Dizileme teknolojilerinin yaygın kullanımı nedeniyle sivrisineklerde çok sayıda yeni virüs benzeri sekans bulunmuştur. Omurgalı ve sivrisinek hücre hatlarını kullanarak virüsleri izole etmek ve büyütmek için etkili bir prosedür sunuyoruz; bu, sivrisinek kaynaklı ve sivrisineğe özgü virüsler de dahil olmak üzere sivrisinekle ilişkili virüsler üzerine gelecekteki çalışmaların temelini oluşturabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Dizileme teknolojilerinin geniş uygulamasıyla, sivrisinekler de dahil olmak üzere eklembacaklılarda birçok yeni virüs benzeri dizi keşfedilmiştir. Bu yeni sivrisinek ilişkili virüslerin iki ana kategorisi "sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV'ler)" ve "sivrisineğe özgü virüsler (MSV'ler)" dir. Bu yeni virüsler hem omurgalılar hem de sivrisinekler için patojenik olabilir veya sadece sivrisineklerle simbiyotik olabilirler. Varlık virüsleri, bu virüslerin biyolojik karakterlerini doğrulamak için gereklidir. Bu nedenle, burada virüs izolasyonu ve sahada toplanan sivrisineklerden amplifikasyon için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. İlk olarak, sivrisinek örnekleri sivrisinek homojenatlarının süpernatantları olarak hazırlandı. İki kez santrifüjlemeden sonra, süpernatanlar daha sonra virüs amplifikasyonu için sivrisinek hücre hattı C6/36 veya omurgalı hücre hattı BHK-21'e aşılandı. 7 gün sonra, süpernatantlar P1 süpernatantları olarak toplandı ve -80 ° C'de depolandı. Daha sonra, hücre durumu günlük olarak kontrol edilirken, P1 süpernatantları C6/36 veya BHK-21 hücrelerinde iki kez daha geçirildi. Hücreler üzerindeki sitopatojenik etki (CPE) keşfedildiğinde, bu süpernatanlar toplandı ve virüsleri tanımlamak için kullanıldı. Bu protokol, MBV'ler ve MSV'ler de dahil olmak üzere sivrisinek ile ilişkili virüsler hakkında gelecekteki araştırmaların temelini oluşturur.
Giriş
Sivrisinekler, önemli patojenik eklembacaklı vektörlerin bir grubudur. Culicidae 1,2 familyasında yaklaşık 3.500 sivrisinek türü vardır. Yüksek verimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesi, dünyanın farklı yerlerinden gelen sivrisineklerde birçok yeni, virüs benzeri dizinin keşfedilmesine yol açmıştır3. Genel olarak, bu sivrisinek ile ilişkili virüsler iki ana gruba ayrılabilir: MBV'ler ve MSV'ler.
MBV'ler, sarı humma virüsü (YFV), dang virüsü (DENV), Japon ensefalit virüsü (JEV), Batı Nil virüsü (WNV) ve Rift Vadisi ateş virüsü (RVFV)4 gibi birçok insan veya hayvan hastalığının etken maddeleri olan çeşitli virüslerden oluşan bir gruptur. Tüm dünyada hem insanlarda hem de hayvanlarda ciddi morbidite ve mortaliteye neden olarak halk sağlığını ciddi şekilde tehdit etmişlerdir. MBV'ler, enfekte bir sivrisinekten naif bir konakçıya, ayrıca virüs bulaşmış bir konakçıdan ve beslenen bir sivrisineğe bulaşma yoluyla çeşitli konakçılar arasında doğal olarak bir yaşam döngüsünü sürdürür5. Bu nedenle, bu virüsler laboratuar1'de hem sivrisinek hücre hatlarını hem de omurgalı hücre hatlarını enfekte edebilir.
Yichang virüsü (YCN), Culex flavivirüsü (CxFV) ve Chaoyang virüsü (CHAOV) içeren MSV'ler, böceklere özgü virüslerin bir alt grubudur 1,6,7. Son yıllarda, yeni MSV'lerin keşfinde bir artış olmuştur ve bu MSV'lerin bazılarının MBV'lerin iletimi üzerinde bir etkisi olduğu bulunmuştur. Örneğin, Culex pipiens'te kalıcı bir enfeksiyon olabilen CxFV, WNV replikasyonunu erken bir aşama8'de baskılayabilir. Başka bir böceğe özgü flavivirüs, hücre kaynaştırıcı ajan virüsü (CFAV), Aedes aegypti sivrisineklerinde DENV ve Zika virüsünün (ZIKV) yayılmasını inhibe ettiği bulunmuştur9. Bu nedenle, bu protokol sivrisinek ile ilişkili virüsleri izole etmek için yararlı bir yaklaşımdır ve sivrisineklerle ilgili patojenlerin dağılımı ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların kontrolü konusunda daha fazla araştırmada yardımcı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Sivrisinek örnekleme ve sıralama
- Yetişkin sivrisinekleri ışık tuzakları MXA-02 veya sahadaki karbondioksit sivrisinek tuzaklarından yakalayın.
