Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Genç Yetişkin ve Yaşlı Gerbil Cochleae'de İmmünoetiketleme ve Şerit Sinapslarının Sayılması

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63874

⸱

21 Nisan 2022

 ,  , 
1Cluster of Excellence "Hearing4all" and Research Centre Neurosensory Science, Department of Neuroscience, School of Medicine and Health Science, Carl von Ossietzky University Oldenburg

Bu makalede

Özet

Genç erişkin ve yaşlı gerbil kokleae'lerin afferent sinaptik yapıların ve saç hücrelerinin immüno-etiketlenmesi, yaşlı dokudaki otofloresansın söndürülmesi, kokleae'nin uzunluğunun diseksiyonu ve tahmin edilmesi ve konfokal görüntüleme ile elde edilen görüntü yığınlarındaki sinapsların nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

İç saç hücrelerini ve afferent işitme siniri liflerini birbirine bağlayan şerit sinapsların kaybı, yaşa bağlı işitme kaybının bir nedeni olarak kabul edilir. Şerit sinapslarının kaybını tespit etmek için en yaygın yöntem immünoetiketlemedir, çünkü bireysel bir kokleadaki çeşitli tonotopik konumlardan kantitatif örneklemeye izin verir. Bununla birlikte, ilgilenilen yapılar kemikli kokleanın derinliklerine gömülüdür. Gerbiller, yaşa bağlı işitme kaybı için bir hayvan modeli olarak kullanılır. Burada, fiksasyon, gerbil koklear bütün montajların immüno-etiketlenmesi, konfokal görüntüleme ve şerit sinaps sayılarının ve hacimlerinin ölçülmesi için rutin protokoller açıklanmaktadır. Ayrıca, değerli yaşlanan bireylerden iyi malzeme elde etmekle ilgili özel zorluklar vurgulanmaktadır.

Gerbiller ötenazi yapılır ve ya kardiyovasküler olarak perfüze edilir ya da timpanik bülleri kafatasından dikkatlice diseke edilir. Koklealar tepe ve tabanda açılır ve doğrudan fiksatif bölgeye aktarılır. İlk yöntemden bağımsız olarak, koklealar sonradan sabitlenir ve daha sonra kireçten arındırılır. Doku daha sonra sinaptik öncesi ve sonrası yapılara ve saç hücrelerine karşı birincil antikorlarla etiketlenir. Daha sonra, kokleae, kendi birincil antikorlarına karşı spesifik olan ikincil floresan etiketli antikorlarla inkübe edilir. Yaşlı gerbillerin kokleaları daha sonra yaşlı hayvanların dokularının tipik olarak önemli arka plan floresansını azaltmak için bir otofloresan söndürücü ile muamele edilir.

Son olarak, koklealar 6-11 segmente ayrılır. Tüm koklear uzunluk, belirli koklear konumların bireyler arasında güvenilir bir şekilde belirlenebileceği şekilde yeniden yapılandırılır. Sırayla elde edilen konfokal görüntü yığınları, seçilen konumlardaki saç hücrelerini ve sinapsları görselleştirmeye yardımcı olur. Konfokal yığınlar deconvolved edilir ve sinapslar ya ImageJ kullanılarak manuel olarak sayılır ya da Matlab'da özel olarak yazılmış görüntü analizi prosedürleri ile sinaptik yapıların daha kapsamlı bir şekilde ölçülmesi gerçekleştirilir.

Giriş

Yaşa bağlı işitme kaybı, 65 yaş ve üstü dünya nüfusunun üçte birinden fazlasını etkileyen, dünyanın en yaygın hastalıklarından biridir1. Altta yatan nedenler hala tartışılmakta ve aktif olarak araştırılmaktadır, ancak iç saç hücrelerini (IHC'ler) afferent işitme siniri lifleri ile bağlayan özel sinapsların kaybını içerebilir2. Bu şerit sinapslar, kendisine bağlı nörotransmitter glutamat ile dolu veziküllerin yanı sıra postsinaptik α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) glutamat reseptörleri 3,4,5 olan presinaptik bir yapıyı içerir. Gerbilde, ~ 20 afferent işitme siniri lifi bir IHC 6,7,8 ile temas eder. IHC'deki modiolusa bakan lifler büyük sinaptik şeritlere karşıyken, IHC'nin sütun tarafına bağlanan lifler küçük sinaptik şeritlerle karşı karşıya kalır (yani, kedilerde9, gerbiller7, gine domuzları 10 ve farelerde 3,11,12,13,14). Ayrıca gerbilde presinaptik şeritlerin ve postsinaptik glutamat yamalarının büyüklüğü pozitif korelasyongösterir 7,14. IHC'nin modiolar tarafındaki büyük şeritlere karşı çıkan lifler kalibre olarak küçüktür ve düşük spontan oranlara ve yüksek eşiklere sahiptir15. Düşük spontan oranlı liflerin, gürültüye maruz kalma 10 ve ototoksik ilaçlara karşı16, IHC15'in sütun tarafında bulunan yüksek spontan düşük eşikli liflerden daha savunmasız olduğuna dair kanıtlar vardır.

