Dizileme teknolojilerinin yaygın kullanımı nedeniyle sivrisineklerde çok sayıda yeni virüs benzeri sekans bulunmuştur. Omurgalı ve sivrisinek hücre hatlarını kullanarak virüsleri izole etmek ve büyütmek için etkili bir prosedür sunuyoruz; bu, sivrisinek kaynaklı ve sivrisineğe özgü virüsler de dahil olmak üzere sivrisinekle ilişkili virüsler üzerine gelecekteki çalışmaların temelini oluşturabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Dizileme teknolojilerinin geniş uygulamasıyla, sivrisinekler de dahil olmak üzere eklembacaklılarda birçok yeni virüs benzeri dizi keşfedilmiştir. Bu yeni sivrisinek ilişkili virüslerin iki ana kategorisi "sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV'ler)" ve "sivrisineğe özgü virüsler (MSV'ler)" dir. Bu yeni virüsler hem omurgalılar hem de sivrisinekler için patojenik olabilir veya sadece sivrisineklerle simbiyotik olabilirler. Varlık virüsleri, bu virüslerin biyolojik karakterlerini doğrulamak için gereklidir. Bu nedenle, burada virüs izolasyonu ve sahada toplanan sivrisineklerden amplifikasyon için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. İlk olarak, sivrisinek örnekleri sivrisinek homojenatlarının süpernatantları olarak hazırlandı. İki kez santrifüjlemeden sonra, süpernatanlar daha sonra virüs amplifikasyonu için sivrisinek hücre hattı C6/36 veya omurgalı hücre hattı BHK-21'e aşılandı. 7 gün sonra, süpernatantlar P1 süpernatantları olarak toplandı ve -80 ° C'de depolandı. Daha sonra, hücre durumu günlük olarak kontrol edilirken, P1 süpernatantları C6/36 veya BHK-21 hücrelerinde iki kez daha geçirildi. Hücreler üzerindeki sitopatojenik etki (CPE) keşfedildiğinde, bu süpernatanlar toplandı ve virüsleri tanımlamak için kullanıldı. Bu protokol, MBV'ler ve MSV'ler de dahil olmak üzere sivrisinek ile ilişkili virüsler hakkında gelecekteki araştırmaların temelini oluşturur.
Giriş
Sivrisinekler, önemli patojenik eklembacaklı vektörlerin bir grubudur. Culicidae 1,2 familyasında yaklaşık 3.500 sivrisinek türü vardır. Yüksek verimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesi, dünyanın farklı yerlerinden gelen sivrisineklerde birçok yeni, virüs benzeri dizinin keşfedilmesine yol açmıştır3. Genel olarak, bu sivrisinek ile ilişkili virüsler iki ana gruba ayrılabilir: MBV'ler ve MSV'ler.
MBV'ler, sarı humma virüsü (YFV), dang virüsü (DENV), Japon ensefalit virüsü (JEV), Batı Nil virüsü (WNV) ve Rift Vadisi ateş virüsü (RVFV)4<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Sivrisinek örnekleme ve sıralama
- Yetişkin sivrisinekleri ışık tuzakları MXA-02 veya sahadaki karbondioksit sivrisinek tuzaklarından yakalayın.
- Toplanan sivrisinekleri sıvı azot10,11'e batırarak öldürün. Soğuk zincir lojistik sistemi ile laboratuvara taşınması12.
NOT: Kuru buz öncelikle soğuk zincir lojistik sisteminde kullanılmıştır. - (İsteğe bağlı) Numune alanları laboratuvara yakınsa, ağ tuzaklarındaki canlı sivrisinekleri doğrudan laboratuvara gönderin ve 30 dakika boyunca ≤-20 ° C'de dondurarak ötenazi yapın4
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sivrisinek homojenatlarının süpernatantları (P0) ile aşılamadan sonra, C6/36 hücreleri geniş bir hücreler arası boşluk sergiledi ve pul pul dökülmüş hücreler 120 saatte (Şekil 1A) aynı anda aşılanmamış hücrelere (kontrol) kıyasla gözlendi (Şekil 1B). BHK-21 hücrelerini P3 süpernatantları ile inkübe ettikten sonra, BHK-21 hücrelerinde kontrol hücrelerinin aksine 48 saatte (Şekil 1C) görünür CPE gözlendi (Şekil 1D.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yöntemin amacı, çeşitli hücre hatlarını kullanarak sivrisinek ile ilişkili virüsleri izole etmek için pratik bir yol sunmaktı. Bakteri veya mantarların kontaminasyonunu önlemek için sivrisinek homojenatlarının süpernatantlarına Antibiyotik-Antimikotik (Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin) eklemek çok önemlidir. Sahada elde edilen sivrisinekler ve viral süpernatantlar, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için -80 ° C'de soğutulmalıdır.
Protokoldeki bir diğer kritik adım da taşlamayd.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Wuhan Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (2018201261638501) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.22 ve mikro; m membran filtre | Millipore SLGP033RB | Belirli gözenek derecelerine sahip polimer filmler. Hücre kalıntılarını ve bakterileri temizlemek için. | |
| 24 oyuklu plakalar | CORNING | 3524 | 75 |
| cm2 şişeleri | CORNING | 430641 | |
| mm seramik boncuklu | |||
| Antibiyotik-Antimikotik | Gibco | 15240-062 | Bakteri ve mantarlardan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için ortamda antibiyotik |
| Otomatik nükleik asit ekstraksiyon sistemi | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 hücreleri | Ulusal Virüs Kaynak Merkezi, Wuhan Viroloji | ||
| C6/36 hücreleri | Ulusal Virüs Kaynak Merkezi, Wuhan Viroloji | ||
| Santrifüj makinesi | Himac | CF16RN | Sivrisinek örneklerinin santrifüjlenmesi için alet |
| CO2 | |||
| Dulbecco' s minimal esansiyel ortam (DMEM) | Omurgalı hücre hatları için | Gibco | C11995500BT |
| Ebinur Gölü virüsü | Cu20-XJ izolasyonu | ||
| Beyaz Sığır Serumu (FBS) | Gibco | 10099141C | Hücreler için besin sağlar |
| yüksek hızlı düşük sıcaklıkta doku homojenizatör | hizmetibio | KZ-III-F | Öğütme aleti |
| Kuluçka makinesi (28 & derece; C) | Hücre kültürü | Panasonic | MCO-18AC |
| (37 &°; C) | Panasonic | MCO-18AC | Hücre kültürü için cihaz |
| PCR tüpü | |||
| penisilin-streptomisin | Gibco | 15410-122 | Bakterilerden kontaminasyonu önlemek için ortamda antibiyotik |
| Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi | Gibco | 15240096 | |
| Buzdolabı (-80 > C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute & nbsp; orta (RPMI) | Gibco | C11875500BT | mosiquto hücre hatları için orta |
| Vidalı kapaklı depolama tüpleri (2 mL) | biofil | ve nbsp; | |
| steril havaneli | Tiangen | OSE-Y004 | Taşlama için sarf malzemeleri |
| TGrinder OSE-Y30 elektrikli doku öğütücü | Tiangen | OSE-Y30 | Taşlama aleti |
| Diseksiyon mikroskobu | ZEISS | stemi508 | |
| ışık tuzakları MXA-02 | Maxttrac | ||
| Sivrisinek emici makine | Ningbo Bangning | ||
| Pipet uçları | Axygen | TF | |
| QIAamp viral RNA mini kiti | QIAGEN | 52906 | |
| Cımbız | Dumont | 0203-5-PO |
Kaynaklar
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
