Yöntem makalesi

Floresan Protein İşaretleyicileri ile Maya Organellerinin Görselleştirilmesi

3.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63846

⸱

20 Nisan 2022

 ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Metabolism & Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University

Bu makalede

Özet

Burada, tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae'nin canlı hücre görüntülemesinde bir dizi floresan protein bazlı organel markörünün kullanımını açıklıyoruz.

Özet

Tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae, organel işlevi ve dinamiği üzerinde çalışan klasik bir model sistemdir. Önceki çalışmalarımızda, çekirdek, endoplazmik retikulum (ER), Golgi aygıtı, endozomlar, vakuoller, mitokondri, peroksizomlar, lipid damlacıkları ve otofagozomlar dahil olmak üzere ana organeller ve endomembran yapılar için floresan protein bazlı belirteçler oluşturduk. Burada sunulan protokol, maya dönüşümü için DNA hazırlığı, transformantların seçimi ve değerlendirilmesi, floresan mikroskobik gözlem ve beklenen sonuçlar dahil olmak üzere bu belirteçlerin mayada kullanılmasına ilişkin prosedürleri açıklamaktadır. Metin, maya organeli çalışması alanına başka geçmişlerden giren araştırmacılara yöneliktir. Temel adımların yanı sıra mikroskop donanımı hususları ve birkaç yaygın tuzak hakkında teknik notlar ele alınmaktadır. İnsanların canlı hücre floresan mikroskobu ile maya hücre altı varlıklarını gözlemlemeleri için bir başlangıç noktası sağlar. Bu araçlar ve yöntemler, protein hücre altı lokalizasyonunu tanımlamak ve hızlandırılmış görüntülemede ilgilenilen organelleri izlemek için kullanılabilir.

Giriş

Zara bağlı organellere hücre altı bölümlere ayırma, ökaryotik hücrelerin organizasyonunda yaygın bir ilkedir. Her organel belirli işlevleri yerine getirir. Ökaryotik biyolojinin diğer birçok alanında olduğu gibi, tomurcuklanan maya, Saccharomyces cerevisiae, organel organizasyonu ve dinamiğinin temel ilkelerini aydınlatmada klasik bir model sistem olmuştur. Örnekler arasında protein salgılama yolu, peroksizomal protein ithalat yolu ve otofaji yolu 1,2,3'teki ufuk açıcı keşifler yer alır.

Tipik besin açısından zengin koşullarda, hızlı büyüyen maya hücreleri endoplazmik retikulum (ER), erken Golgi, geç Golgi/erken endozomlar, geç endozomlar, vakuoller ve mitokondri içerir. Bazı peroksizomlar, lipid damlacıkları ve otofagozomlar (ilk ikisinden bile daha az, esas olarak besin açısından zengin koşullarda bulunan Cvt vezikül tipinden4) de mevcuttur, ancak belirli kültür koşullarında (lipid açısından zengin ortam, açlık ortamı, vb.) Diğer yaygın ökaryotik modellerle karşılaştırıldığında, maya hücreleri oldukça küçüktür; Tipik bir maya hücresinin çapı, çoğu hayvan ve bitki hücresi için onlarca mikrometreye kıyasla yaklaşık 5 μm'dir. Sonuç olarak, normalde tek bir yapışık hayvan hücresi içeren aynı görüntüleme alanında, normalde çeşitli hücre döngüsü aşamalarında onlarca maya hücresi görülür. Boyut farkının yanı sıra, maya organel morfolojisinin de bazı kendine özgü özellikleri vardır. Ultrastrüktürel düzeyde, maya ER, diğer sistemlerde olduğu gibi tabaka ve tübüllerden oluşur. Floresan mikroskobu altında, maya ER, aralarında bazı birbirine bağlı yapılar bulunan iki halka olarak kendini gösterir. İç halka, nükleer zarf ile sürekli olan nükleer ER'dir ve dış halka, plazma zarının5 altında yatan boru şeklinde bir ağ olan periferik ER'dir. Bitki hücrelerine benzer, ancak hayvan hücrelerinden farklı olarak, melez bir organel olan geç Golgi/erken endozom, salgı yolu ile endositik yol 6,7 arasındaki kesişme noktasında yer alır. Morfolojik olarak, maya Golgi aygıtları sitoplazmada dağılır. Vakuoller fonksiyonel olarak hayvan hücrelerindeki lizozomlara benzer. Genellikle sitoplazmanın büyük bölümlerini işgal ederler ve sık sık fisyon ve füzyona uğrarlar. Floresan kolokalizasyon belirteçlerinin kullanılmasının yanı sıra, vakuolar membran nükleer ER'den en az iki kriter ile ayırt edilebilir: Vakuolar membran genellikle nükleer ER'den daha yuvarlaktır ve DIC'deki vakuolün içbükey görünümü de çekirdeğinkinden daha belirgindir.