Şerit sinapslarının kaybı, koklear nöral yaşa bağlı işitme kaybında en erken dejeneratif olaydır, spiral ganglion hücrelerinin ve bunların afferent işitme siniri liflerinin kaybı 17,18'in gerisinde kalmaktadır. Elektrofizyolojik korelasyonlar, işitsel beyin sapı yanıtlarınınkayıtlarını içerir 17 ve bileşik aksiyon potansiyelleri8; Bununla birlikte, bunlar sinaps kaybının inceliklerini yansıtmaz, çünkü düşük spontan oranlı lifler bu önlemlere katkıda bulunmaz16. Daha umut verici elektrofizyolojik metrikler, kütle potansiyelinden türetilmiş nöral indeks19 ve peristimulus zaman yanıtı20'dir. Bununla birlikte, bunlar yalnızca hayvanın işitme siniri lifi kaybının ötesinde, kalan işitme siniri liflerinin aktivitesini etkileyen başka koklear patolojileri yoksa güvenilirdir8. Ayrıca, gerbildeki davranışsal olarak değerlendirilen eşikler sinaps sayıları21 ile ilişkili değildi. Bu nedenle, hayatta kalan şerit sinapslarının ve dolayısıyla fonksiyonel işitme siniri liflerinin sayısının güvenilir bir şekilde ölçülmesi ancak koklear dokunun doğrudan incelenmesiyle mümkündür.

Moğol gerbili (Meriones unguiculatus), yaşa bağlı işitme kaybını incelemek için uygun bir hayvan modelidir. Kısa bir ömre sahiptir, insanlara benzer düşük frekanslı işitmeye sahiptir, bakımı kolaydır ve yaşa bağlı işitme kaybıile ilgili insan patolojileriyle benzerlikler gösterir 2,22,23,24. Gerbiller, ortalama yaşam süreleri22'nin sonuna yakın olan 36 aylıkken yaşlı olarak kabul edilir. Daha da önemlisi, yaşa bağlı bir şerit sinaps kaybı, sessiz ortamlarda yetiştirilen ve yaşlanan gerbillerde gösterilmiştir 8,21.

Burada, genç yetişkinlerden yaşlılara kadar farklı yaşlardaki gerbillerden kokleaları immünoetiketlemek, diseke etmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır. Presinapsın (CtBP2), postsinaptik glutamat reseptör yamalarının (GluA2) ve IHC'lerin (myoVIIa) bileşenlerine yönelik antikorlar kullanılır. Yaşlı koklealarda arka planı azaltan ve floresan sinyalini sağlam bırakan bir otofloresan söndürücü uygulanır. Ayrıca, hem duyusal epiteli hem de stria vascularis'i incelemek için kokleanın nasıl diseke edileceğine dair bir açıklama verilmiştir. Koklear uzunluk, belirli en iyi frekanslara karşılık gelen farklı koklear konumların seçilmesini sağlamak için ölçülür25. Sinaps sayılarının nicelleştirilmesi, serbestçe kullanılabilen ImageJ26 yazılımı ile gerçekleştirilir. Bireysel HC içindeki sinaps hacimlerinin ve konumlarının ek nicelleştirilmesi, Matlab'da özel olarak yazılmış yazılımla gerçekleştirilir. Bu yazılım, yazarlar profesyonel dokümantasyon ve destek sağlayacak kaynaklardan yoksun oldukları için kamuya açık hale getirilmemiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm protokoller ve prosedürler, AZ 33.19-42502-04-15/1828 ve 33.19-42502-04-15/1990 izin numaralarıyla Almanya'nın Aşağı Saksonya eyaletinin ilgili makamları tarafından onaylanmıştır. Bu protokol her iki cinsiyetten Moğol gerbilleri (M. unguiculatus) içindir. Genç yetişkin 3-12 aylık yaşı ifade ederken, gerbiller 36 ay ve üstü olarak kabul edilir. Aksi belirtilmediğinde, tamponlar ve çözeltiler hazırlanabilir ve buzdolabında birkaç aya kadar (4-8 ° C) saklanabilir. Kullanmadan önce, tamponların ve çözeltilerin çökelmediğinden emin olun.

1. Fiksasyon ve organ toplama

NOT: Sadece kokleae'ye ihtiyaç duyulursa, daldırma yoluyla biraz daha basit bir sabitleme prosedürünün uygulanması önerilir. Bununla birlikte, iyi korunmuş bir beyne de ihtiyaç duyulursa, transkardiyal perfüzyon tek seçenektir. Her iki durumda da fiksatif fosfat tamponlu salinde (PBS) %4 paraformaldehittir (PFA). Bu taze yapılmalıdır, ancak kullanıma kadar dondurulmuş olarak saklanabilir. Transkardiyal perfüzyon için ~300 mL veya daldırma yoluyla fiksasyon için koklea başına ~50-100 mL alikotlar kullanın.

DİKKAT: PFA tehlikeli bir maddedir; genel laboratuvar güvenlik prosedürlerine göre ele alın.

