Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

Summary

Basit aktin filament mikroakışkan tahlilleri için, floresan mikroskobu ile birlikte, bireysel aktin filamentlerini gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlemeyi ve sırayla farklı protein çözeltilerine maruz bırakmayı sağlayan protokoller sunuyoruz.

Abstract

Aktin filamentlerinin montajını ve sökülmesini düzenleyen karmaşık moleküler mekanizmaları deşifre etmek için, iyi kontrol edilen koşullarda yaşayan bireysel reaksiyonları izlemek büyük bir varlıktır. Bunu yapmak için, son 20 yılda, çoğunlukla toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak canlı tek filament deneyleri ortaya çıkmış ve bir dizi önemli sonuç sağlamıştır. 2011 yılında, bu deneylerin olanaklarını daha da genişletmek ve tekrarlayan sorunlu eserlerden kaçınmak için, bu testlere basit mikroakışkanlar getirdik. Bu çalışma, bireysel aktin filamentlerinin pasifleştirilmiş örtü kayma yüzeyine bir ucuyla tutturulduğu, akışla hizalandığı ve farklı protein çözeltilerine art arda maruz bırakılabildiği temel protokolümüzü detaylandırmaktadır. Ayrıca belirli uygulamalar için protokolleri sunuyoruz ve akan çözeltinin viskoz sürtünmesi sayesinde kontrollü mekanik kuvvetlerin nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Bu deneylerin teknik uyarılarını vurguluyoruz ve bu tekniğe dayanan olası gelişmeleri kısaca sunuyoruz. Bu protokoller ve açıklamalar, günümüzde kullanımı kolay mikroakışkan ekipmanlarının mevcudiyeti ile birlikte, uzman olmayanların bu testi laboratuvarlarında uygulamalarına izin vermelidir.

Introduction

Aktin filamentlerinin ve aktin filament ağlarının montajı ve sökülmesi, çeşitli biyokimyasal reaksiyonlarla kontrol edilir ve mekanik bağlama bağlıdır. Bu karmaşık mekanizmalar hakkında fikir edinmek için, bireysel filamentler üzerindeki bireysel reaksiyonları (yeterince büyük sayılarda) gözlemleyebilmek paha biçilmezdir. Son yıllarda, dinamik aktin filamentlerinin gerçek zamanlı olarak, çoğunlukla toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak gözlemlenmesi, anahtar bir teknik olarak ortaya çıkmış ve toplu çözelti biyokimyasal tahlilleri ile elde edilemeyen sonuçların etkileyici bir listesini sağlamıştır¹.

Protocol

1. Mikroakışkan oda hazırlığı

1. Birkaç hazne desenine sahip bir SU-8 ana kalıp seçin. Tipik odalar, 20 μm yüksekliğinde ve 800 μm genişliğinde üç giriş ve bir çıkış ile çapraz şekillidir (Şekil 1). Bu tür ana kalıplar harici şirketlerden satın alınabilir veya akademik laboratuvarlarda yapılabilir (örneğin, Gicquel, Y. ve ^ark.5).
2. Bandı kalıbın kenarına yerleştirin.
   1. ~50 cm uzunluğunda, 19 mm genişliğinde, standart şeffaf ofis bandını (bkz. Malzeme Tablosu) yapışkan tarafı yukarı doğru bir tezgahın üzerine koyun. Kalıbı dikey olarak bir uca ve bandın orta çiz....

Results

Yukarıda açıklanan tüm deneyler için, floresan olarak etiketlenmiş aktin filamentleri, yüzeyden düşük arka plan floresansının göstergesi olan iyi kontrastla açıkça görülebilmelidir (Şekil 4, yaygın sorunların giderilmesi için Ek Dosya 1'e bakınız). Aktin filamentleri de yüzeye yapışmamalıdır: baskın akış hızı düşük olduğunda, aktin filamentlerinin yanal dalgalanmaları, onları canlı olarak gözlemlerken algılanabilir olmalı ve birinin sadece uçlarından biri tarafından demirlen.......

Discussion

Aktin filamentlerinin uzunlukları boyunca birden fazla nokta ile yüzeye tutturulduğu veya metilselüloz gibi bir kalabalık ajan tarafından yüzeye yakın tutulduğu standart tek filament yöntemleriyle karşılaştırıldığında, mikroakışkanlar bir dizi avantaj sunar. Yüzeyle etkileşimler minimum olduğundan, bu etkileşimlerin hem uzama hem de depolimerizasyon sırasında neden olabileceği yapay duraklamalardan kaçınılır. Filamentler, birbirlerine paralel olarak akış tarafından hizalanır, izlenmelerini ve uzunluklarının ölçülmesini k.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Kazein	Merck	C6905	8 mg / mL'de kullanılır
Biyopsi zımbası (pistonlu)	Ted Pella	15115-2	ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
Biotin-BSA	Merck	A8549	1 mg / mL'de kullanılır
BSA	Merck	A8022	50 mg / mL'de kullanılır
Mini-Rack Teflon tutucu	Invitrogen	C14784	8 için lameller
Lameller 22x40mm Kalınlık #1.5	Menzel Glä ser	631-1370
f-tamponunda	DABCO	Merck	D27802
DTT	Euromedex	EU0006-D	f-tamponunda
bileşen Ester NHS Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	Lys328 üzerinde aktin etiketlemesi için florofor.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	21338	Lys328
Hellmanex III Hellma		9-307-011-4-507	Cam temizleme deterjanı
ImageJ	NIH	N/	A açık kaynaklı yazılım
Laboport	KNF	811kn.18	vakum pompası (nihai vakum: 240 mbar)
Sihirli görünmez bant	Scotch	7100024666	standart şeffaf ofis bandı
Micrewtube	Simport	T341-6T	2 mL mikroakışkan rezervuar tüpleri
Mikroakışkan cihaz Bölüm 1: Akış Ünitesi S	Fluigent	FLU-S-D-PCKB	Akış Ölçer
Mikroakışkan cihaz Bölüm 2: Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	Rezervuar tutucu
Mikroakışkan cihaz Bölüm 3: MFCS-EZ	Fluigent	EZ-11000001 EZ-00345001	Basınç kontrol cihazı
Model 42 - UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	Ultraviyole temizleyici
N6- (6-Aminoheksil) -ATP-ATTO-488	Jena Bioscience	NU-805-488	ATP-ATTO, aktin
nötravidinini	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)	PBS'de 1 mg / mL'de kullanın.
Polidimetilsiloksan (PDMS) Sylgard 184 Silikon Elastomer	Dow Corning	1673921	PDMS tabanı ve sertleştirici
içerir Polietereterketon (PEEK) boru	Merck		Z226661" Mavi" : İç Çap = 0.25 mm
Güvenlik üfleme tabancası	Bobin Hortumu Pnömatikler	700-S	filtrelenmiş hava
Silikon boru	VWR	228-0701P	PEEK'i kuplöre bağlayın
Paslanmaz çelik kateter kuplörü	Prime Bioscience	SC22/15	PEEK borularına bağlanmak için PDMS girişlerine ve çıkışına takılır
Termoplastik film	Sigma Aldrich	PM996	Standart "parafilm"
Ultra saf etanol	VWR	64-17-5
Ultrasonik temizleme banyosu	VWR	USC200TH	1 L beherleri yerleştirmek için
PDMS'nin veya çözeltilerin gazını almak için	vakumlu	SP Bel-Art	F42022-0000