- Toplanan sivrisinekleri sıvı azot10,11'e batırarak öldürün. Soğuk zincir lojistik sistemi ile laboratuvara taşınması12.
NOT: Kuru buz öncelikle soğuk zincir lojistik sisteminde kullanılmıştır. - (İsteğe bağlı) Numune alanları laboratuvara yakınsa, ağ tuzaklarındaki canlı sivrisinekleri doğrudan laboratuvara gönderin ve 30 dakika boyunca ≤-20 ° C'de dondurarak ötenazi yapın4.
- Sivrisineklerin sınıflandırılması ve tanımlanması için araç kitabı13 aracılığıyla toplanan sivrisineklerin morfolojik bir tanımlamasını yapın.
NOT: Gerekirse, sivrisinekleri sınıflandırmak ve tanımlamak için DNA barkodlaması kullanılabilir14,15. - Örnekleme tarihlerine ve alanlarına bağlı olarak, bunları farklı havuzlara atayın ve ardından 2-5 mL tüplerde saklayın.
- Her tüpü sivrisinek türleri, sayısı, örnekleme kodu, tarihi ve yerleri ile kaydetmek için bir tablo çizin.
- Etiketleri örnekleme kodlarıyla yazdırın ve tüplere yapıştırın.
- Bir sonraki analize kadar sivrisinek numunelerinin bulunduğu tüpleri -80 ° C'de tutun.
2. Sivrisinek taşlama
- % 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi içeren 1,5 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamı içeren 3 mm seramik boncuklu her 2 mL steril tüpe 20-50 sivrisinek yerleştirin.
NOT: Tüpleri buz veya anice tepsisinde tutun. - Üç döngü16 için 4 °C'de 70 Hz'de 30 sn öğüterek sivrisinekleri düşük sıcaklıkta bir doku homojenizatörü ile homojenize edin.
- Karışımları 15.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantları yeni tüplere aktarın.
- Süpernatantları 15.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj ederek sivrisinek kalıntılarını12,17 olarak temizleyin.
NOT: Gerekirse, süpernatantlar 0,22 μm filtreler kullanılarak filtrelenebilir. - Süpernatantları (P0) 2 mL vidalı kapaklı depolama tüplerine (tüp başına 200 μL) alın ve -80 ° C'de saklayın.
3. Hücrelerin hazırlanması ve hücre kültürü bakım ortamı
NOT: Virüs amplifikasyonu ve izolasyonu için sivrisinek hücre hattı C6/36 (Aedes albopictus RNAi eksikliği) ve omurgalı hücre hattı BHK-21 (bebek hamster böbreği) kullanılmıştır.
- 1 × 106 C6/36 hücrelerini, %5 CO 2nemlendirilmiş inkübatörde 28 °C'de %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) ile desteklenmiş 10 mL RPMI ortamı ile 75cm2'lik bir şişeye aşılayın.
- 1 × 106 BHK-21 hücrelerini, %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 10 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) ile 75cm2'lik bir şişeye aşılayın.
NOT: Hücreler haftada iki veya üç kez17,18 kez geçirildi. - 75cm2'lik bir şişede (C6/36 veya BHK-21 hücreleri) kültürlenmiş hücreleri 24 delikli plakalara (kuyu başına C6/36: 1.4 × 105; Kuyu başına BHK-21: 0,8 × 105).
- 24 delikli plakaları gece boyunca 28 °C veya 37 °C'ye yerleştirin.
- Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve her bir kuyucuktaki hücre akıcılığının% 80 -% 90 olup olmadığını doğrulayın.
- Hücre kültürü bakım ortamını (500 mL) hazırlayın.
NOT: C6/36 için ortam,% 2 FBS ve% 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi ile desteklenmiş RPMI ortamıydı. BHK-21 için besiyer,% 2 FBS ve% 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi ile desteklenmiş DMEM besiyeriydi.