  1. Transkardiyal perfüzyon ile fiksasyon
    1. Perfüzyon ayarını, boru herhangi bir hava kabarcığından temizlenene kadar yıkayın. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için perfüzyon tüpünü heparin içeren PBS (100 mL PBS'de 0.2 mL) ile doldurun. Boru PBS ile doldurulduktan ve sıvı saklama şişesi yeni boşaldıktan sonra akışı durdurun; içine 200 mL çözülmüş PFA dökün.
      NOT: Kurulum artık hayvan için hazırdır. Borudaki kalan PBS, kanı temizlemek için yeterlidir ve akış devam ettirildiğinde otomatik olarak fiksatif tarafından takip edilecektir.
    2. PFA'nın çıkışı için bir atık toplama sisteminin mevcut olduğundan emin olun. Taze bir kanül (19 G) kullanın ve büyük makas, forseps (düzleştirilmiş uçlu), hemostatlar, neşter veya keskin kanül ve pimleri kullanışlı bir lastik paspas kullanın.
    3. Gerbili intraperitoneal aşırı dozda pentobarbital ile ötenazi yapın (160 mg / mL, hayvan başına 0.3 mL, vücut ağırlığı aralığı: 50-120 g). Hayvanı tekrar kafesine koyun. Solunum durması, solunumun 30 s veya daha uzun aralıklarla düzensiz hale gelmesine neden olduğunda, gerbili sırt üstü kauçuk paspasın üzerine yerleştirin ve hem ön pençeleri hem de bir arka pençeyi pimlerle sabitleyin (perfüzyon başarısının daha iyi değerlendirilmesi için bir arka pençeyi hareket ettirmek için serbest bırakın; adım 1.1.7'den sonraki nota bakın).
    4. Göğüs boşluğunu açmak için, cildi forseps ile sternumun üzerine kaldırın ve beyaz renkli processus xiphoideus görünene kadar cildi sternumun yaklaşık 0,5 cm altında makasla kesin. Sternumu processus xiphoideus'ta forseps ile tutun ve göğüs boşluğuna iyi bir görünüm elde etmek için diyafram boyunca kesin. Kalbe iyi erişim olana kadar kaburgaları her iki tarafta yanal olarak kesin. Organlara zarar vermemek için makas açısının gerbilin gövdesine göre paralel ve düz olduğundan emin olun ve böylece kapalı bir dolaşım sistemi sağlayın.
    5. Bir hemostatı sternuma kelepçeleyin, göğüs kafesini kaldırın ve kan akışını engellememek için hemostatı herhangi bir vücut parçasına koymadan hemostatı gerbilin omzuna yerleştirin.
    6. Yaklaşık her 2 saniyede bir PBS damlası kanülden (19 G) akana kadar sıvı akışını hafifçe açın. Kalbi forseps ile tutun ve sol ventrikülün açıkça görülebilmesi için biraz sola çevirin. Kanülü sol ventriküle, septuma nüfuz etmekten kaçınacak bir açıyla yerleştirin. İğneyi elle veya başka bir hemostatla yerinde tutun.
      NOT: Sol ve sağ ventriküller farklı renk tonlarıyla ayırt edilebilir; sol ventrikül, kalp dokusunun geri kalanından daha açık renkli görünür.
    7. Sıvı akışının basıncını yavaşça artırın ve sağ atriyumu ince makas, neşter veya başka bir kanülle açın. Damlama odasında yaklaşık 2-3 damla/sn gözlenene kadar sıvı akışını daha fazla açın veya pompa için 4 mL/dak'lık bir akış ayarlayın. Kalbin sabitlenmesi başladıktan sonra, perfüzyon kanülünün daha fazla tutulmadan yerinde kalmasını sağlayın.
      NOT: Başarılı perfüzyon belirtileri yavaş kas kasılmaları, boyun ve ekstremitelerin sertleşmesi, karaciğerin soluklaşması ve pembe akciğerlerdir. Başarısız perfüzyonun belirtisi, akciğerlerin beyazlamasıdır, bu da pulmoner dolaşımın septumun delinmesi nedeniyle perfüze edildiğini gösterir.
    8. Başarısız perfüzyon durumunda, kanülü daha yukarıya, aortun içine doğru hareket ettirmeye çalışın ve bir hemostat ile yerine kelepçeleyin.
    9. Gerbilin başını kes. Bullaları çıkarın ve adım 1.2.2'de açıklandığı gibi kemiğini kesin ve kırın.
      NOT: Doku yeterince sabitlenmemişse, duyusal epitel diseksiyon sırasında Corti organından çıkacaktır.
    10. Perfüzyon 5-10 dakika içinde fiksasyon belirtisi göstermiyorsa, iptal edin ve daldırma yoluyla fiksasyon için hemen aşağıdaki prosedürü izleyin. Bunun için, kokleayı adım 1.2.2'deki gibi tedavi edin ve dokuyu vidalı kapaklı kaplarda yaklaşık 50-80 mL% 4 PFA'ya 8 ° C'de bir 2D çalkalayıcı üzerinde 1-2 gün boyunca sabitleyin.
      NOT: Perfüzyon sırasında fiksasyon kalitesini nihai olarak derecelendirmek zor olabileceğinden, kokleaların tarif edildiği gibi rutin olarak postfiksasyonu önerilir.
  2. Doku daldırma ile fiksasyon
    1. Gerbilleri intraperitoneal aşırı dozda pentobarbital (160 mg / mL, hayvan başına 0.3 mL, vücut ağırlığı aralığı: 50-120 g) ile ötenazileştirin. Gerbil nefes almayı bıraktığında, hayvanın kafasını kesin.
    2. Bullaları çıkarın ve kokleae'ye ulaşmak için sırasıyla makas ve forseps ile kemiğini kesin ve kırın. Maellus, incus ve yarım daire şeklindeki kanalları çıkarın. Koklear kemiğin üzerini forseps ile dikkatlice çizerek tepede ve bazal dönüşte küçük delikler açın. Bullaları derhal aşırı miktarda soğuk fiksatif (en az 50 mL) içine aktarın ve dokuyu 2 gün boyunca nazik ajitasyon (2D-shaker [100 rpm]) altında soğukta (4-8 ° C) sabitleyin.
      NOT: Doku sabitlendikten sonra, kokleae hemen işlenebilir veya PBS'de %0,05 sodyum azid ile saklanabilir. DİKKAT: Sodyum azid toksiktir. Depolama uzunluğunun lekelenme kalitesini olumsuz yönde etkileyebileceğini unutmayın. Sınırlı çalışmalar, immün boyamanın dokuyu sodyum azid içinde 2 yıl sakladıktan sonra daha zayıf göründüğünü ileri sürmüştür.