Rutin olarak, canlı maya hücrelerinde yukarıda belirtilen organelleri görselleştirmek için bir dizi floresan protein bazlı işaretleyici kullanırız (Tablo 1). Bu organel belirteçlerinin aslına uygunluğu ve işlevselliği deneysel olarak doğrulanmıştır 7,8. Bu belirteç yapıları, floresan protein kimera kasetlerini maya genomuna sokmak için tasarlanmıştır. Aşağıda özetlendiği gibi, maya transformasyonuna hazırlık olarak, doğrusal DNA fragmanları ya enzimatik sindirim ya da PCR amplifikasyonu 7,8 ile üretilir. Doğrusal DNA parçaları, homolog rekombinasyon yoluyla genoma entegre edilir. Bu protokolde açıklanan plazmitler için üç tip tasarım kullanılır. Plazmitlerin çoğunu kapsayan ilk tipte, yapının birden fazla kopyasını taşıyan dönüştürücüler elde etmek genellikle mümkündür. Bu genellikle istenmeyen bir durumdur çünkü dönüştürücüler arasında ifadesel ve muhtemelen işlevsel farklılıklar sunar. Tek kopya transformantların, bu protokolde tarif edildiği gibi görüntüleme, immünoblotlama veya dikkatlice tasarlanmış PCR testleri yoluyla tanımlanması gerekir. GFP-Sed5, GFP-Pep12 ve GFP-Atg8'i kapsayan ikinci tipte, haploid maya hücrelerinde sadece tek kopya entegrasyonu üretilir. Hem birinci tip hem de ikinci tip, işaretleyici genin endojen kopyasını genomda bozulmadan tutar. Sec7-2GFP ve Vph1-2GFP'yi kapsayan üçüncü bir plazmit tasarımı tipinin, kimeraların karşılık gelen işaretleyici genin tek kopyası olmasına yol açan C-terminal knock-in'leri tanıtması amaçlanmıştır.

Burada, bu organel belirteçlerini kullanma prosedürünü açıklıyoruz, örnek mikroskopi görüntüleri sağlıyoruz ve maya organel görüntülemeye yeni başlayan araştırmacılara yönelik önlemleri tartışıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Maya suşu yapısı

