Method Article

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıvı-elektron mikroskobuna (sıvı-EM) olan ilgi, bilim adamlarının artık nano ölçekte gerçek zamanlı süreçleri gözlemleyebildikleri için son yıllarda fırladı. Yüksek çözünürlüklü kriyo-EM bilgisinin dinamik gözlemlerle eşleştirilmesi son derece arzu edilir, çünkü birçok olay hızlı zaman ölçeklerinde meydana gelir - milisaniye aralığında veya daha hızlı. Esnek yapılar hakkında gelişmiş bilgi, SARS-CoV-2 gibi ortaya çıkan patojenlerle mücadele etmek için yeni reaktiflerin tasarımına da yardımcı olabilir. Daha da önemlisi, biyolojik materyalleri akışkan bir ortamda görüntülemek, insan vücudundaki performanslarına benzersiz bir bakış sağlar. Burada, sıvı ve vitreus buzundaki virüs gruplarının nano ölçekli özelliklerini araştırmak için yeni geliştirilen yöntemler sunulmaktadır. Bu amaca ulaşmak için, model sistemler olarak iyi tanımlanmış örnekler kullanılmıştır. Numune hazırlama yöntemlerinin yan yana karşılaştırmaları ve temsili yapısal bilgiler sunulmaktadır. Alt nanometre özellikleri, ~ 3.5-Å-10 şaralığında çözülen yapılar için gösterilmiştir. Bu tamamlayıcı çerçeveyi destekleyen diğer yeni sonuçlar, aşı adaylarının dinamik içgörülerini ve sıvı içinde görüntülenen antikor bazlı tedavileri içermektedir. Genel olarak, bu korelasyon uygulamaları, moleküler dinamikleri görselleştirme yeteneğimizi geliştirerek, insan sağlığı ve hastalıklarında kullanımları için benzersiz bir bağlam sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomedikal araştırmalar, yeni teknolojilerin geliştirilmesi yoluyla insan sağlığı ve hastalıkları hakkındaki anlayışımızı geliştirir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme, nanodünyaya bakışımızı dönüştürüyor - hücreleri ve moleküllerizarif ayrıntılarla 1,2,3,4,5 olarak incelememize izin veriyor. Yumuşak polimerler, protein düzenekleri veya insan virüsleri gibi dinamik bileşenlerin statik bilgileri, karmaşık anlatılarının yalnızca sınırlı bir görüntüsünü ortaya koymaktadır. Moleküler varlıkların nasıl çalıştığını daha iyi anlamak için, yapıları ve işlevleri ortaklaşa araştırılmalıdır.

Atomik olarak ince grafen veya silikon bazlı mikroçipler gibi malzemelerin üretimindeki son gelişmeler, iletim elektron mikroskoplarını (TEM'ler) kullanarak gerçek zamanlı yapı-fonksiyon analizi için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu malzemeler, canlı EM görüntüleme 6,7,8,9,10,11 için hermetik olarak kapatılmış odalar oluşturabilir. Oda sıcaklığının kriyo-EM ile ilişkili olduğu yeni sıvı-EM alanı, çözeltideki sert veya yumuşak malzemelerin benzeri görülmemiş görüntülerini sunarak, bilim adamlarının numunelerinin yapısını ve dinamiklerini aynı anda incelemelerine olanak tanır. Sıvı-EM uygulamaları, kanser kök hücreleri ile etkileşime giren terapötik nanopartiküllerin gerçek zamanlı kayıtlarını ve viral patojenlerin moleküler karmaşıklıklarındaki değişiklikleri içerir12,13,14.

Metodolojik ilerlemelerin kriyo-EM alanındaki çözünürlük devrimini teşvik etmesi gibi, sıvı-EM'nin bilimsel topluluk için yüksek verimli bir araç olarak kullanımını genişletmek için yeni tekniklere ve yöntemlere ihtiyaç vardır. Burada sunulan yöntemlerin genel amacı, sıvı-EM numune hazırlama protokollerini kolaylaştırmaktır. Geliştirilen tekniklerin arkasındaki mantık, hem sıvı hem de kriyo-EM veri toplama için uygun yeni mikroçip tasarımları ve otomatik yükleyici cihazlar kullanmaktır (Şekil 1)7,14,15,16,17. Montajlar, seans başına birden fazla numuneyi veya bir F200C TEM'i barındırabilen Krios gibi otomatik cihazlar için standart ızgara klipsleri kullanılarak mekanik olarak kapatılmıştır (Şekil 2). Bu metodoloji, gerçek zamanlı malzeme analizi için daha geniş amaçlar gösteren standart kriyo-EM uygulamalarının ötesinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımını genişletir.