2. Doku hazırlama ve immünoetiketleme

  1. pH 8'de 0,5 M'lik bir çözelti üretmek için PBS'de etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tozunu çözün. Bunun için, manyetik bir karıştırıcı üzerine bir beher yerleştirin, toplam PBS miktarının yaklaşık yarısı ile doldurun ve uygun miktarda EDTA tozu ekleyin, bu da asidik bir süspansiyonla sonuçlanır. pH değerini bir pH metre ile izlerken konsantre sodyum hidroksit çözeltisini (NaOH) dikkatlice ekleyin. PBS ile istenen son hacme kadar doldurun ve mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için çözeltiyi filtreleyin.
    NOT: EDTA tozu, yalnızca süspansiyon nötr pH değerine ulaştığında tamamen çözülecektir.
  2. Dekalsifikasyon için, kokleae'yi PBS'de 80 mL'lik 0,5 M EDTA'ya aktarın. Dokuyu soğukta (4-8 ° C) 2D çalkalayıcıda (100 rpm) 2 gün boyunca nazik ajitasyon altında inkübe edin.
    NOT: Kireç çözme adımından sonra, doku kalan işlem adımlarına devam etmeden önce PBS'de 3 haftaya kadar birkaç gün saklanabilir. Stria vascularis'i etiketleyen antikorlar için, antikorların kendi hedeflerine düzgün erişimini sağlamak için kokleaların bu noktada (yani immünoboyamadan önce) modiolar eksen boyunca ikiye bölünmesi önerilir. Bu antikora bağımlıdır ve burada sinaptik yapıları ve IHC'leri etiketlemek için kullanılan antikorlar için geçerli değildir. Kesim için bir parça kırılabilir tıraş bıçağı ve bir bıçak tutucu (adım 4.2'de açıklandığı gibi) kullanın.
  3. 2 mL emniyetli sızdırmazlık reaksiyon tüplerinde aşağıdaki adımları (adım 3.2'ye kadar) uygulayın. Doku parçası tüpün içine sığmayacak kadar büyükse, fazla dokuyu makasla kesin. Antikorların penetrasyonunu arttırmak için, önce dokuyu 1 saat boyunca oda sıcaklığında 2D çalkalayıcı (100 rpm) üzerinde PBS'de% 1 tritonluk (Triton X-100) 1 mL'lik bir permeabilite edin. Doku 3x'i PBS'de PBS'de 1 mL% 0,2 triton (Triton X-100) ile oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca oda sıcaklığında yıkayın.
  4. Spesifik olmayan antijenleri bloke etmek için, kokleae'yi oda sıcaklığında 1 saat boyunca oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2D çalkalayıcı (100 rpm) üzerinde 1 mL bloke edici çözelti (% 3 sığır serum albümini [BSA], % 0.2 triton, PBS'de) inkübe edin.
    NOT: Blokaj çözeltisi önceden hazırlanabilir, ancak ~ 10 günden daha eski olmamalıdır.
  5. Aşağıdaki birincil antikorları, bloke edici çözeltinin aynı alikotunda taze olarak seyreltin: IHC'leri (IgG poliklonal tavşan) etiketlemek için anti-myoVIIa (miyozin VIIa), seyreltilmiş 1:400; presinaptik şeritleri (IgG1 monoklonal fare) etiketlemek için anti-CtBP2 (C-terminal bağlayıcı protein 2), seyreltilmiş 1:400; ve postsinaptik reseptör yamalarını (IgG2a monoklonal fare) etiketlemek için anti-GluA2, seyreltilmiş 1:200. Kokleaların antikor çözeltisi (tipik olarak 0,4 mL) ile tamamen kaplandığından emin olun ve 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  6. Daha sonra, 5x mendili PBS'de% 0,2 triton ile oda sıcaklığında 2D çalkalayıcıda (100 rpm) her biri 5 dakika yıkayın. Birincil meslektaşlarının konakçı türlerine uyacak ikincil antikorları seçin ve PBS'de% 3 BSA,% 0.2 tritonda taze olarak seyreltin: keçi anti-fare (IgG1)-Alexa florofor (AF) 488, seyreltilmiş 1: 1.000; keçi anti-fare (IgG2a)-AF568, seyreltilmiş 1:500; ve eşek anti-tavşan-AF647 (IgG), seyreltilmiş 1:1.000. Floresanın ağartılmasını önlemek için tüpü alüminyum folyoya sarın. Kokleaları 24 saat boyunca 37 °C'de 0,4 mL ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin.
    NOT: Sınırlı sayıda çalışma, koklear dokunun 37 °C'de 24 saat boyunca primer ve sekonder antikorlarla inkübasyonunun, daha düşük sıcaklıklara ve daha kısa sürelere sahip daha yaygın inkübasyon prosedürünü izlemekten daha parlak immün boyama ile sonuçlandığını göstermiştir.
  7. Kokleayı 2x'i PBS'de 1 mL'lik %0,2 tritonla oda sıcaklığında 5 dakika ve PBS ile 3x'i 5 dakika boyunca 2D çalkalayıcıda (100 rpm) yıkayın.
    NOT: Bu yıkama adımlarından sonra, koklealar buzdolabında ~4 °C'de birkaç gün boyunca PBS'de kalabilir.

