Manyetik Nanopartikül Bazlı İmmünoassaylar için Kademeli Bir Kısıtlama ile Mikroakışkan Akrilik Cihazın Bilgisayar Sayısal Kontrol Mikrofrezelenmesi

Summary

Mikroakışkanlar, tanısal testlerin geliştirilmesi için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, pahalı ekipman ve malzemelerin yanı sıra zahmetli imalat ve taşıma teknikleri de sıklıkla gereklidir. Burada, manyetik mikro ve nanopartikül bazlı immünotahliller için akrilik bir mikroakışkan cihazın üretim protokolünü düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir ortamda detaylandırıyoruz.

Abstract

Mikroakışkan sistemler immünoassay tekniklerini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, birçok mikrofabrikasyon tekniği uzmanlaşmış, pahalı veya karmaşık ekipman gerektirir, bu da imalatın maliyetli olmasını ve düşük kaynak ortamlarında benimsenecek bakım noktası testlerinin (POCT) en önemli ön koşullarından biri olan seri üretimle uyumsuz olmasını sağlar. Bu çalışma, bilgisayarlı sayısal kontrol (CNC) mikrofrezeleme tekniğini kullanarak nanopartikül konjuge enzimatik immünoassay testi için bir akrilik (polimetilmetakrilat, PMMA) cihazının üretim sürecini açıklamaktadır. Mikroakışkan cihazın işleyişi, 100 nm manyetik nanopartiküllere konjuge edilmiş bir model antijen olarak lizozim kullanarak ticari bir antikoru tespit etmek için bir immünoassay yapılarak gösterilir. Bu cihaz, harici bir mıknatıs yerleştirerek manyetik bir tuzak oluşturan manyetik mikropartikülleri yakalamak için kullanılan, yalnızca 5 μm yüksekliğinde fiziksel kademeli bir kısıtlamayı bütünleştirir. Bu şekilde, konjuge nanopartiküllerin immün desteği üzerindeki manyetik kuvvet, onları yakalamak ve akış sürüklenmesine direnmek için yeterlidir. Bu mikroakışkan cihaz, immünoassay performansı için hassasiyet kaybı olmadan düşük maliyetli seri üretim için özellikle uygundur.

Introduction

Son yıllarda, mikroakışkanlar immünoassay tekniklerinde önemli bir rol oynamıştır¹. Minyatürleştirme teknolojisi, geleneksel immünotahlillere kıyasla daha az numune ve reaktif tüketimi, daha kısa inkübasyon süreleri, verimli çözelti değişimi ve daha yüksek entegrasyon^{ve otomasyon 2} gibi birçok olağanüstü avantaja sahiptir.

Ayrıca, immünotahlillerdeki mikroakışkan sistemler, immünodestek olarak manyetik nanopartiküllerle birlikte, inkübasyon sürelerini önemli ölçüde azaltır ve artan yüzey-hacim oranı nedeniyle yüksek algılama hassasiyeti elde eder³. Parçacıkların Brownian hareketi, antijen-antikor kompleksi ^4,5'in oluşumu sırasında reaksiyon kinetiğini geliştirir. Dahası, nanopartiküllerin manyetik özellikleri, farklı mikroakışkan cihaz konfigürasyonlarına entegre edilmek üzere çok yönlülük sağlar, bu da onları minyatür çip üstü biyosensing sistemlerinde sinyal ve molekül yakalama için ideal bir aday haline getirir⁵. Bununla birlikte, manyetik kuvvetler, yüksek yüzey-hacim oranı⁶ nedeniyle nanometre ölçeğinde sürükleme kuvvetlerinden önemli ölçüde daha zayıftır. Bu nedenle, yıkama ve algılama gibi önemli immünoassay adımları için nanopartiküllerin yakalanması zor olabilir ve geleneksel bir mıknatıs yetersizdir⁴.