  1. İşaretleyici plazmitler ve uygun bir maya suşu elde edin.
    NOT: Plazmitler Addgene'den temin edilebilir. Bu protokol örnek olarak TN124 (MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741(MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) ve DJ03 (BY4741 trp1Δ::MET15) kullanır. Bilimsel sorunun doğası dışında, gerinim seçimi için önemli bir husus, seçim belirteçlerinin uyumluluğudur. Burada açıklanan organel işaretleyici plazmitleri, seçim belirteçleri olarak URA3 ve TRP1'i kullanır. Bu nedenle, alıcı suşun genotipinin ura3 ve trp1 olması gerekir. Aksi takdirde, suşu veya plazmitleri değiştirmek gerekir.
  2. Maya ortamını aşağıdaki tariflere göre hazırlayın.
    NOT: SMD (sentetik minimal dekstroz; %2 glikoz, amino asit içermeyen %0.67 maya azot bazı (YNB), 30 mg/L adenin, 30 mg/L lizin, 30 mg/L metiyonin, 20 mg/L histidin, 20 mg/L urasil, 50 mg/L triptofan, 50 mg/L lösin). SMD + CA (% 0.5 kasamino asit ilavesi ile SMD). YPD (Maya özütü pepton dekstroz; %1 maya özütü, %2 pepton, %2 glikoz). SD-N (azot içermeyen sentetik dekstroz; amino asit ve amonyum sülfat içermeyen %0.17 YLB, %2 glikoz). Ortam seçimiyle ilgili düşünceler için lütfen Tartışma bölümüne bakın.
  3. Dönüşüm adımından önce, bir organel işaretleyici plazmidinin enzimatik sindirimi veya PCR amplifikasyonu ile doğrusallaştırılmış DNA fragmanları oluşturun.
    NOT: Tablo 1 , organel işaretleyici plazmitlerinden doğrusal fragmanlar oluşturmak için kısıtlama enzim bölgelerini ve PCR primerlerini listeler.
  4. Sıvı YPD ortamında maya hücrelerini kültürleyin ve mayayı doğrusal DNA fragmanı ile dönüştürün.
    NOT: Maya dönüşümü, geleneksel LiAc bazlı yöntem9 veya tercih edilen diğer yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Transformasyon için uygun kontrollerin, özellikle plazmit veya plazmidden türetilmiş DNA içermeyen negatif bir kontrolün dahil edilmesi tavsiye edilir.
  5. Uygun bir seçim plakasında (örneğin, URA3 seçimi için SMD-Ura ortamı kullanın) 30 ° C'de 2-3 gün inkübe edin.
    NOT: Tek kolonilerin ortaya çıkması yaklaşık 2 gün sürer.
  6. Floresan kimera ekspresyonunu ve entegrasyon kopya numarasını doğrulamak için, seçim plakasından sekiz koloni seçin, yeni seçim plakalarına yeniden çizin ve 30 °C'de inkübe edin.