3. Otofloresan söndürücü ile tedavi (isteğe bağlı)

NOT: Orta yaşlı ve yaşlı gerbillerden elde edilen kokleae, geniş arka plan otofloresansı gösterir. Genç yetişkin dokuda, otofloresan söndürücü ile tedavi gerekli değildir. Prensip olarak, otofloresan söndürücüyü immün boyama prosedüründen önce uygulamak mümkündür, bu da istenen antikor floresansının yanlışlıkla azaltılmasını önler. Bununla birlikte, üreticinin veri sayfasına göre, deterjanların (mevcut protokoldeki Triton X-100 gibi) kullanımı, söndürücüyü dokudan çıkardıkları için artık mümkün değildir.

  1. Kokleae'yi, adım 4.2'de açıklandığı gibi bir stereomikroskop altında ikiye bölün.
  2. %5'lik bir çözelti elde etmek için otofloresan söndürücüyü %70 etanol ile karıştırın ve kokleaları bu çözelti içinde oda sıcaklığında 2D çalkalayıcı üzerinde 1 dakika boyunca inkübe edin. Kokleayı 3x, oda sıcaklığında 2D çalkalayıcıda 1 mL PBS ile her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
    DİKKAT: Otofloresan söndürücü tehlikeli ve zararlıdır. Bu maddeyi kullanırken eldiven giyin.

4. Son ince diseksiyon

  1. Kokleayı stereomikroskop altında inceleyin. Bir polistirrol Petri kabını ve kapağını PBS ile doldurun ve iki ince forseps, Vannas yaylı makas, bir bıçak tutucu ve kırılabilir bir tıraş bıçağını elinizin altında bulundurun. Diseksiyon adımına bağlı olarak ~ 2-4 mm'lik bir kesme yüzeyi elde etmek için tıraş bıçağından parçaları kırın. Üst üste üç damla montaj ortamı yerleştirerek bir mikroskop slaytı hazırlayın.
    NOT: Jilet bıçağının kesme yüzeyi hızla yıpranır. Bıçak, kokleanın yaklaşık her ikinci parçası diseke edildikten ve monte edildikten sonra değiştirilmelidir.
  2. Adım 3.1'de henüz yapılmadıysa, önce kokleayı bir stereomikroskop altında modiolus boyunca ikiye bölün. Bunun için, kokleanın sarmal uzunluğundan daha uzun bir tıraş bıçağı parçasını bir bıçak tutucuya yerleştirin. Kokleayı Petri kabına yerleştirin ve fazla dokuyu tıraş bıçağı parçasıyla kesin. Kokleayı ince forseps ile yerinde tutun ve modiolus boyunca ikiye bölün.
  3. Bir yarısı ile başlayın, ancak diğer yarısını da Petri kabında bırakın. Koklear yarısını, kesici kenar yukarı bakacak şekilde forseps ile dikkatlice sabitleyin. Kokleanın kemiğini helikotremanın üzerinde kesmek ve tepeyi kaplayan ince yaylı makas kullanın.
  4. Koklear parçaların ayrılmasına başlamak için, orta dönüşü modiolus ve işitme siniri boyunca, yukarıda (scala vestibuli) ve aşağıda (scala timpani) makasla keserek izole edin.
  5. Koklear kanal içindeki stria vascularis'i kaplayan koklear kemiği kesin. Koklear kemiğin her iki tarafında Corti organının üzerinde ve stria vascularis boyunca iki kesik yapın ve sonunda koklear parçaları ayırmak için jilet bıçağını kullanın.
    NOT: Stria vascularis koyu bir şerit olarak kolayca görülebilir. Stria vascularis boyunca kesmek, Corti'nin organını sağlam bırakır.
  6. İsteğe bağlı: Stria vascularis'i toplamak için, ikisini ayırmak için Corti organı ile stria vascularis arasında dikkatlice kesin. Stria vascularis'i spiral ligamente bağlı bırakın (kokleanın dış yüzeyini kaplayan kemiğe tutturulmuş) ve forseps kullanarak kireçsizleştirilmiş kemiği çıkarın. Parçayı stria tarafı yukarı bakacak şekilde mikroskop sürgüsüne bir damla montaj ortamına yerleştirin.
    NOT: Toplanan parça çok güçlü bir şekilde kavisliyse, kızağa monte edilebilecek kadar düz olması için daha küçük parçalara bölünmesi gerekebilir.
  7. Koklear parçaları polistirrol Petri kabının PBS dolgulu kapağına aktararak koklear tüm montajların kızak üzerinde mümkün olduğunca düz durmasını sağlar. Aternal taraftaki spiral ligamentin parçaları ve nöral taraftaki spiral limbusun parçaları gibi fazla dokuyu çıkarın. Tektoryal zarı süper ince forsepslerle dikkatlice çıkarın.
  8. Koklear parçaları kızağın üzerine bir damla montaj ortamına yerleştirin. Koklear tüm montaj aparatlarını, görüntüleme için optik yoldaki IHC'lerin gizlenmesini önlemek için Corti'nin organı yukarı bakacak şekilde slaytın üzerine yerleştirin. Spiral limbusun IHC'lere yakın bir yerde invaginasyonunu arayın; bu, koklear parçanın yukarı bakacak tarafı tanımlamak için sagital düzleme kaydırılmasıyla görülebilir.
    NOT: Daha sonraki işlemler sırasında kokleanın tamamını ayrı parçalarından dijital olarak yeniden yapılandırmak için, parçaların eskizlerinin belgelenmesi ve yer işaretlerinin not edilmesi önemle tavsiye edilir. Ayrıca, parçalar ideal olarak slayt üzerinde doğru sırada düzenlenmelidir.
  9. Tüm koklea mikroskop slaydına aktarılana kadar 4.3 ile 4.8 arasındaki adımları tekrarlayın. Gerekirse, daha fazla montaj ortamı ekleyin, slaytı örtün ve kapak kaymasını kenarların etrafına boyanmış siyah oje ile yerine kapatın. Oda sıcaklığında karanlıkta kurumasını bekleyin ve ardından slaytı karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
    NOT: Duyusal epitelin parçaları yanlışlıkla kaybolsa bile, doğru uzunluk tahmini için koklear parçadan geriye kalanları monte etmek önemlidir.