Nanopartikülleri manipüle etmenin etkili bir yolu, mikroakışkan bir yapıda paketlenmiş demir mikropartikülleri tarafından oluşturulan mikroakışkan manyetik bir tuzağın kullanılmasıdır³. Bu nedenle, harici bir mıknatıs yaklaştığında, manyetik ve akı kuvvetleri arasında mıknatıslanmış gözenekli ortam içinde karmaşık bir etkileşim yaratılır. Nanopartiküllere etki eden manyetik kuvvet, onları yakalamak ve akış sürüklenmesine direnmek için yeterince güçlüdür ^3,4,7. Bu yaklaşım, mikropartikülleri tutan mikrometrik yapılar oluşturmak için birkaç mikrometre düzeyinde çözünürlükler elde eden mikrofabrikasyon teknikleri gerektirir.

Mevcut mikrofabrikasyon teknikleri, yapıların birkaç mikrondan yüzlerce nanometreye kadar yüksek çözünürlüklü imalatına izin verir⁸. Bununla birlikte, bu tekniklerin çoğu uzmanlaşmış, pahalı veya karmaşık ekipman gerektirir. Başlıca zorluklardan biri, pahalı ve zaman alıcı ^8,9 olan kalıp üretimi için temiz bir oda gereksinimidir. Son zamanlarda, mikroakışkan mühendisleri, azaltılmış maliyetler, daha hızlı geri dönüş süreleri, daha ucuz malzemeler ve aletler ve artan işlevsellik gibi çeşitli avantajlarla çeşitli alternatif imalat yöntemleri geliştirerek bu dezavantajı aşmışlardır⁸. Bu şekilde, yeni mikrofabrikasyon tekniklerinin geliştirilmesi, 10 μm^8'e kadar düşük çözünürlüklere ulaşan düşük maliyetli, temiz oda dışı yöntemler getirdi. Desenleme, pahalı bir kalıplama deseni oluşturmadan doğrudan bir substrat üzerinde kullanılabilir, böylece zaman alıcı bir işlemden kaçınılır. Doğrudan imalat yöntemleri arasında CNC frezeleme, lazer ablasyon ve doğrudan litografi^{8 bulunur}. Tüm bu yöntemler, sertliklerine bakılmaksızın çok çeşitli malzemelerde yüksek en boy oranına sahip kanallar üretmek için uygundur⁹, mikroakışkan cihazlarda yeni ve avantajlı geometriler, fiziksel davranışlar ve nitelikler^{sağlar 8}.

CNC mikro frezeleme, bir alt tabakadan dökme malzemeyi çıkaran kesici aletler kullanarak mikro ölçekli yapılar oluşturur ve mikroakışkan cihazlar için etkili bir imalat yöntemidir^10,11. Mikrofrezeleme tekniği, mikroakışkan uygulamalarda doğrudan çalışma yüzeyinde mikro kanallar ve özellikler oluşturmak için yararlı olabilir ve önemli bir avantaj sunar: bir iş parçası kısa sürede (30 dakikadan az) üretilebilir ve tasarımdan prototip^12'ye geri dönüş süresini önemli ölçüde azaltır. Ek olarak, farklı malzemelerden, boyutlardan ve şekillerden kesme aksesuarlarının geniş kullanılabilirliği, CNC freze makinelerini birçok düşük maliyetli tek kullanımlık malzeme türünde farklı özelliklerin üretilmesine izin veren uygun bir araç haline getirir¹³.

Mikrofrezelemede yaygın olarak kullanılan tüm malzemeler arasında, termoplastikler birçok olumlu özellikleri ve biyolojik uygulamalarla uyumluluğu nedeniyle lider bir seçim olmaya devam etmektedir^10,14. Termoplastikler, düşük maliyetli, tek kullanımlık analitik sistemler geliştirmek için önemli avantajları nedeniyle mikroakışkan sistemler için çekici bir substrattır⁹. Ek olarak, bu malzemeler yüksek hacimli üretim süreçlerine oldukça uygundur, bu da onları ticarileştirme ve seri üretim için uygun hale getirir. Bu nedenlerden dolayı, PMMA gibi termoplastikler, mikroakışkanların ilk yıllarından beri güvenilir ve sağlam malzemeler olarak kabul edilmiştir¹⁰. Termoplastiklerde solvent yapıştırma¹⁵, ısı yapıştırma¹⁶ ve ultraviyole (UV) / ozon yüzey işleme yapıştırma¹⁷ gibi kapalı kanallar üretmek için farklı protokoller tanımlanmıştır.