2. Floresan mikroskobu: genel prosedürler ve tek zaman noktası görüntüleme

  1. Kültür mayası hücreleri, SMD sıvı ortamda gece boyunca 30 ° C'de çalkalanarak bekletilir.
  2. Ertesi sabah, maya kültürünün optik yoğunluğunu bir spektrofotometre veya plaka okuyucuda 600 nm'de (bundan sonra OD600 olarak anılacaktır) ölçün.
    NOT: Mayanın aşılanması ile ilgili bazı uygulamalarla, genellikle bu aşamada tüm numunelerin OD600'ünün 2'den düşük olduğundan emin olunabilir. Daha yüksek biterse, bir sonraki adımda daha fazla seyreltilmesi ve maya hücrelerinin iyileşmesi için daha fazla zaman tanınması tavsiye edilir.
  3. Taze bir ortam kullanarak maya kültürünü yaklaşık 0.2 OD600'e seyreltin.
  4. OD600 yaklaşık 0.8-1.0'a ulaşana kadar kültürlemeye devam edin.
    NOT: Mayanın iki katına çıkma süresi yaklaşık 1.5-2 saattir.
  5. Düz bir yüzeye kağıt mendilin üzerine bir kapak camı koyun, kapak camının üst tarafına 5 μL 1 mg / mL concanavalin A yayın ve 5 dakika bekleyin (Şekil 1A)10.
    NOT: Bu hazırlık adımı önceden yapılabilir.
  6. 100 μL maya kültürünü kapak camının üst tarafına aktarın ve 5 dakika bekleyin.
  7. Kapak camını, maya hücreleri arasına sıkıştırılmış olarak destekleyici bir cam sürgü ile birleştirin; Ataşmanı sabitlemek için uygun kuvvetle bastırın.
    NOT: Doğru basıncı bulmak biraz pratik gerektirir, böylece maya hücreleri hareketsiz tek bir tabaka oluşturur ancak ezilmez (Şekil 1B). Bu adım sırasında sıvı ortam, alttaki kağıt mendil tarafından dışarı itilecek ve emilecektir.
  8. Numune slaytını mikroskop tablasına monte edin. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) veya faz kontrastı (PC) aydınlatması kullanarak bir maya hücresi yamasını bulun ve odaklanın.
    NOT: Hücreleri bulmak için floresan kullanmayın; aksi takdirde, veri toplanmadan önce sinyal ağartılabilir.
  9. Görüntü z yığınlarını toplamak için üç parametre kümesini manuel olarak yapılandırın: z kesiti, görüntüleme kanalları ve pozlama parametreleri.
    NOT: Bir ticari yazılımdaki parametre ayarlarının GUI örnekleri için Ek Şekil 1'e bakın. Tam görünüm, yazılım platformlarına göre farklılık gösterir, ancak seçenekler aşağı yukarı aynıdır.
    1. Z kesiti: 15 dilim için 0,5 μm'lik adımlarla dilimleri toplayın (7 μm derinliği kaplar, genellikle normal haploid maya hücreleri için yeterlidir).
    2. Görüntüleme kanalları: Hücre konturları ve gerektiğinde uygun floresan kanalları için DIC veya PC'yi seçin.
    3. Uyarma ışığı yoğunluğu ve maruz kalma süresi: Uyarma ışığı yoğunluğunu ve maruz kalma süresini örnek için uygun şekilde ayarlayın.
      NOT: Başlangıç noktası olarak, uyarma ışığı yoğunluğu için %100 ve maruz kalma süresi için 100 ms kullanın; Z-yığını toplamanın ilerlemesiyle fotoağartma belirgin hale gelirse veya sinyal kamera kayıt kapasitesini aşıyorsa (yani sinyal doygunluğu) ışık yoğunluğunu azaltın; Sinyal-gürültü oranı düşükse ışık yoğunluğunu artırın.
  10. Görüntüleme ayarlarını not edin ve karşılaştırılacak tüm örnekler için aynı ayarları kullanın.