5. Koklear uzunluk ölçümü

  1. Kokleanın uzunluğunu, bir epi-floresan mikroskop sistemi ve ilgili yazılımı kullanarak parçalarının parlak alan görüntülerinden ölçün. Her koklear parçadan düşük büyütmeli görüntüleri (4x lens) kaydedin ve görüntülerin her birinde IHC sırası boyunca bir çizgi çizmek için mikroskop yazılımının kement ölçüm aracını kullanın. Tüm parçaların uzunluklarını ekleyerek toplam uzunluğu hesaplayın.
    NOT: Bir koklear parça içinde duyusal epitelin parçaları eksik olduğunda, çizgiyi interpolasyon yapın.
  2. Tek bir kokleada analiz edilmesi gereken koklear konumları tanımlamak için, Müller25 tarafından verilen denklemi kullanarak tepeden karşılık gelen mesafelerini hesaplayın. Bu konumları, örneğin, koklear parçalarının çıktısında işaretleyin.

6. Konfokal mikroskopla görüntü toplama

  1. Yağa daldırma 40x hedefi (sayısal diyafram açıklığı 1.3) ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun yağ içeren bir konfokal mikroskop kullanın.
    NOT: Konfokal mikroskopta ters çevrilmiş bir ışık yolu varsa, slayt baş aşağı konumlandırılmalıdır. Bu durumda, son taramaya başlamadan önce numuneye batması ve kapak kapağı üzerinde sabit bir şekilde dinlenmesi için yaklaşık 30 dakika verin. Alternatif olarak, diseksiyon süresi boyunca akışkan olan, ancak daha sonra katılaşan ve aynı anda floresanı koruyan bir montaj ortamı kullanın.
  2. Uygun lazerleri etkinleştirin: Bu protokolde λ = 488 nm ve λ = 522 nm dalga boylarına sahip optik olarak pompalanan iki yarı iletken lazer ve λ = 638 nm dalga boyuna sahip bir diyot lazer kullanılır. Floresan etiketlerinin emisyon aralığını seçin (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Hibrit bir dedektör salınan fotonları sayarken, lazer çizgisini emisyon eğrisinden en az 10 nm uzağa yerleştirin.
    NOT: Seçilen dedektör bant genişliklerinin renk kanallarını temiz bir şekilde ayırdığından emin olmak için tek etiketli doku ile ön kontrollerin yapılması önemlidir (yani, kanal çapraz konuşmasına yol açmaz). Radyo dalgaları hibrid dedektöre müdahale ederek maksimum foton sayısına neden olur ve böylece yığında artefakt çizgilere neden olur. Bu nedenle, mikroskop yakınında bir cep telefonu kullanmaktan kaçının.
  3. Görüntü 10 IHC'ye yayılana kadar dokuyu yakınlaştırın. Görüntünün çözünürlüğünü, tipik olarak ~ 40-60 nm / piksel olan Nyquist örneklemesine göre seçin. Z yönündeki adım boyutunu 0,3 μm'ye ve görüntüleme hızını 400-700 Hz'e ayarlayın.
    NOT: Her iki ayar da (adım boyutu ve görüntüleme hızı), optimum görüntüleme parametrelerinin kullanılması ile tarama süresinden tasarruf edilmesi arasında ödün verilmesidir.
  4. Görüntüleme süresini kısaltmak için çift yönlü örnekleme gerçekleştirin. 488 nm ve 638 nm kanal 3x ve 522 nm kanal 6x için çerçeveyi biriktirin; Ayrıca, her kanal için satırların ortalaması 3 kattır. z boyutunda yığının başlangıcını ve sonunu seçin.
  5. Sinyal-gürültü oranının azalmasını önlemek için hibrit dedektörü (sayma modu) kullanırken kazancı 100'e ayarlayın. Lazer gücünü, ilgilenilen bölgede hiçbir pikselin doygun kalmayacağı, ancak yapıların çoğunlukla tam 8 bit aralığını kapsayacak şekilde ayarlayın. % 0,5'lik düşük bir lazer gücüyle başlayın ve yapılar görünene kadar artırın.
    NOT: İyi boyama tipik olarak %0,1 ile %5 arasında bir lazer gücüne ihtiyaç duyar.
  6. Teorik bir nokta yayılma işlevi kullanarak küçük floresan yapıların etrafındaki bulanık haleyi gidermek için görüntü yığınlarının post hoc işlenmesi için dekonvolüsyon yazılımı kullanın. Bir denemedeki her yığın için aynı ayarları kullanın. Çözülmüş görüntüleri .tif veya .ics olarak kaydedin.
    NOT: myoVIIa-etiketi (IHC'ler) dekonvolüsyondan fayda sağlamaz ve zaman kazanmak için atlanabilir. Yazılım, görüntü dosyalarının meta verilerini kullanır; ancak, ışık yolu, gömme ortamı veya daldırma ortamı gibi çeşitli parametrelerin belirtilmesi gerekir.