4. Virüs izolasyonu
NOT: Tüm adımlar biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Biyogüvenlik laboratuvarının güvenlik seviyesi gereksinimi, farklı ülke ve bölgelerin yönetmeliklerine dayanan biyogüvenlik risk değerlendirmesi ile belirlenmiştir. İşlem bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
- Hücre kültürü ortamını 24 delikli plakalardan çıkarın ve her bir kuyucuğa 100 μL hücre kültürü bakım ortamı ve 100 μL sivrisinek homojenatının (P0) süpernatantını ekleyin.
- Plakaları 28 ° C veya 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin ve hücre kurumasını önlemek için her 15 dakikada bir hafifçe sallayın.
- Süpernatantı çıkarın ve kalıntıları tamamen gidermek için her birini 600 μL hücre kültürü bakım ortamı ile nazikçe durulayın.
- Her bir oyuğa 800 μL hücre kültürü bakım ortamı ekleyin ve plakaları 7 gün boyunca 28 ° C veya 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
- Her bir kuyucuğun hücre durumunu mikroskop altında günlük15 izleyin.
- 7. günde hücrelerin süpernatantlarını (P1 süpernatantları) toplayın ve süpernatantları -80 ° C'de saklayın.
- P2 ve P3 süpernatantlarını almak için 4.1-4.6 2x arasındaki adımları yineleyin.
NOT: Adım 4.3'te, P2 ve P3 için her bir kuyucuğun 600 μL hücre kültürü bakım ortamı ile nazikçe durulanması isteğe bağlıydı. - Hangi kuyunun sitopatojenik etkiyi (CPE) gösterdiğine bağlı olarak - hücreler ölür, piknoz ve yüzeyden ayrılır; sinsiti oluşturmak için bitişik hücrelerle füzyon; veya nükleer veya sitoplazmik inklüzyon cisimlerinin ortaya çıkması - virüsleri büyük ölçüde büyütmek için hücreleri içeren yeni 6 delikli plakaların her bir kuyucuğuna (hücre akıntısı% 80-90 idi) bu CPE'nin süpernatantının 300-400 μL'sini ekleyin.
- Süpernatantları toplayın ve bunları 2 mL vidalı kapaklı depolama tüplerine (tüp başına 500 μL) ayırın. Bunları -80 °C'de saklayın.
NOT: Hücrelerde üç nesil ardışık geçişten sonra, CPE'yi indüklemeyen örnekler atıldı. Gerekirse, hücrelerde ardışık geçiş nesilleri arttırılabilir.
5. RT-PCR ile viral sekansların tespiti
- Bir viral RNA mini kiti16 kullanarak viral süpernatantın 200 μL'sinden toplam RNA'yı çıkarın.
NOT: Burada, cihaz üreticisinin talimatlarını izleyerek toplam RNA'yı çıkarmak için otomatik nükleik asit ekstraksiyon sistemi kullanılmıştır. - Bir PCR cihazı kullanarak RT-PCR kiti talimatlarını izleyerek RNA'yı cDNA'ya dönüştürün.
- PCR tüpüne 1 μL rastgele primer ile karıştırılmış 15 μL RNA ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 70 ° C'de yerleştirin ve ardından 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
- Tüpe 5 μL 5x tampon ve 25 μL karışım (10 mM dNTP, 40 U/μL RNaz inhibitörü ve 200 U/μL M-MLV) ekleyin ve tüpü 60 dakika boyunca 42 °C'de ve 10 dakika boyunca 95 °C'de yerleştirin.
- Tüpü -20 °C'de saklayın.
- PCR ile virüsleri tespit etmek için bir PCR kiti ve evrensel primerler (Tablo 1) kullanın.
- Arbovirüsler için, PCR reaksiyon sistemini (toplam 30 μL) aşağıdaki bileşenlerle kurun: 3 μL 10x Taq tamponu, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL ileri astar (10 μm), 1 μL ters astar (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U / μL), 19,7 μL ddH 2 O ve2μL cDNA.
- Flavivirüslerin tespiti için, reaksiyon sürecini şu şekilde ayarlayın: aşama 1: 30 s için 94 °C, 30 s için 52 °C ve 30 s için 72 °C'lik 35 döngü; 2. aşama: 10 dakika boyunca 72 ° C.
- Alfavirüslerin tespiti için, reaksiyon sürecini şu şekilde ayarlayın: aşama 1: 30 s için 94 °C, 30 s için 50 °C ve 30 s için 72 °C'lik 35 döngü; 2. aşama: 10 dakika boyunca 72 ° C.