    NOT: Veri toplama ve görüntü görselleştirme için "otomatik" ayarını kullanmayın. Ayarları bir laboratuvar notuna kaydetmek önemlidir, böylece aynı parametreler gelecekteki deneysel tekrarlarda yeniden uygulanabilir. Bazı mikroskop kontrol yazılımı uygulamaları, ayarları kaydetme ve yeniden uygulama yeteneğine sahiptir; Yine de, yazılım profilleri iş arkadaşları tarafından istemeden silinebileceğinden veya değiştirilebileceğinden, ayarların bağımsız olarak kaydedilmesi tavsiye edilir.
  11. Verileri 16 bit çok kanallı yığın biçiminde kaydedin.
    NOT: 8 bit RGB resimler (veya üç rengi de sayarsanız 24 bit) olarak kaydetmeyin. 8 bit formatın sınırlamaları için görüntü görselleştirme bölümüne (Bölüm 4) bakın.
  12. Bir sonraki görüntü yığını koleksiyonu için tamamen farklı bir alana gidin.
    NOT: Bitişik alanlarda foto ağartma ve fototoksisite yaşanmış olabilir. Sonuç olarak, bu alanlardan toplanan görüntü yığını yanıltıcı olabilir.

3. Hızlandırılmış görüntüleme

NOT: Hızlandırılmış görüntüleme prosedürü, tek zaman noktası görüntüleme prosedüründen iki alanda farklılık gösterir: numune hazırlama ve görüntüleme parametreleri.

  1. Numune hazırlama
    1. 35 mm'lik cam tabanlı bir tabağı 1 mg / mL concanavalin A ile kaplayın ve 5 dakika veya daha fazla bekleyin.
    2. Tabağa 1.5 mL maya sıvı kültürü ekleyin ve maya hücrelerinin cam yüzeye çökmesi için 5 dakika bekleyin.
    3. Bir pipet kullanarak, sıvı ortamı tabağın kenarından aspire edin, ardından güvenli olmayan bir şekilde bağlanmış hücreleri çıkarmak için maya tortusu yamasını yaklaşık 1 mL taze ortamla nazikçe durulayın.
    4. Durulamayı 2-3 kez tekrarlayın. Bir pipet ile aspire edin, ardından yavaşça 2 mL taze kültür ortamı ekleyin.
  2. Görüntüleme parametreleri
    1. Z-kesiti: 15 dilim için dilimleri 0,5 μm'lik adımlarla toplayın.
    2. Görüntüleme kanalları: Gerektiği gibi seçin.
    3. Uyarma ışığı yoğunluğu ve maruz kalma süresi: İncelenen hücre altı yapıyı ayırt etmek için gereken minimum değeri kullanın.
      NOT: Hızlandırılmış görüntüleme için, tekrarlanan aydınlatmadan kaynaklanan foto ağartma ve fototoksisite, toplanabilecek toplam zaman noktası sayısını sınırlar. Bu nedenle, uyarma yoğunluğu ve maruz kalma süresi genellikle düşük değerlere ayarlanır, böylece daha fazla zaman noktası görüntülenebilir.
    4. Görüntüleme aralığı: İncelenmekte olan biyolojik süreç için uygun zamanlama aralıklarını ayarlayın.
      NOT: Örneğin, açlık koşullarında bir otofagozomun oluşumu yaklaşık 5-10 dakika sürer; Dinamiklerini izlemek için 1 dakika veya daha kısa bir aralık tercih edilir. Besin açısından zengin koşullar altında, maya hücresi döngüsü saat ölçeğinde gerçekleşir; 10-20 dk gibi daha uzun bir aralık kullanılabilir.
  3. Uygun donanım mevcutsa, yemek sıcaklığını 30 °C'de tutun.
    NOT: Maya hücrelerindeki çoğu biyolojik süreç, genel olarak daha yavaş bir hız dışında, oda sıcaklığında (RT) da görüntülenebilir.