Mevcut video makalesinde, ticari olarak temin edilebilen numune tutucuları olan ve olmayan sıvı içinde virüs montajlarının hazırlanması için protokoller sunulmaktadır. Sıvı-EM için özel numune tutucuyu kullanan ince sıvı numuneler, kriyo-EM numuneleriyle karşılaştırılabilir yapısal bilgilerin yanı sıra numunelerin dinamik içgörülerini de sağlayabilir. Ayrıca, yüksek verimli rutinler için otomatik yükleyici araçlarını kullanarak sıvı numuneleri hazırlama yöntemleri de gösterilmiştir. Diğer tekniklere göre en büyük avantajı, otomatik numune üretiminin, kullanıcının veri toplamadan önce numunelerini optimum kalınlık ve elektron dozu için hızlı bir şekilde değerlendirmesine izin vermesidir. Bu tarama tekniği, sıvı veya buz12,14,18,19'daki gerçek zamanlı kayıtlar için ideal alanları hızlı bir şekilde tanımlar. 3D yapı tayini amacıyla, sıvı-EM, kriyo-EM'de uygulanan köklü kriyo-EM yöntemlerini tamamlayabilir. Geleneksel TEM veya kriyo-EM teknolojilerini kullanan okuyucular, numunelerinin mevcut stratejilerini tamamlayacak şekilde yeni, dinamik gözlemlerini sağlamak için sıvı-EM iş akışlarını kullanmayı düşünebilirler.

Bu protokolde kullanılan virüs örnekleri, hediye olarak elde edilen ve standart koşullar altında kültürlenen saflaştırılmış adeno ilişkili virüs alt tip 3'ü (AAV) içerir12. Ayrıca, COVID-19 hastalarının serumundan türetilen ve ticari bir kaynaktan elde edilen bulaşıcı olmayan SARSCoV-2 alt viral derlemeleri de kullanılmıştır. Son olarak, saflaştırılmış simian rotavirüs (SA11 suşu) çift katmanlı parçacıklar (DLP'ler) Wake Forest Üniversitesi'ndeki Dr. Sarah M. McDonald Esstman'ın laboratuvarından elde edildi ve standart koşullar 6,17 kullanılarak kültürlendi. Burada açıklanan yazılım paketleri ücretsiz olarak mevcuttur ve bağlantılar Malzeme Tablosu bölümünde verilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sıvı-EM için numune tutucunun yüklenmesi

  1. Silikon nitrür (SiN) mikroçiplerini, her bir çipi 2 dakika boyunca 150 mL asetonda inkübe ederek ve ardından 2 dakika boyunca 150 mL metanol içinde inkübasyonla temizleyin. Talaşların laminer hava akımında kurumasını bekleyin.
  2. Plazma, Argon gazı kullanarak 30 W, 45 s için 15 mA standart koşullar altında çalışan bir kızdırma deşarj cihazı kullanarak kurutulmuş cipsleri temizler.
  3. Numune tutucunun ucuna kuru tabanlı bir mikroçip yükleyin. Baz çipe ~0,2 μL numune (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl 2'de0,2-1 mg/mL virüs tertibatları) ekleyin. 1-2 dakikalık bir inkübasyon adımını takiben, üst çipi numuneyi içeren ıslak taban yongasına yerleştirin.
  4. Üç pirinç vida ile mekanik olarak yerinde tutulan, hava geçirmez şekilde kapatılmış bir muhafaza oluşturmak için tertibatı birbirine kenetleyin. Montajı kapattıktan sonra, turbo pompalı kuru pompa istasyonu kullanarak ucu 10-6 Torr'a pompalayın. Tutucu artık TEM'e takılmaya hazırdır.
    NOT: Seçme tutucunun soğutma kapasitesi yoktur ve kriyo-EM için kullanılmaz.

2. Mikroçipli sandviç montajlarının üretimi

NOT: Farklı SiN veya silikon dioksit (SiO) mikroçipleri doğrudan sevk edilen jel paketlerinden kullanılabilir. Karbon kaplı altın ızgaralar da doğrudan tedarik edildiği gibi kullanılabilir.

