Method Article

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak bakteri üreme verilerinin yüksek verimli nicelleştirilmesinin gelişmiş tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti

DOI:

10.3791/63849

⸱

July 27th, 2022

 ,  ,  , 
1Chemical and Biological Engineering Department, University of British Columbia, 2Process Engineering and Applied Science, Dalhousie University, 3Food Science and Technology, Dalhousie University, 4Center for Water Resources Studies, Civil and Resource Engineering, Dalhousie University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, büyüme eğrileri, büyüme oranı ve maksimum büyüme oranı dahil olmak üzere büyüme verilerini ölçmek için yüksek verimli bir protokol sunulmaktadır. Protokol, iki biyofilm üreten bakteri kullanılarak doğrulandı ve onaylandı. Bu çalışmada uygulanan sonuçlar ve yaklaşım, mikroplaka okuyucular kullanılarak diğer yüksek verimli protokollere genişletilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, 96 oyuklu plakalarda bakteri üremesini izlemek ve maksimum büyüme oranını analiz etmek için tekrarlanabilir, güvenilir, yüksek verimli bir protokol geliştirmeyi amaçladı. İki bakteri türünün büyüme eğrileri ve maksimum büyüme hızları belirlendi. (i) kapak yoğunlaşması, (ii) yol uzunluğu düzeltmesi, (iii) aşılama boyutu, (iv) örnekleme zaman aralığı ve (v) uzamsal yanlılık gibi konular araştırıldı. Protokolün tekrarlanabilirliği, çalıştırmalar arasında 0,03'lük bir standart sapma ile üç bağımsız teknik çoğaltma ile değerlendirildi. Bacillus mycoides ve Paenibacillus tundrae'nin maksimum büyüme oranları (ortalama ± SD) sırasıyla 0.99 h-1 ± 0.03 h-1 ve 0.85 h-1 ± 0.025 h-1 olarak belirlenmiştir. Bu bakterilerin bir araya toplanma afiniteleri nedeniyle optik olarak izlenmesi daha zordur. Bu çalışma, mikroplaka okuyucular hakkında güvenilir, doğru ve tekrarlanabilir veriler elde etmek için aşılama boyutunun, yol uzunluğu düzeltmesinin, kapak ısınmasının, örnekleme zaman aralıklarının ve kuyu plakası uzamsal yanlılığının kritik önemini göstermektedir. Geliştirilen protokol ve doğrulama adımları, mikroplaka okuyucular ve yüksek verimli protokoller kullanılarak diğer yöntemlere genişletilebilir ve bu da araştırmacıların doğuştan gelen hatalarını ve malzeme maliyetlerini azaltır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterilerin mekanizması ve metabolik çalışmaları da dahil olmak üzere multi-omik manipülasyona ilginin artması, büyüme verilerinin kaydedilmesi gibi yüksek verimli ve otomatik yöntemlerin önemini vurgulamaktadır 1,2. Maksimum büyüme oranları gibi kinetik parametreleri içeren büyüme verileri, bakterilerin farklı fiziksel, kimyasal ve antibakteriyel koşullara verdiği tepkileri karakterize etmeye yardımcı olabilir. Büyüme hızı verileri, potansiyel genotip-fenotip bağlantılarını1 ortaya çıkarmak veya gıda ürünlerinin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokoldeki tüm adımlar steril koşullarda (yani iki alev veya bir biyogüvenlik kabini arasında) izlenmelidir. Tüm malzemeler ve aletler 20 dakika boyunca otoklavlanır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın. Eldivenli eller dezenfekte edilir, el dezenfektanı veya p alkol solüsyonu ile en az 1 dakika ıslak tutulur ve daha sonra güvenlik kabininden çıkarılmaz. Aksi takdirde, eller güvenlik kabinine tekrar sokulmadan önce dezenfeksiyon prosedürü tekrarlanmalıdır. DİKKAT: Açık alev kullanmadan önce dezenfektanın tamamen buharlaştığından emin olun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OD okuma doğrulaması ve yol uzunluğu düzeltme faktörü
B. mycoides kültürünün bölünmüş örnekleri farklı zaman noktalarında alındı ve mikroplaka okuyucu ve spektrofotometre kullanılarak ölçüldü (Şekil 1A). Bu adım, sonuçları farklı cihazlarda doğrulamak için atıldı. OD600 verileri korelasyon gösterdi ancak eşleşmedi (Şekil 1B

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroplaka okuyucular, tutarlı ve tekrarlanabilir büyüme oranları elde edilmesini sağlar. Bu teknoloji, insan hatasını en aza indirir ve yüksek verimli örneklemeye olanak tanır. Numune başına gereken az miktarda kültür, bu yaklaşımı şişeler veya test tüpleri kullanan hücre sayımlarına çekici, düşük maliyetli bir alternatif haline getirir. Mikroplaka okuyucular, büyük bir örneklem boyutuna izin verir, istatistiksel gücü artırır ve ardından maliyetleri ve işçiliği düşük tutarken güvenilir .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) / Halifax Su Kalitesi ve Arıtımı Sanayi Araştırma Kürsüsü (Hibe No. IRCPJ 349838-16). Yazarlar ekibi ayrıca bu makaleyi gözden geçirirken Anita Taylor'ın yardımına teşekkür etmek ister.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Santrifüj Eppendorf5810 R
Santrifüj tüpleri - 15 mL ThermoFisher- Bilimsel 339650Steril
Santrifüj tüpleri - 50 mL ThermoFisher- Bilimsel 339652
Steril Tek Kullanımlık aşılama döngüsü, 10 & LCole-Parmer UZ-06231-08Steril
Erlenmeyer şişeleri - 250 mL Cole-Parmer   UZ-34502-59Cam 
İzopropanol ThermoFisher- Bilimsel 396982500ve ge; 99.0
Fosfat Tampon Tuzlu Sağ Sigma-AldrichP4417
Pipet uçları 1.000 ve mikro; LThermoFisher- Bilimsel   UZ-25001-76
Pipet uçları 10 mL ThermoFisher- Bilimsel UZ-25001-83
Pipet uçları 200 ve mikro; LThermoFisher- Bilimsel UZ-25001-85
Pipet uçları 5 mL ThermoFisher- Bilimsel   UZ-25001-80
Pipetleyici 1.000 ve mikro; LCole-Parmer UZ-07909-11
Pipetleyici 10 mLCole-Parmer UZ-07909-15
Pipetleyici 200 ve mikro; LCole-Parmer   UZ-07909-09
Pipetleyici 5 mL Cole-Parmer UZ-07859-30
Triptik Soya Suyu Millipore22091Mikrobiyoloji için uygun

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reuß, D. R., et al. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: Consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Research. 27 (2), 289-299 (2017).
  2. Sparkes, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial GrowthMicroplate ReaderHigh Throughput QuantificationGrowth Rate Analysis96 Well PlatesPathlength CorrectionInoculation SizeSampling IntervalSpatial BiasTechnical Replication
Video Coming Soon

Related Articles