Çoğu durumda, geleneksel mikro freze makineleri ile elde edilen konumlandırma çözünürlüğü, 10 μm'den küçük yapılar gerektiren bazı mikroakışkan uygulamalar için yeterli değildir. Üst düzey mikro frezeleme yeterli çözünürlüğe sahiptir. Ne yazık ki, yüksek fiyatlar nedeniyle, kullanımı bir avuç kullanıcıyla sınırlıdır¹². Daha önce, araştırma grubumuz, geleneksel freze makinelerinin çözünürlüğünün üstesinden gelerek, 10 μm'den daha az işleme yapılarına izin veren düşük maliyetli bir takımın imalatını ve manipülasyonunu bildirmiştir¹². Fikstür, üç piezoelektrik aktüatör içeren, basit elektroniklerle 3D baskı ile üretilen bir platformdur. Yüzey, piezoelektrik elemanlar aynı anda hareket ettiğinde kaldırılmasını sağlayan menteşe şeklindeki eklemler içerir. Z ekseni yer değiştirmesi, 500 nm çözünürlük ve ±1,5 μm¹² hassasiyetle kontrol edilebilir.

Bu yazıda, bir mikrofrezeleme tekniği ile bir akrilik cihazın (PMMA) üretim sürecinin adımları sunulmaktadır. Talaş tasarımı, 200 μm genişliğinde ve 200 μm yüksekliğinde bir ana kanaldan ve reaktiflerin akışını temizlemek için aynı boyutlara sahip bir yan kanaldan oluşur. Merkezi bölgede, kanal, harici bir mıknatıs yerleştirerek nanopartiküller için manyetik bir tuzak oluşturan manyetik mikropartikülleri yakalamak için bu grup¹² tarafından yapılan 3D baskılı piezoelektrik platform ile imal edilen sadece 5 μm yüksekliğinde fiziksel bir kısıtlama ile kesintiye uğrar. Mikroakışkan cihazın çalışmalarını, 100 nm manyetik nanopartiküllere konjuge edilmiş bir model antijen olarak lizozim kullanarak ticari bir antikoru tespit etmek için bir immünoassay yaparak gösteriyoruz. Bu cihaz, onu benzersiz kılan farklı özellikleri bir araya getirir⁴: manyetik nanopartiküllerin bağışıklık desteği olarak kullanılması, toplam test süresini saatlerden dakikalara düşürür; Tespit için florojenik bir enzim kullanmak, standart enzime bağlı immünosorbent tahlilleriyle (ELISA'lar) karşılaştırılabilir tespit sınırlarına izin verir; ve bir termoplastiğin bir imalat malzemesi olarak kullanılması, önceki mikroakışkan nanopartiküllerin manyetik tuzakları³ için geçerli olmayan seri üretimle uyumlu hale getirir ve POCT'yi geliştirmek için mükemmel bir aday haline getirir.