  1. Plazma, Argon gazı kullanarak 45 s için 30 W, 15 mA standart koşullar altında çalışan bir kızdırma tahliye cihazı kullanarak mikroçipleri ve karbon ızgaralarını temizler.
  2. 50 mM HEPES, pH 7,5'te bulunan ~2 μL numune ekleyin; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2, bir jel paketi üzerine yerleştirilen parıltılı deşarjlı bir mikroçipe. Fazla çözeltiyi (~%50) filtre kağıdı veya pipet kullanarak çıkarın. 1-2 dakikalık bir inkübasyon adımını takiben, parıltılı boşaltılmış karbon ızgarasını numuneyi içeren ıslak mikroçipe ekleyin.
  3. Hermetik olarak kapatılmış bir muhafaza oluşturmak için oda sıcaklığında tek eğimli bir numune tutucu veya otomatik yükleyici ızgara klipsleri kullanarak tertibatı birbirine kenetleyin. Otomatik yükleyici kelepçeleri için, sandviç tertibatı alt C-klipsine yerleştirin, üst klipsi montajın üstüne yerleştirin ve montajı birbirine kapatmak için standart sıkıştırma aletini kullanın.
    NOT: Burada gerçekleştirilen sıkıştırma prosedürü, kriyo-EM ızgara kelepçeleme ile aynı adımları kullanır, ancak oda sıcaklığında. Kelepçelenmiş numuneler, görüntülemeden önce muhafazadaki sıvı korunurken 2 ay veya daha uzun süre saklanabilir. Oda sıcaklığında numune tutucu veya otomatik yükleyici ile sızıntı kontrolü yapılmaz.
  4. Örnek şimdi TEM'e yerleştirilmeye hazırdır. Otomatik yükleyicilere yerleştirilen numuneleri kriyo koşullarında veya oda sıcaklığında inceleyin.

3. İletim elektron mikroskobu kullanarak numunelerin görüntülenmesi

  1. Sıvı-EM görüntüleme
    1. Numune tutucuyu, bir alan emisyon tabancası (FEG) ile donatılmış ve 200 kV'ta çalışan TEM'e yükleyin.
    2. Tabancayı açın ve yalpalama fonksiyonunu kullanarak mikroskop aşamasının ösentrik yüksekliğini numuneye göre ayarlayın, numuneyi sütunda -15 ° ila +15 ° arasında eğin. Bu prosedür, numune kalınlığına uyum sağlamak için aşamayı Z yönünde ayarlar. Ve görüntü kaydı sırasında doğru bir büyütme sağlamaya yardımcı olur.
    3. 6 μm piksel aralığına sahip doğrudan dedektörle entegre edilmiş yerinde paketi kullanarak görüntüleri uzun kareli filmler olarak kaydedin (Video 1 ve Video 2). Tek tek görüntüler, otomatik görüntüleme rutinleri uygulayan seri veri toplama yazılım paketi20 kullanılarak da kaydedilebilir. Düşük doz koşulları altında, saniyede 28.000x-92.000x ve 40 kare arasında değişen büyütmelerde görüntüler elde edin.
    4. Numuneye ışın hasarını en aza indirmek için pozlama sürelerini (0,25-1 sn) ayarlayın. Belirtilen büyütmede -1-4 μm'lik bir bulanıklaştırma aralığı kullanın. Kalın bir çözümle karşılaşılırsa, daha yüksek bulanıklaştırma değerleri kullanın veya farklı bir ilgi alanı seçin.
    5. Elektron ışınını, kabarcıklar oluşana kadar veri toplama için kullanılmayan kurban edilen bir alana odaklayarak görüntüleme oturumu boyunca örneklerde çözeltinin bulunduğundan emin olun (Ek Şekil 1).
  2. Kriyo-EM görüntüleme
    1. Kırpılmış EM ızgaralarını veya mikroçipli sandviçleri FEG ile donatılmış ve 300 kV'ta çalışan TEM'e yükleyin. Tabancayı açın ve yukarıdaki sıvı-TEM için açıklanan benzer bir prosedürü kullanarak mikroskop aşamasının ösentrik yüksekliğini ayarlayın (adım 3.1.2).
    2. Otomatik görüntüleme rutinlerini uygularken mikroskop sistemine entegre edilmiş tek parçacık analiz sistemini kullanarak tek tek görüntüleri kaydedin. Saniyede 59.000x ve 40 kare büyütmede 14 μm piksel aralığına sahip tek parçacık analizi doğrudan elektron dedektörünü kullanarak düşük doz koşullarında görüntüleri kaydedin.
    3. Belirtilen büyütmede 1-4 μm'lik bir bulanıklaştırma aralığı kullanın. Kalın vitreus buz katmanlarıyla karşılaşılırsa, daha yüksek bulanıklaştırma değerleri kullanın veya veri toplama için farklı bir bölge seçin.

