılmıştır. Adım 1.2'de kullanılanla aynı özelliklere sahip su kullanılabilir.
3. Şişeleri kapatın ve inkübatörlere taşıyın. İnkübatörleri 26 °C ve 40 rpm'de 12 saatlik ışık döngüsüne ayarlayın. Su hacminin% 50'sini her 4 günde bir değiştirin ve duvarlarda yosun veya biyofilmle dolduklarında / dolduklarında içeriği temiz şişelere aktarın.
   NOT: Görüntüler, temsili sonuçlar için HD kamera ile donatılmış tamamen apokromatik bir yakınlaştırma sistemi ile yakalanmıştır (bkz.

Polip kurtarma, P. verrucosa türünün tek bir kolonisine ait mercan parçalarında üç farklı yöntem izlenerek indüklendi (Şekil 1). Petri kaplarında mercan parçalarının başlangıçta 40 PSU'da suyla doldurulmuş ortam sıcaklığında 24 saat inkübasyonundan sonra su buharlaşmasının neden olduğu yüksek tuzluluğun neden olduğu kurtarma işlemi, daha sonra işlem bittiğinde 59 PSU'luk nihai bir tuzluluğa ulaştı (Şekil 2A-C, I). Tuzlu su temini ile kurtarmaya da, başlangıçta 40 PSU'da suda 24 saatlik inkübasyondan sonra, 12 saat sonra 52 PSU'ya ve işlemin sonunda 24 saat sonra 59 PSU'luk bir tuzluluğa ulaşan suya ulaşıldı (Şekil 2D-F, I). Her iki deneyde de, tuzluluktaki bir artış, polipler tarafından doku sindiriminin indüklenmesinden sorumluydu. 12 saat sonra, yüksek tuzluluk durumu, poliplerin coenosarc'ın kademeli olarak incelmesi ile birlikte büzülmesine neden oldu ve sonuçta 24 saat sonra poliplerin son ayrılmasına neden oldu. Kalsiyumsuz deniz suyunda inkübasyon yoluyla kurtarma indüksiyonu, CaFSW'de 3 saatlik bir inkübasyondan sonra% 20 DMEM ortamında 20 saatlik bir inkübasyondan sonra tamamlandı (Şekil 2G-H). Doku, bireyselleştirilmiş mercan polipleri (Şekil 3A-C) ve "doku topları" üretilene kadar bir pipetle itildikten sonra her üç yöntemde de iskeletten ayrıldı.

Ayrılmadan sonra, her üç yöntemden polipler toplandı ve ağlarla veya hücre şişeleriyle kaplı Petri kaplarına tahsis edilmeden önce deniz suyunda iyileşmelerine izin verildi. Evaporasyon ve su temini yöntemlerinden elde edilen polipler akvaryumların içindeki Petri kaplarında muhafaza edilmiş ve sırasıyla 6 hafta ve 8 hafta boyunca hayatta kalmıştır (Şekil 3D ve Şekil 3F). Bu mikropropajatlar, dokunaçları, bazal diskleri ve ağızları sunan poliplerin olağan anatomisini korudu1. Kalsiyumsuz deniz suyunda inkübasyonla elde edilen polipler, 1 güne kadar hayatta kalan kısa bir ömre sahipti ve daha sonra dokuları ayrıştı. İnkübatörlerin içindeki hücre kültürü şişelerinde tutulan deniz suyu buharlaştırma yönteminden elde edilen polipler, dokuların ayrışması olmadan 3 haftaya kadar hayatta kalmıştır (Şekil 3F). Her durumda, polipler substrata bağlanamasa bile, görsel olarak sağlıklıydılar ve renklerini korudular, zooxanthellae hücreleri dokularının içinde hala görülebiliyordu1.

Şekil 1: Polip kurtarma indüksiyonu için test edilmiş üç farklı metodolojinin şematik gösterimi (solda) ve ardından edinilen poliplerin laboratuvar koşullarında tutulması için iki yöntemin gösterilmesi (sağda). (A) Su buharlaşması ile polip kurtarma metodolojisinin gösterimi. (B) Polip kurtarma metodolojisinin yüksek tuzlulukta deniz suyu temini ile temsil edilmesi. (C) Kalsiyumsuz deniz suyu inkübasyonu ile polip kurtarma metodolojisinin temsili. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mercan türü P. verrucosa'nın parçalarını kullanarak üç farklı metodolojinin neden olduğu polip kurtarma sürecinin görüntüleri. (A-C) Kuluçkadan sonra sırasıyla 0 saat, 12 saat ve 24 saat sonra bir mercan parçası, su buharlaştırma yöntemini kullanarak bir Petri kabında. (D-F) Yüksek tuzluluklu deniz suyu temini yöntemini kullanarak, inkübasyondan sonra sırasıyla 0 saat, 12 saat ve 24 saatte bir mercan parçası. (G,H) Kalsiyum içermeyen deniz suyu inkübasyon yöntemine maruz kalan mercan parçaları sırasıyla önce ve sonra. Kalsiyumsuz yapay deniz suyundaki inkübasyonlar 3 saat ve 21 saat için% 20 DMEM'de idi. (I) Su buharlaşması sırasında zaman içinde deniz suyunun PSU'sundaki tuzluluk değerlerinin grafiksel gösterimi ve yüksek tuzluluklu deniz suyu temini kurtarma indüksiyon yöntemleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Gösterilen üç kurtarma indüksiyon prosedüründen elde edilen P. verrucosa poliplerinin görüntüleri. (A-C) Sırasıyla buharlaşma, tuzlu su temini ve kalsiyum içermeyen deniz suyu yöntemlerinden elde edilen poliplerin görüntüleri, iskeletten ayrıldıktan hemen sonra yakalandı. (D) Bir Petri kabında 6 hafta hayatta kaldıktan sonra buharlaşma yönteminden elde edilen bir mercan polipinin görüntüsü. (E) Petri kabında 8 hafta hayatta kaldıktan sonra tuzlu su temini yönteminden elde edilen bir mercan polipinin görüntüsü. (F) Bir hücre kültürü şişesinde 3 hafta hayatta kaldıktan sonra buharlaşma yönteminden elde edilen bir mercan polipinin görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.