- Bunyavirüslerin tespiti için, reaksiyon sürecini şu şekilde ayarlayın: aşama 1: 30 s için 94 °C, 30 s için 50 °C ve 30 s için 72 °C'lik 35 döngü; 2. aşama: 10 dakika boyunca 72 ° C.
- PCR amplifikasyon ürünlerini %1 agaroz jel elektroforezi ile tespit edin ve sekanslama analizine gönderin.
NOT: Koşullar izin verirse, süpernatantlar yeni virüsleri tanımlamak ve tüm viral genom sekeunceslerini elde etmek için yeni nesil dizileme analizine tabi tutulabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sivrisinek homojenatlarının süpernatantları (P0) ile aşılamadan sonra, C6/36 hücreleri geniş bir hücreler arası boşluk sergiledi ve pul pul dökülmüş hücreler 120 saatte (Şekil 1A) aynı anda aşılanmamış hücrelere (kontrol) kıyasla gözlendi (Şekil 1B). BHK-21 hücrelerini P3 süpernatantları ile inkübe ettikten sonra, BHK-21 hücrelerinde kontrol hücrelerinin aksine 48 saatte (Şekil 1C) görünür CPE gözlendi (Şekil 1D...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yöntemin amacı, çeşitli hücre hatlarını kullanarak sivrisinek ile ilişkili virüsleri izole etmek için pratik bir yol sunmaktı. Bakteri veya mantarların kontaminasyonunu önlemek için sivrisinek homojenatlarının süpernatantlarına Antibiyotik-Antimikotik (Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin) eklemek çok önemlidir. Sahada elde edilen sivrisinekler ve viral süpernatantlar, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için -80 ° C'de soğutulmalıdır.
Protokoldeki bir diğer kritik adım da taşlamayd...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Wuhan Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2018201261638501) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 ve mikro; m membran filtre | Millipore SLGP033RB | Belirli gözenek derecelerine sahip polimer filmler. Hücre kalıntılarını ve bakterileri temizlemek için. | |
| 24 oyuklu plakalar | CORNING | 3524 | 75 |
| cm2 şişeleri | CORNING | 430641 | |
| mm seramik boncuklu | |||
| Antibiyotik-Antimikotik | Gibco | 15240-062 | Bakteri ve mantarlardan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için ortamda antibiyotik |
| Otomatik nükleik asit ekstraksiyon sistemi | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 hücreleri | Ulusal Virüs Kaynak Merkezi, Wuhan Viroloji | ||
| C6/36 hücreleri | Ulusal Virüs Kaynak Merkezi, Wuhan Viroloji | ||
| Santrifüj makinesi | Himac | CF16RN | Sivrisinek örneklerinin santrifüjlenmesi için alet |
| CO2 | |||
| Dulbecco' s minimal esansiyel ortam (DMEM) | Omurgalı hücre hatları için | Gibco | C11995500BT |
| Ebinur Gölü virüsü | Cu20-XJ izolasyonu | ||
| Beyaz Sığır Serumu (FBS) | Gibco | 10099141C | Hücreler için besin sağlar |
| yüksek hızlı düşük sıcaklıkta doku homojenizatör | hizmetibio | KZ-III-F | Öğütme aleti |
| Kuluçka makinesi (28 & derece; C) | Hücre kültürü | Panasonic | MCO-18AC |
| (37 &°; C) | Panasonic | MCO-18AC | Hücre kültürü için cihaz |
| PCR tüpü | |||
| penisilin-streptomisin | Gibco | 15410-122 | Bakterilerden kontaminasyonu önlemek için ortamda antibiyotik |
| Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi | Gibco | 15240096 | |
| Buzdolabı (-80 > C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute & nbsp; orta (RPMI) | Gibco | C11875500BT | mosiquto hücre hatları için orta |
| Vidalı kapaklı depolama tüpleri (2 mL) | biofil | ve nbsp; | |
| steril havaneli | Tiangen | OSE-Y004 | Taşlama için sarf malzemeleri |
| TGrinder OSE-Y30 elektrikli doku öğütücü | Tiangen | OSE-Y30 | Taşlama aleti |
| Diseksiyon mikroskobu | ZEISS | stemi508 | |
| ışık tuzakları MXA-02 | Maxttrac | ||
| Sivrisinek emici makine | Ningbo Bangning | ||
| Pipet uçları | Axygen | TF | |
| QIAamp viral RNA mini kiti | QIAGEN | 52906 | |
| Cımbız | Dumont | 0203-5-PO |
Kaynaklar
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342(2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079(2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265(2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873(2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30(2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555(2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640(2020).
- Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298(2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963(1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645(2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