4. Veri analizi ve 3 boyutlu yapı karşılaştırmaları

  1. Sıvı ve vitreus buzunda adeno ilişkili virüsün (AAV) analizi
    1. RELION-3.08 program 21 veya başka bir görüntü işleme yazılımı22 kullanarak sıvı ve buzdaki AAV parçacıkları için filmleriişleyin. MotionCor2 v1.2.3'ü kullanarak hareket düzeltmesi gerçekleştirin.
    2. Düzeltildikten sonra, program yazılım paketindeki otomatik toplama aracını kullanarak parçacıkları ayıklayın. Tipik kutu boyutları sıvı numuneler için 330 piksel ve buz örnekleri için 350 pikseldir.
    3. Programın 3B başlangıç modeli rutinini ve/veya veri işleme yazılım paketindeki ab-initio model seçeneklerini kullanarak C1 simetrisini kullanarak ilk rekonstrüksiyonları hesaplayın. Programda, sıvı numuneler için T = 4 ve piksel boyutu 1.01 şve buz örnekleri için 1.13 şbir düzenlileştirme parametresi kullanın.
    4. İyileştirme prosedürleri boyunca 300 şmaske değeri kullanın. Birden fazla EM haritası elde etmek için I1 simetrisini kullanarak veri işleme yazılımında iyileştirme protokolleri gerçekleştirin. Beklenen yapısal çözünürlük 4 şveya daha iyi aralığında olabilir. Sıvı için 16.800'de ve buz12.14 için 15.240'ta ikosahedral simetri uygulayan parçacık eşdeğerliğini kullanın.
      NOT: Çözünürlük tahminleri altın standart Fourier kabuk korelasyonu (FSC) kriterlerine dayanmaktadır.
    5. EM haritalarını ~ 250 Å'de maskeleyin ve moleküler yapı analizi yazılım paketi23,24 kullanarak sonuçları inceleyin. Şekil 3'te, dilimler ~5 nm'lik artışlarla gösterilmiştir.
    6. Karşılaştırma için EM haritalarından kapsid proteini (VP1) alt birimlerini çıkarın. Parçacık çapı ölçümlerine dayanarak EM yapıları arasındaki dinamik değişiklikleri ölçün (Ek Şekil 2) ve ardından yazılımdaki Morph harita işlevini kullanarak görselleştirin.
  2. Sıvı halde SARS-CoV-2 sub-viral gruplarının analizi
    1. RELION-3.08 programını kullanarak filmleri işleyin. MotionCor2 v1.2.3 kullanarak görüntü kayması ve ışın kaynaklı hareket için doğru. Mikroskopun kontrast transfer fonksiyonu (CTF) için doğru.
    2. 800 piksel kutu boyutuna sahip viral montajları seçmek için programdaki otomatik toplama aracını kullanın. Hesaplama verimliliği için, çıkarılan parçacıklar 256 piksele yeniden ölçeklendirilebilir. Programda C1 simetrisini kullanarak T = 2 ve 1,66 şpiksel boyutunda bir düzenlileştirme parametresine sahip bir başlangıç modeli elde edin.
    3. Bir EM haritası elde etmek için programda 3D iyileştirme gerçekleştirin, standart FSC kriterlerine göre ~ 8.25 Å'de bir örnek gösterilmiştir (Şekil 4). EM haritalarını, Şekil 4'te gösterildiği gibi 25 nm'de artırılmış dilimlerle moleküler yapı analiz yazılımını kullanarak görselleştirin.
  3. Vitröz buzda rotavirüs çift katmanlı parçacıklarının (DLP'ler) analizi
    1. Diğer görüntü işleme yazılımlarını kullanarak rotavirüs DLP'leri için filmleri işleyin. Görüntülerdeki sapmayı düzeltmek için MotionCor2 v1.2.3 sürümünü kullanın. Görüntüler üzerindeki lens efektlerini düzeltmek için Patch CTF tahminini kullanın.
    2. Yazılımdaki otomatik toplama aracını kullanarak 950 piksel kutu boyutuna sahip parçacıkları ayıklayın. Bilgi işlem amacıyla kutu boyutunu gerektiği gibi alt örnekleyin.
    3. Ab-initio seçeneklerini ve C1 simetrisini kullanarak ilk modelleri hesaplayın. 1,47 şpiksel boyutu ve 800 şmaske değeri dahil olmak üzere iyileştirme parametrelerini kullanın.
    4. I1 simetrisini uygularken ek iyileştirme rutinleri gerçekleştirin. Örnek sonuçlar, altın standart FSC kriterlerine göre 10,15 şEM haritasını içerir. Kullanılan toplam partiküller 2050 idi ve bu da ikosahedral simetri operatörü nedeniyle 123.000 protomer birimine eşittir (Şekil 5).
    5. Son haritaları ~ 750 Å'de maskeleyin ve sonuçları moleküler yapı analizi yazılım paketinde görselleştirin. EM haritasındaki örnek dilimler Şekil 5'te ~10 nm'lik artışlarla gösterilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm sıvı-EM görüntüleme deneyleri için 200 kV'ta çalışan bir sıvı-TEM ve tüm kriyo-EM veri toplama için 300 kV'ta çalışan bir kriyo-TEM kullanılmıştır. Çoklu virüslerin temsili görüntüleri ve yapıları, çeşitli test deneklerinde yöntemlerin yararlılığını göstermek için sunulmuştur. Bunlar arasında rekombinant adeno ilişkili virüs alt tip 3 (AAV), hasta serumundan türetilen SARS-CoV-2 alt viral düzenekleri ve simian rotavirüs çift katmanlı parçacıkları (DLP'ler), SA11 suşu bulunur. İlk olarak, sıvı tampon çözeltisinde (50 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-EM alanından uyarlanmış yeni otomatik araçlar ve teknolojiler kullanarak mevcut sıvı-EM iş akışlarını kolaylaştırmak için yeni fırsatlar