7. Sinaps niceliği

  1. Serbestçe erişilebilen yazılım ImageJ'de, web sitelerinde de bulunan ek Biovoxxel-eklentisi ile deconvolved yığınlarının bir kopyasını açın.
  2. Kanalları bölerek tek tek kanalların renklerini ayarlama (Görüntü | Renk | Kanalları Bölme) ve birleştirme (Resim | Renk | Kanalları Birleştir) farklı renkler atayarak tekrar onları yeniden adlandırır. Görüntüyü RGB yığınına dönüştürme (Görüntü | Renk | RGB'ye yığınlayın) ve parlaklığı ve karşıtlığı ayarlayın (Görüntü | | ayarlama Parlaklık/Kontrast | Gerekirse Otomatik veya Maksimum ile ilgili kaydırıcı), böylece ön ve son sinaptik yapılar ve IHC etiketi arka plandan hoş bir şekilde farklıdır.
  3. Beş IHC seçin ve yığın içinde istediğiniz konuma tıklayarak bunları metin aracıyla (IHC1-IHC5) etiketleyin. Yatırım getirisi yöneticisini açın (Analiz | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi); noktaları bir sayı ile etiketlemek için Etiketler onay kutusunu etkinleştirin. İlgilendiğiniz IHC'yi yakınlaştırın.
  4. Nokta/çok noktalı aracını çok noktalı modda kullanın (nokta veya çok noktalı mod arasında seçim yapmak için araca sağ tıklayın). Z-boyutunda gezinirken işlevsel bir şerit sinapsına (yani, postsinaptik glutamat yamasıyla yakın yan yana duran bir presinaptik şerit) tıklayın.
    NOT: Örtüşme miktarlarına ve her kanal için seçilen renge bağlı olarak, paylaşılan pikseller karışık renkte görünür. Genellikle, bireysel fonksiyonel sinapslar arasındaki ayrım basittir, çünkü birbirlerinden yeterince uzaktırlar.
  5. İlgilenilen tüm yapılar işaretlendiğinde, YG yöneticisinin grafik kullanıcı arayüzünde Ekle'yi tıklayın. Rastgele ada tıklayın ve Yeniden Adlandır'ı seçin.
    NOT: Nokta aracı seçenekleri menüsünde Tümünü göster onay kutusu seçildiğinde (nokta aracı simgesini çift tıklatın), aynı şerit sinapsının birden çok kez sayılmasını önlemeye yardımcı olan nokta etiketleri yığının tüm düzlemlerinde kalmaya devam eder.
  6. Sayılacak bir sonraki IHC'yi seçerken, görüntüyü el aletiyle bir sonraki İHC'yi tam olarak görüntüleyecek şekilde ayarlayarak yanlışlıkla sayım eklemekten kaçının. Önceden depolanan verilere daha fazla puncta eklemekten kaçınmak için çok noktalı araçtan nokta aracına geçin. Bir sonraki IHC'de ilgilenilen bir yapıya tıklayın ve çok noktalı araca geri dönün. İlgilenilen tüm IHC'ler değerlendirilene kadar 7,4 ile 7,5 arasındaki adımları yineleyin.
  7. Verileri kaydetmek için, YG yöneticisinde bir veri kümesine ve ardından ölçü'ye tıklayın. Ölçülen veri noktalarını listeleyen yeni bir pencerenin görünmesini bekleyin. Bu listeyi elektronik tablo dosyası olarak kaydetme (Dosya | Farklı kaydet). YG yöneticisinde Tümünü Göster'i etkinleştirerek görüntüyü kaydedin. Nokta etiketlerini yığına kalıcı olarak eklemek için Düzleştir'e tıklayın. Görüntü yığınını kapatırken, değişiklikleri kaydetmeyi kabul edin .

8. Sinaps hacminin analizi ve saç hücresi üzerindeki konumu

NOT: Yazarlar Matlab'a dayanan özel programlanmış bir prosedür kullanmışlardır. Kamuya açık olmadığından, burada yalnızca geniş terimlerle özetlenmiştir (ayrıca bkz.7). Kullanmak istiyorsanız lütfen ilgili yazarla iletişime geçin. Prosedür, giriş olarak TIFF formatında üçlü etiketli (IHC'ler, öncesi ve sonrasısinaptik) bir görüntü yığını bekler, kullanıcıyı grafik bir arayüz aracılığıyla çeşitli analiz adımlarında yönlendirir ve sonuçların elektronik tablo biçiminde kapsamlı çıktısını sağlar.