Protocol

1. Mikrofrezeleme

1. Yüzey taşlama
   1. Mikrofreze makinesini ve piezoelektrik kontrolörü açın. İlgili kontrol yazılımlarını başlatın¹².
   2. Gerekli parmak freze uçlarını seçin (200 μm ve 800 μm çaplar). Bunları freze makinesinin uygun bölmesine yerleştirin (Şekil 1).
   3. 1,3 mm kalınlığındaki PMMA'nın 9 mm x 25 mm dikdörtgenlerini 800 μm parmak freze ucu ile kesin. Bu dikdörtgenlerden birini piezoelektrik platforma çift taraflı yapışkan bantla dikkatlice takın (Şekil 2).
      NOT: Akrilik dikdörtgeni her zaman aynı konuma yerleştirdiğinizden emin olun, böylece köşelerden biri işleme için x ve y eksenlerindeki başlangıç koordinatlarıyla çakışacaktır.
   4. Z-sensörünü bağlayın ve PMMA dikdörtgeninin yüzeyine yerleştirin. Algılama pimini seçin ve sensör yüzeyinin üzerinde hareket ettirin. Sensöre temas etmeden pimi manuel olarak indirin. Z0 algılama modunu etkinleştirin (Şekil 3).
   5. 200 μm parmak freze ucunu seçin ve x, y orijinine taşıyın. z sensörünü çıkarın. Akrilik yüzeye temas etmeden ucu dikkatlice indirin.
   6. 200 μm parmak freze ucunu 14.500 dev/dak'da döndürün. Yavaşça z eksenindeki orijin koordinatına indirin (z = 0). Z eksenini kaynağın 30 μm altına sıfırlayın. Bu koordinatı yeni z kaynağı olarak ayarlayın.
      NOT: Dönmüyorsa ucu asla alçaltmayın. Aksi takdirde, kırılma riski vardır.
   7. Cut panelini etkinleştirmek için mikro freze makinesi yazılımındaki Kes düğmesine tıklayın. Ekle düğmesine tıklayın ve akrilik yüzeyin taşlanması için önceden oluşturulmuş bir kod içeren .txt dosyasını (Ek Kodlama Dosyası 1) seçin. İşlemi başlatmak için Çıktı düğmesine tıklayın.
   8. Parmak freze ucunu, kısıtlamanın işleneceği koordinata getirin. Duraklat düğmesine tıklayarak bu koordinata ulaşıldığında parmak freze ucunun zemin yüzeyinden kalkmasını önleyin. Aksi takdirde, parmak freze ucunu bu koordinata manuel olarak yeniden konumlandırın (Şekil 4A).
2. 5 μm kısıtlamasının frezelenmesi
   1. Parmak freze ucunun dönme hızını 11.000 rpm'ye ayarlayın. Piezoelektrik platformun arayüzü ile platformu 6,5 μm yükseltin (Ek Şekil S1). Freze ucunu y ekseni boyunca 500 μm hareket ettirin. Piezoelektrik platformu, kontrol arayüzü ile z eksenindeki başlangıç değerine geri döndürün.
3. Mikro kanalların frezelenmesi
   1. Tasarım yazılımından önceden oluşturulmuş tasarım dosyasını açın (Ek Tasarım Dosyası 1). Print (Yazdır ) düğmesine tıklayın. Özellikler menüsüne erişin ve işlenecek tasarımı içeren katmana karşılık gelen renk penceresine tıklayın. Takım panelindeki imalat parametrelerini Ek Şekil S2'de belirtildiği gibi ayarlayın.
   2. Araçlar açılır menüsündeki Hiçbiri seçeneğini belirleyerek istenmeyen katmanları devre dışı bırakın.
4. Deliklerin frezelenmesi
   1. 800 μm parmak freze ucuna geçin. İlgili renk penceresine tıklayarak 1,2 mm çapındaki deliklerin tasarım katmanını etkinleştirin.
   2. Adım 1.3.2.'yi tekrarlayın, ancak bu durumda, delikler için Ek Şekil S3A'da açıklandığı gibi ilgili imalat parametrelerini ayarlayın.
      NOT: İşlenmiş deliklerin derinliği akrilik kalınlığın yarısıdır.
   3. Dikdörtgenin karşıt köşelerinde, akriliğin yeni bir platformda ters çevrilmiş bir şekilde hizalanmasına iki ek delik açın (Şekil 4B). Piezoelektrik platformdan akrilik dikdörtgeni çıkarın. Akriliği çevirin ve işlenmiş sütunlarla adaptörün üzerine çift taraflı yapışkan bantla bantlayın (Şekil 4C, D).
   4. Tasarım yazılımından karşı yüz için deliklerin tasarımını içeren dosyayı açın (Ek Tasarım Dosyası 2). İlgili üretim parametrelerini Ek Şekil S3B'de açıklandığı gibi ayarlayın. Reaktif giriş ve çıkış deliklerinin kalan yarısını 1,5 mm çapında ve 0,7 mm derinlikte frezeleyin (Ek Şekil S3C).