sunulmaktadır. Yeni mikroçipli sandviç tekniğini içeren uygulamalar, sıvı veya vitreus buzunda yüksek çözünürlüklü görüntüleme analizine olanak sağladıkları için diğer yöntemlere göre önemlidir. Protokoldeki en kritik adımlardan biri, nano ölçekte zarif ayrıntıları görselleştirmek için ideal sıvı kalınlığına sahip örnekler üretmektir. İlgilenilen ideal bölgeler, otomatik veri topl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Yazar Madeline J. Dressel-Dukes, Protochips, Inc.'in bir çalışanıdır ve Michael Spilman, DirectElectron'un bir çalışanıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, saflaştırılmış AAV-3 sağladığı için Dr. Luk H. Vandenberghe'ye (Harvard Tıp Fakültesi, Oftalmoloji Bölümü) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Kanser Enstitüsü (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 - D.F.K.) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AsetonFisher Bilimsel  A11-11 Litre
Otomatik Yükleyici kırpma aletiThermoFisher ScientificN/AAyrıca SubAngstrom tedarikçisi
Otomatik yükleyici ızgara klipsleriThermoFisher Scientific/Aüst ve alt klipsler
Karbon kaplı altın EM ızgaralarıElektron Mikroskobu BilimleriCF400-AU-50400 gözlü, 5 nm kalınlık
COVID-19 hasta serumuRayBiotechCoV-Pos-S-500500 mikrolitre PCR+ serum
MetanolFisher Scientific  A412-11 Litre
Microwell-integrad mikroçiplerProtochips, Inc.EPB-42A1-1010x10 mm pencere dizileri
TEMWindows mikroçipleriSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 büyük pencere, 10 nn kalınlığında
TEMWindows mikroçipleriSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 küçük pencere, 5 nm kalınlığında
Üst mikroçiplerProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm pencere
Whatman #1 filtre kağıdıWhatman1001 090100 adet, 90 mm
Ekipman 
DirectView doğrudan elektron dedektörüDoğrudan Elektron6 mikron piksel aralığı
Falcon 3 EC doğrudan elektron dedektörüThermoFisher Scientific14 mikron piksel aralığı
Gatan 655 Kuru pompa istasyonuGatan, Inc.  10-6 aralığa kadar pompa tutucu ucu
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificson teknoloji numune hazırlama ünitesi 
PELCO easiGlow, kızdırma deşarj ünitesiTed Pella, Inc.  Negatif polarite modu
Poseidon Select numune tutucuProtochips, Inc.  FEI uyumlu; numune tutucu
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Sıvı-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Serbestçe kullanılabilen yazılımWeb sitesi bağlantısı<strong>Yorumlar (isteğe bağlı)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/diğer görüntü işleme yazılımı
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF bulma programı
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/moleküler yapı analizi yazılım paketi
Nhttps://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
  3. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  4. DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
  5. Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
  6. Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936(2013).
  7. Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
  8. Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
  9. Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
  10. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  11. Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80(2018).
  12. Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221(2021).
  13. Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
  14. Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
  15. Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
  16. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  17. Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
  18. Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
  19. Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
  20. Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
  21. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  22. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  23. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  24. Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
  25. Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
  26. Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
  27. Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
  28. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
  29. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
  30. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
  31. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
  32. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
  33. Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes