Septinler sitoiskelet proteinleridir. Lipid membranlarla etkileşime girerler ve mikron ölçeğinde membran eğriliğini algılayabilir ancak aynı zamanda üretebilirler. Bu protokolde membran deformasyonlarını, eğriliğe duyarlı septin bağlanmasını ve septin filament ultrayapısını analiz etmek için aşağıdan yukarıya in vitro metodolojileri tanımladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Septinlerin Ultrayapısal Organizasyonunu, Membran Yeniden Şekillendirmesini ve Eğrilik Duyarlılığı Davranışını Analiz Etmek için Aşağıdan Yukarıya In Vitro Yöntemler
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Membran yeniden şekillenmesi plazma zarında ve hücresel organellerde sürekli olarak gerçekleşir. Çevrenin rolünü (iyonik koşullar, protein ve lipit bileşimleri, membran eğriliği) ve spesifik membran yeniden şekillendirme süreçleriyle ilişkili farklı ortakları tam olarak incelemek için, in vitro aşağıdan yukarıya yaklaşımlar benimsiyoruz. Son yıllarda, septin proteinlerinin büyük hastalıklarla ilişkili rolünü ortaya çıkarmaya büyük ilgi duyulmaktadır. Septinler, plazma zarı ile etkileşime giren esansiyel ve her yerde bulunan sitoiskelet proteinleridir. Diğer fonksiyonların yanı sıra hücre bölünmesi, hücre hareketliliği, nöro-morfogenez ve spermiogenezde rol oynarlar. Bu nedenle, septinlerin membranlarda nasıl etkileşime girdiğini ve daha sonra membran deformasyonlarını indüklemek için nasıl organize olduklarını ve spesifik membran eğriliklerine nasıl duyarlı olabileceklerini anlamak önemlidir. Bu makale, septinlerin moleküler düzeyde ultra yapısı ile mikron ölçeğinde meydana gelen membran yeniden şekillenmesi arasındaki etkileşimi deşifre etmeyi amaçlamaktadır. Bu amaçla, tomurcuklanan maya ve memeli septin kompleksleri rekombinant olarak eksprese edildi ve saflaştırıldı. Daha sonra membrandaki septinlerin kendi kendine montajını analiz etmek için in vitro testlerin bir kombinasyonu kullanıldı. Desteklenen lipit çift katmanları (SLB'ler), dev unilamellar veziküller (GUV'lar), büyük unilamellar veziküller (LUV'ler) ve dalgalı substratlar, septinin kendi kendine montajı, membran yeniden şekillendirme ve membran eğriliği arasındaki etkileşimi incelemek için kullanıldı.
Giriş
Septinler, lipid membranları ile etkileşime giren sitoiskelet filament oluşturan proteinlerdir. Septinler ökaryotlarda her yerde bulunur ve çok sayıda hücresel fonksiyon için gereklidir. Tomurcuklanan maya ve memelilerde hücre bölünmesinin ana düzenleyicileri olarak tanımlanmışlardır 1,2. Membran yeniden şekillendirme olaylarında, siliyogenez3'te ve spermiyogenez4'te rol oynarlar. Memeli hücrelerinde, septinler ayrıca Rho GTPazların (BORG) bağımlı bir şekilde 8 bağlayıcısında aktin ve mikrotübüller5,6,7 i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Dev unilamellar veziküller (GUV'ler) kullanılarak membran yeniden şekillendirmenin belirlenmesi
NOT: Bu bölümde, hücresel bağlamda septinler tarafından indüklenmesi muhtemel membran deformasyonlarını taklit etmek için GUV'lar üretilmektedir. Gerçekten de, hücrelerde, septinler sıklıkla mikrometre eğrilikleri olan bölgelerde bulunur. GUV'lar birkaç ila onlarca mikrometre arasında değişen boyutlara sahiptir ve deforme olabilir. Bu nedenle, mikrometre ölçeğinde septin kaynaklı deformasyonları analiz etmek için uygundurlar. Floresan lipitlerin yanı sıra floresan etiketli septinler (Yeşil Floresan Protein [GFP] kullanılarak), f....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
GUV'ların deformasyonları