4. Görüntü yığınlarının görselleştirilmesi ve entegrasyon kopya numarasının değerlendirilmesi

  1. Görüntü görselleştirme ve analizi için Fiji veya ImageJ yazılımını yükleyin11,12.
    NOT: Fiji, genel amaçlı biyolojik görüntü verilerinin görselleştirilmesi ve işlenmesi için uygun, ImageJ tabanlı bir araç koleksiyonudur. Bu protokolde listelenen görüntü işleme için, ek eklentiler olmadan ImageJ yeterlidir.
  2. Görüntü görüntüleme ve karşılaştırma için uygun parametreleri seçin.
    1. Fiji'de birkaç z-stack görüntüsü açın.
    2. Her yığındaki z konumunu orta bölüme (veya incelenen yapı orada daha iyi görselleştiriliyorsa diğer konumlara) sürükleyin.
    3. Görüntü > Parlaklığı/Kontrastı Ayarla > gidin ve Sıfırla'ya tıklayın.
    4. Parlaklık/Kontrast (B&C) penceresinde, incelenen yapıyı net bir şekilde ayırt etmek için Minimum ve Maksimum değerler olmak üzere iki parametreyi değiştirmek için kaydırma çubuklarını kullanın.
      NOT: Genel olarak, Minimum değeri boş alanlarda ortalama değere yakın olacak şekilde ayarlanır ve Maksimum değeri görüntüdeki maksimum değere yakın olacak şekilde ayarlanır. Bu değerler görüntülenen histogramdan çıkarılabilir (Şekil 2A). Görüntüleme iş istasyonu renk kalibrasyonluysa, daha fazla arka plan sinyalini gizlemek için minimum değer biraz daha yükseğe ayarlanabilir.
    5. Brightness / Contrast (B&C) penceresinde, Set'e tıklayın ve açılır pencerede Set Display Range (Ekran Aralığını Ayarla) seçeneğiyle Proparate all other Open Images (Diğer Tüm Açık Görüntülere Yay) onay kutusunu seçin.
      NOT: Bu işlem, görüntülerin çapraz karşılaştırılabilmesi için açılan tüm görüntülere aynı parlaklık/kontrast ayarlarını (minimum ve maksimum değerler dahil) uygular.
    6. Farklı görüntülere bakın ve her birindeki z yığınında gezinin. Görüntüler uygun bir koyu arka plan ve biraz abartılı doygunluklarla iyi görünüyorsa, Minimum ve Maksimum ayarları not edin.
  3. Çok kanallı görüntüler için, her kanal için görüntü görüntüleme ayarlarını seçin:
    1. Görüntü > Renkli > Kanallar Aracı'na gidin, açılır pencerede Gri tonlama modunu seçin Kanallar.
    2. Her kanalı gözden geçirin, o kanal için uygun Parlaklık/Kontrastı seçin ve ayarları not edin.
    3. Parlaklık/Kontrast ayarlandıktan sonra, Kanallar penceresine geri dönün ve birden çok kanalın aynı anda görselleştirilmesi için Bileşik moda geçin.
      NOT: Her kanal için sahte renk, kişisel tercihe uyacak şekilde Kanallar'da manuel olarak değiştirilebilir. Onay kutuları, belirli kanalları göstermek/gizlemek içindir.
  4. Gerekirse, belirli kanalları göstermek veya gizlemek için Kanallar penceresindeki onay kutularını kullanın.
  5. İsterseniz, Görüntü > Yığınları > Z Projesi'ne giderek yığın projeksiyonları oluşturun.
    NOT: Çeşitli projeksiyon modları mevcuttur. Maksimum yoğunluk, hızlı değerlendirme için iyi bir seçimdir. Niceleme için belirli bir projeksiyon modunun mu yoksa tek tek dilimlerin mi kullanılması gerektiğini belirlemek için araştırmanın doğası göz önünde bulundurulmalıdır. Projeksiyon, odak dışı ışığın girişimini azaltmak için belirli z dilimleriyle de sınırlandırılabilir.
  6. Tek kopya tümleştirme dönüştürücüleri için ekran.
    1. Açılan tüm görüntülere aynı Parlaklık/Kontrast ayarları uygulandıktan sonra, plazmit entegrasyon numarasını çıkarmak için numuneler arasındaki görüntü yoğunluklarını karşılaştırın.
      NOT: Görüntüler, sıvı bir ortamda gece boyunca kültürlemeden başlayarak, tek zaman noktası görüntüleme için genel prosedür izlenerek elde edilmelidir. Çoklu kopya entegrasyonları (örnekler için Şekil 2B'deki koloni 2 ve 3'e bakınız) tek kopya olanlardan ( Şekil 2B'deki koloni 1) önemli ölçüde daha parlak görünür. Buna karşılık, tek kopya olanlar birbirine benzer (Şekil 2B).
    2. Aynı Parlaklık/Kontrast ayarlarını kullandığınızdan emin olarak her gerinim için sekiz dönüştürücüden gelen görüntüleri inceleyin.
    3. Sonraki çalışma için üç veya daha fazla tek kopya dönüştürücüyü yeniden çizin ve kaydedin.
  7. Görüntüleri sunum için dışa aktarın.
    1. İlgilendiğiniz görüntünün bir kopyasını oluşturmak için Görüntü > Çoğalt'a gidin ve ona tercih edilen bir ad verin.
    2. Yinelenen kopyayı 8 bit> ten 16 bit'e dönüştürmek ve gerektiği gibi kaydetmek için Görüntü > Türüne gidin ve gerektiği gibi kaydedin.
      NOT: Bu işlem uygulandıktan sonra, Parlaklık/Kontrast ayarları daha önce yazılmamışsa, bu bilgileri almanın kolay bir yolu olmadığını ve dolayısıyla sonraki görüntü görselleştirmelerinde aynı ayarı yeniden uygulamanın kolay bir yolu olmadığını unutmayın. Bu aynı zamanda önceki çoğaltma işleminin önerilmesinin nedenidir.
    3. Bir z yığınını tek tek görüntülerden oluşan bir koleksiyona bölmek için Görüntü > Yığınları > Görüntülere Yığınla'ya gidin ve gerektiği gibi kaydedin.
      NOT: Görüntüler Fiji'de daha küçük bir alana da kırpılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Organel morfolojisi ve dinamiği, maya hücreleri dış ve iç sinyallere yanıt verdikçe değişebilir. Burada, orta log fazındaki maya organellerinin temsili görüntülerini sunuyoruz (Şekil 3A,B). Daha önce de belirtildiği gibi, birkaç organelin kendine özgü morfolojik özellikleri vardır, bu nedenle diğer organel belirteçleri ile kapsamlı bir karşılaştırma yapmadan tanınması kolaydır. Bunlara ER, mitokondri ve vakuoller dahildir. Burada gösterdiklerimiz de dahil olmak üzere bazı la...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, görüntüleme mayası organellerini keşfetmek için diğer araştırma alanlarından giren kişiler için basit bir başlangıç sağlar. Belli konulara geçmeden önce, görüntüleme yazılımlarında otomatik özelliklerin aşırı kullanımından kaçınılması gerektiğini bir kez daha vurgulamak isteriz. Mikroskopi görüntüleri sadece güzel resimler değil, aynı zamanda bilimsel verilerdir ve bu nedenle elde edilmeleri ve yorumlanmaları buna göre ele alınmalıdır. Görüntü toplama parametre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