  1. Sinaptik yapıların konumunu, bireysel IHC'nin sütun-modiolar eksen ve koklear apikal-bazal eksen ve IHC'nin üst (kütiküler plaka) ila alt (sinaptik kutup) ekseni üzerindeki kapsamı tarafından tanımlanan bir 3D koordinat sistemine normalleştirin.
    NOT: Sinaptik elemanların hacimleri (hem sinaptik öncesi hem de sonrası ve fonksiyonel sinapsların birleşik hacmi) μm 3 cinsinden sağlanır ve ilgili medyan değer3'e normalleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kokleae, kardiyovasküler perfüzyondan sonra ya tüm hayvanın fiksatif ile hasat edildi ya da hayvanı ötenazi yaptıktan ve daldırma ile sabitlendikten sonra hızla diseke edildi. İkinci yöntemle, IHC'ler diseksiyon sırasında yerinde kalırken, başarısız perfüzyon ve dolayısıyla yetersiz sabit doku durumlarında, duyusal epitel sıklıkla tahrip olmuştur. Yazarların, transkardiyal perfüzyondan sonra kokleaların fiksasyonunun yetersiz olduğu, beynin fiksasyonunun hala yeterli olduğu vakalarla karşılaştıklarını unutmayın. İnferior...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde özetlenen yöntemle, koklealardaki IHC'leri ve sinaptik yapıları genç yetişkin ve yaşlı gerbillerden immüno-etiketlemek, sinaptik öncesi ve sonrası elemanların birlikte lokalizasyonu ile varsayılan fonksiyonel sinapsları tanımlamak, bunları bireysel İHC'lere tahsis etmek ve sayılarını, hacimlerini ve konumlarını ölçmek mümkündür. Bu yaklaşımda kullanılan antikorlar ayrıca dış saç hücrelerini (OHC'ler; myoVIIa) ve presinaptik şeritlerini de etiketledi. Ayrıca, hem IHC'lerin hem de OHC'lerin immüno-etiketlenme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Lichun Zhang'a yöntemin kurulmasına yardımcı olduğu için ve görüntüleme tesislerinin kullanımı için Oldenburg Carl von Ossietzky Üniversitesi, Floresan Mikroskopi Hizmet Birimi'ne teşekkür eder. Bu araştırma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi -EXC 2177/1 kapsamında finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Albümin Fraksiyonu V biyotin içermeyenCarl Roth0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoklonal fare)BD Biosciences, Eysins612044
anti-GluA2 (IgG2a monoklonal fare)MilliporeMAB39
anti-fare (IgG1)-AF 488Moleküler Problar A.Ş.A21121
anti-MiyozinVIIa (IgG poliklonal tavşan)Proteus Biosciences25e6790
Bıçak Tutucu & Kırıcı - Düz ÇenelerGüzel Bilim Aletleri10052-11
Bonn Arter Makası - Top UcuGüzel Bilim Aletleri14086-09
Lamel kalınlığı 1.5H, 24 x 60 mmCarl RothLH26.1
Tek Kullanımlık Cerrahi BıçakHenry Schein0473
eşek anti-tavşan (IgG)-AF647Yaşam Teknolojileri-Moleküler ProblarA-31573
Dumont #5 - İnce ForsepsGüzel Bilim Araçları11254-20
Dumont #5SF ForsepsGüzel Bilim Araçları11252-00
Etanol, mutlak% 99.8Fisher Scientific12468750
Etilendiamintetraasetik asitCarl Roth8040.2
ExcelMicrosoft Corporation
Tüyü Çift Kenarlı BıçakPLANO112-9
G19 KanülHenry Schein9003633
keçi anti-fare (IgG2a)-AF568InvitrogenA-21134
HeparinRatiopharmN68542.04
Huygens EssentialsBilimsel Hacim Görüntüleme
ImageJFiji
Immersol, Daldırma yağı 518FCarl Zeiss10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)Braun4062957E
ISM596DIsmatecperistaltik pompa
KL 1600 LEDSchott150.600stereomikroskop için ışık kaynağı
Leica Uygulama paketi XLeica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 sistemiLeica Microsystem CMS GmbH
MatlabMathworks Inc.
Mayo Makas Tungston Karbür ToghCutİnce Bilim Araçları14512-17
Mini-100 Orbital-GenieScientific IndustriesSI-M100soğuk ortamda kullanım için
Narcoren (pentobarbital)Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-EiNikon
NIS ElementsNikon Europe B.V.
ParaformaldehitCarl Roth0335.3
Havalandırma delikleri olmayan petri kabıAvantor VWR390-1375
Fosfat tamponlu tuzlu su:
Disodyum fosfatAppliChemA1046
Monopotasyum fosfatCarl Roth3904.1
Potasyum klorürCarl Roth6781.1
Sodyum klorürSigma Aldrich31434-M
Vidalı Kapaklı KaplarSarstedt75.562.300
Sodyum azidCarl RothK305.1
Öğrenci Adson ForsepsGüzel Bilim Araçları91106-12
Öğrenci Halsted-Sivrisinek HemostatGüzel Bilim Araçları91308-12
Superfrost Yapışma Mikroskobu SlaytlarıEprediaJ1800AMNZ
Triton  XCarl Roth3051.2
TrueBlack Lipofuscin Otofloresan SöndürücüBiotium23007
Vannas Yaylı Makası, 3mmİnce Bilim Araçları15000-00
Vectashield Antifade Montaj OrtamıVektör LaboratuvarlarıH-1000
Vibrax VXR basicIKA0002819000
VX 7 Çanak ataşmanı Vibrax VXR basicIKA953300
Wild TYP 355110 (Stereomikroskop)Wild Heerbruggartık kullanılamıyor

Kaynaklar

  1. Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
  2. Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
  3. Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
  4. Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
  5. Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
  6. Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
  7. Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
  8. Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
  9. Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
  10. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  11. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  12. Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
  13. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).
  14. Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933(2020).
  15. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  16. Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
  17. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  18. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  19. Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).
  20. Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).
  21. Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
  22. Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
  23. Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
  24. Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  25. Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).
  28. Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).
  29. Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).
  30. Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
  31. Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
  32. Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).
  33. Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).
  34. Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
  35. Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Şerit Sinaps SayımıKoklea İmmünlekelemeGerbil KokleasıYaşa Bağlı İşitme Kaybıİç Kıl HücreleriKonfokal GörüntülemeOtofloresans SöndürücüKoklear DiseksiyonImageJ AnaliziSinaptik Kantifikasyon
Genç Yetişkin ve Yaşlı Gerbil Cochleae'de İmmünoetiketleme ve Şerit Sinapslarının Sayılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.