Septinlerle inkübe edildikten sonra yeniden şekillenen GUV'ların tipik konfokal floresan görüntüleri, septinlerin polimerize olduğu koşullarda Şekil 3'te gösterilmiştir. Çıplak GUV'lar (Şekil 3A) mükemmel bir şekilde küreseldi. 50 nM'den fazla tomurcuklanan maya septin filamentleri ile inkübasyon üzerine, veziküller deforme olmuş olarak ortaya çıktı. 100 nM tomurcuklanan maya septin oktamer konsantrasyonuna kadar, ve.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıda belirtildiği gibi, lipid çift katmanı içinde PI (4,5) P2 ilişkisini artıran ve böylece septin-membran etkileşimlerini kolaylaştıran bir lipit karışımı kullanılmıştır. Gerçekten de,25 başka bir yerde, tomurcuklanan maya septinlerinin veziküllerle PI (4,5) P2'ye özgü bir şekilde etkileşime girdiğini gösterdik. Bu lipit bileşimi, çoklu kompozisyonların taranmasından ampirik olarak ayarlanmıştır ve şimdi yazarlar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. PI(4,5)P2<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Patricia Bassereau ve Daniel Lévy'ye yararlı tavsiyeleri ve tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 projesini ve "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01 projesini finanse etmek için ANR'nin (Agence Nationale de la Recherche) desteğinden yararlandı. B. Chauvin Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" ve Fondation pour lea Recherche Médicele tarafından finanse edilmektedir. K. Nakazawa, Sorbonne Université (AAP Emergence) tarafından desteklendi. G.H. Koenderink, Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) tarafından 'BaSyC-Building a Synthetic Cell' aracılığıyla desteklendi. Y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin | Avanti Polar Lipidler | 850725 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin | Avanti Polar Lipidler | 840035 | |
| Banyo sonikatörü | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Seramid | invitrojen, Thermo Fischer bilimsel | 11504726 | |
| Kimyasallar: NaCl, Tris-HCl, sakaroz, KCl, MgCl2, B-kazein, kloroform, sodyum kakodilat, tanik asit, etanol | Sigma Aldrich | ||
| Konfokal mikroskop | nikon | eğirme diski veya konfokal | |
| Kritik nokta kurutucu | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deiyonize su jeneratörü | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Yumurta L-&alfa;- fosfatidilkolin | Avanti Polar Lipidler | 840051 | |
| Alan Emisyon Tabancası SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Gluteraldehit %25, sulu çözelti | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| Yüksek vakumlu gres, Dow corning | VWR | ||
| IMOD yazılım | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | Eğimli seri görüntü hizalama ve 3D rekonstrüksiyon için yazılım paketi | |
| Lacey Formvar/karbon elektron mikroskobu ızgaraları | Eloise | 01883-F | |
| Lipidler | Avanti Polar Lipidler | ||
| L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfat | Avanti Polar Lipidler | 840046 | |
| Metal evaporatör | Leica mikrosistemleri | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optik Yapıştırıcılar), NOA 71 ve NOA 81 | Norland Ürünleri | NOA71, NOA81 | |
| Osmiyum tetraoksid% 4 | delta mikroskopileri | 19170 | |
| Ozmometre | L & ouml; ser | 15 M | |
| Plazma temizleyici | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plazma jeneratörü | Elektron Mikroskobu Bilim | ||
| Daldırmalı dondurma ekipmanları | leica microsystems | EMGP | |
| Transmisyon elektron mikroskobu | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranil asetat | Elektron Mikroskobu Bilimi | 22451 | bu ürün artık satın alınamaz |
| Balmumu plakaları, Vitrex | VWR |
Kaynaklar
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto se....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