Yazarlar, el yazması hazırlamadaki cömert yardımları için Xie laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe 91957104), Şanghay Belediye Eğitim Komisyonu (hibe 2017-01-07-00-02-E00035) ve Şanghay Belediye Bilim ve Teknoloji Komisyonu (hibe 22ZR1433800) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AdeninSangon BiyoteknolojiA600013
CasaminoacidSangon BiotechA603060
Canavalia ensiformis'ten (Jack bean) Concanavalin A,Sigma AldrichL7647
D-GlikozSangon BiotechA501991
Fijihttps://fiji.sc/
Cam tabanlı petri kabıNEST706001& Phi; 35 mm
ImajeJhttps://imagej.net/
Ters floresan mikroskobuOlympusIX83, UPLXAPO 100X yağa daldırma objektifi, Lumencor Spectra X ışık kaynağı ve Hamamatsu Orca Flash4.0 LT kamera ile donatılmıştır.
L-histidinSangon BiyoteknolojiA604351
L-LösinSangon BiyoteknolojiA100811
L-LizinSangon BiyoteknolojiA602759
L-MetioninSangon BiyoteknolojiA100801
L-TriptofanSangon BiyoteknolojiA601911
Mikroskop kapak camıCITOTEST10222222C22 mm x 22 mm, 0,16 inç; 0,19 mm
Mikroskop slaytlarıCITOTEST1A510125 mm x 75 mm, 1– 1,2 mm
PeptonSangon BiotechA505247
UrasilSangon BiotechA610564
VisiviewVisitron System GmbHhttps://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html
Maya özüSangon BiotechA100850
Amino asitsiz maya azot bazıSangon BiotechA610507
Amino asit ve amonyum sülfat içermeyen YNBSangon BiotechA600505

Kaynaklar

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Autophagy wins the 2016 Nobel prize in physiology or medicine: Breakthroughs in baker's yeast fuel advances in biomedical research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 201-205 (2017).
  2. Spang, A. Anniversary of the discovery of sec mutants by Novick and Schekman. Molecular Biology of the Cell. 26 (10), 1783-1785 (2015).
  3. Walter, T., Erdmann, R. Current advances in protein import into peroxisomes. The Protein Journal. 38 (3), 351-362 (2019).
  4. Farre, J. C., Subramani, S. Mechanistic insights into selective autophagy pathways: lessons from yeast. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (9), 537-552 (2016).
  5. West, M., Zurek, N., Hoenger, A., Voeltz, G. K. A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. Journal of Cell Biology. 193 (2), 333-346 (2011).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Zhu, J., et al. A validated set of fluorescent-protein-based markers for major organelles in yeast (Saccharomyces cerevisiae). mBio. 10 (5), 19(2019).
  8. Li, D., et al. A fluorescent tool set for yeast Atg proteins. Autophagy. 11 (6), 954-960 (2015).
  9. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods in Molecular Biology. 313, Clifton, N.J. 107-120 (2006).
  10. Caloca, B., et al. Comparison of concanavalin A and poly-l-lysine as cell adhesives for routine yeast microscopy applications. Yeast. , (2021).
  11. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Banfield, D. K., Lewis, M. J., Pelham, H. R. B. A SNARE-like protein required for traffic through the Golgi complex. Nature (London). 375 (6534), 806-809 (1995).
  14. Curran, B. P., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1163, Clifton, N.J. 1-14 (2014).
  15. Zhao, W., et al. Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. , (2021).
  16. He, C. W., et al. Membrane recruitment of Atg8 by Hfl1 facilitates turnover of vacuolar membrane proteins in yeast cells approaching stationary phase. BMC Biology. 19 (1), 117(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Saccharomyces cerevisiaeOrganel Dinami iCanl H cre MikroskopisiMaya TransformasyonuH cre Alt LokalizasyonZaman Atlamal G r nt lemeOrganel TakibiFloresan Mikroskopi
Video yakında

İlgili makaleler