Method Article

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıvı-elektron mikroskobuna (sıvı-EM) olan ilgi, bilim adamlarının artık nano ölçekte gerçek zamanlı süreçleri gözlemleyebildikleri için son yıllarda fırladı. Yüksek çözünürlüklü kriyo-EM bilgisinin dinamik gözlemlerle eşleştirilmesi son derece arzu edilir, çünkü birçok olay hızlı zaman ölçeklerinde meydana gelir - milisaniye aralığında veya daha hızlı. Esnek yapılar hakkında gelişmiş bilgi, SARS-CoV-2 gibi ortaya çıkan patojenlerle mücadele etmek için yeni reaktiflerin tasarımına da yardımcı olabilir. Daha da önemlisi, biyolojik materyalleri akışkan bir ortamda görüntülemek, insan vücudundaki performanslarına benzersiz bir bakış sağlar. Burada, sıvı ve vitreus buzundaki virüs gruplarının nano ölçekli özelliklerini araştırmak için yeni geliştirilen yöntemler sunulmaktadır. Bu amaca ulaşmak için, model sistemler olarak iyi tanımlanmış örnekler kullanılmıştır. Numune hazırlama yöntemlerinin yan yana karşılaştırmaları ve temsili yapısal bilgiler sunulmaktadır. Alt nanometre özellikleri, ~ 3.5-Å-10 şaralığında çözülen yapılar için gösterilmiştir. Bu tamamlayıcı çerçeveyi destekleyen diğer yeni sonuçlar, aşı adaylarının dinamik içgörülerini ve sıvı içinde görüntülenen antikor bazlı tedavileri içermektedir. Genel olarak, bu korelasyon uygulamaları, moleküler dinamikleri görselleştirme yeteneğimizi geliştirerek, insan sağlığı ve hastalıklarında kullanımları için benzersiz bir bağlam sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomedikal araştırmalar, yeni teknolojilerin geliştirilmesi yoluyla insan sağlığı ve hastalıkları hakkındaki anlayışımızı geliştirir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme, nanodünyaya bakışımızı dönüştürüyor - hücreleri ve moleküllerizarif ayrıntılarla 1,2,3,4,5 olarak incelememize izin veriyor. Yumuşak polimerler, protein düzenekleri veya insan virüsleri gibi dinamik bileşenlerin statik bilgileri, karmaşık anlatılarının yalnızca sınırlı bir görüntüsünü ortaya koymaktadır. Moleküler varlıkların nasıl çalıştığın....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sıvı-EM için numune tutucunun yüklenmesi

  1. Silikon nitrür (SiN) mikroçiplerini, her bir çipi 2 dakika boyunca 150 mL asetonda inkübe ederek ve ardından 2 dakika boyunca 150 mL metanol içinde inkübasyonla temizleyin. Talaşların laminer hava akımında kurumasını bekleyin.
  2. Plazma, Argon gazı kullanarak 30 W, 45 s için 15 mA standart koşullar altında çalışan bir kızdırma deşarj cihazı kullanarak kurutulmuş cipsleri temizler.
  3. Numune tutucunun ucuna kuru tabanlı bir mikroçip yükleyin. Baz çipe ~0,2 μL numune (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl 2'de0,2-1 mg/mL virüs tertibatları) ekle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm sıvı-EM görüntüleme deneyleri için 200 kV'ta çalışan bir sıvı-TEM ve tüm kriyo-EM veri toplama için 300 kV'ta çalışan bir kriyo-TEM kullanılmıştır. Çoklu virüslerin temsili görüntüleri ve yapıları, çeşitli test deneklerinde yöntemlerin yararlılığını göstermek için sunulmuştur. Bunlar arasında rekombinant adeno ilişkili virüs alt tip 3 (AAV), hasta serumundan türetilen SARS-CoV-2 alt viral düzenekleri ve simian rotavirüs çift katmanlı parçacıkları (DLP'ler), SA11 suşu bulunur. İlk olarak, sıvı tampon çözeltisinde (50 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-EM alanından uyarlanmış yeni otomatik araçlar ve teknolojiler kullanarak mevcut sıvı-EM iş akışlarını kolaylaştırmak için yeni fırsatlar sunulmaktadır. Yeni mikroçipli sandviç tekniğini içeren uygulamalar, sıvı veya vitreus buzunda yüksek çözünürlüklü görüntüleme analizine olanak sağladıkları için diğer yöntemlere göre önemlidir. Protokoldeki en kritik adımlardan biri, nano ölçekte zarif ayrıntıları görselleştirmek için ideal sıvı kalınlığına sahip örnekler üretmektir. İlgilenilen ideal bölgeler, otomatik veri topl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler. Yazar Madeline J. Dressel-Dukes, Protochips, Inc.'in bir çalışanıdır ve Michael Spilman, DirectElectron'un bir çalışanıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, saflaştırılmış AAV-3 sağladığı için Dr. Luk H. Vandenberghe'ye (Harvard Tıp Fakültesi, Oftalmoloji Bölümü) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Kanser Enstitüsü (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 - D.F.K.) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AsetonFisher Bilimsel  A11-11 Litre
Otomatik Yükleyici kırpma aletiThermoFisher ScientificN/AAyrıca SubAngstrom tedarikçisi
Otomatik yükleyici ızgara klipsleriThermoFisher Scientific/Aüst ve alt klipsler
Karbon kaplı altın EM ızgaralarıElektron Mikroskobu BilimleriCF400-AU-50400 gözlü, 5 nm kalınlık
COVID-19 hasta serumuRayBiotechCoV-Pos-S-500500 mikrolitre PCR+ serum
MetanolFisher Scientific  A412-11 Litre
Microwell-integrad mikroçiplerProtochips, Inc.EPB-42A1-1010x10 mm pencere dizileri
TEMWindows mikroçipleriSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 büyük pencere, 10 nn kalınlığında
TEMWindows mikroçipleriSimpore, Inc. SN100-A05Q33A9 küçük pencere, 5 nm kalınlığında
Üst mikroçiplerProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm pencere
Whatman #1 filtre kağıdıWhatman1001 090100 adet, 90 mm
Ekipman 
DirectView doğrudan elektron dedektörüDoğrudan Elektron6 mikron piksel aralığı
Falcon 3 EC doğrudan elektron dedektörüThermoFisher Scientific14 mikron piksel aralığı
Gatan 655 Kuru pompa istasyonuGatan, Inc.  10-6 aralığa kadar pompa tutucu ucu
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificson teknoloji numune hazırlama ünitesi 
PELCO easiGlow, kızdırma deşarj ünitesiTed Pella, Inc.  Negatif polarite modu
Poseidon Select numune tutucuProtochips, Inc.  FEI uyumlu; numune tutucu
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Sıvı-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
Serbestçe kullanılabilen yazılımWeb sitesi bağlantısı<strong>Yorumlar (isteğe bağlı)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/diğer görüntü işleme yazılımı
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF bulma programı
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/moleküler yapı analizi yazılım paketi
Nhttps://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biolo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liquid Electron MicroscopyCryo Electron MicroscopyVirus AssembliesHigh Resolution ImagingMolecular DynamicsMicrochip Sandwich MethodSARS CoV 2 ImagingSample PreparationStructural AnalysisDynamic Processes