Şekil 1: Freze ucu yerleşimi . (A) 200 μm ve 800 μm parmak freze uçları yerleştirilir ve bir vida vasıtasıyla çelik desteğe sabitlenir. (B) Her parmak freze ucu, otomatik seçim için mikro freze makinesinin özel bölmesine yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Piezoelektrik platform. Platform 3D baskı ile üretilmiştir ve üç piezoelektrik aktüatör tarafından kontrol edilen z ekseninde ince bir yer değiştirmeye izin veren menteşelerle birleştirilmiş iki altıgen tabandan oluşur. PMMA dikdörtgeninin takılı olduğu ve koordinatların hizalama köşesinin ayarlanmasına izin veren bir akrilik adaptör de gözlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: Z ekseni kalibrasyonu. Z ekseni kalibrasyonunun adımları detaylandırılmıştır. (A) Z-sensörü, mikro freze makinesine takılan bir kablo içerir. (B) Sensör doğrudan işlenecek yüzeye yerleştirilir. (C) Algılama pimi, parmak freze uçlarının yanındaki özel bir bölmeye yerleştirilmiş metal bir çubuktan oluşur. (D) Her iki aksesuar da temas ettiğinde, mikro freze makinesi z eksenindeki menşe koordinatını otomatik olarak hesaplar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Düzeltilmiş akrilik yüzey. (A) 200 μm çaplı parmak freze ucu, akrilik dikdörtgenin tüm yüzeyini süpürerek yaklaşık 30 μm yüksekliğinde bir tabakayı temizler. (B) Resim, daha önce düzeltilmiş akriliğin yüzünde öğütülmüş farklı yapıları göstermektedir. Reaktif giriş ve çıkışı için kanallar ve delikler gözlenir. 5 μm kısıtlaması çıplak gözle görülemez. (C) Hizalama delikleri olan mikro frezelenmiş yüzey ve zıt köşelerde hizalama sütunları bulunan adaptör. (D) Akrilik, adaptör üzerinde, hizalama deliklerinin sığdığı sütunlarla baş aşağı hizalanır. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Kanal sızdırmazlığı

1. Akrilik temizlik
   1. Akrilik dikdörtgeni sütun adaptörü platformundan çıkarın. Başka bir işlenmemiş akrilik dikdörtgen alın. Her iki akrilik tabakayı izopropil alkol (IPA) ile yıkayın ve damıtılmış suyla durulayın. Eldiven giyin ve IPA ile temastan kaçının.
   2. Akriliği 10 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya daldırın (Şekil 5A, B).
2. Gazlı kloroform maruziyeti
   1. Her iki akrilik tabakayı da mükemmel şekilde kurulayın. Çift taraflı bantla cam Petri çanak kapağının içine bantlayın. İşlenmiş kanalın kenarını açıkta bıraktığınızdan emin olun (Şekil 5C). Eldiven giyin ve akrilik yüzeye doğrudan dokunmaktan kaçının.
   2. Cam Petri kabının tabanını daha büyük bir cam Petri kabının içine yerleştirin (Şekil 5D). Petri kabının tabanına 1 mL kloroform dökün. Kapağı, iç tarafa tutturulmuş akrilik levhalarla hızlı bir şekilde yerleştirin.
   3. Hemen daha büyük Petri kabının tabanına, Petri kabı kapağının seviyesine kadar damıtılmış su ekleyin. Akriliğin kloroform gaza 1 dakika maruz kalmasına izin verin (Şekil 5E).
      NOT: Kloroforma daha uzun süre maruz kalma süresinin akrilik yüzeye saldıracağını ve 5 μm kısıtlamasının eriyeceğini, yüksekliğini değiştireceğini veya tamamen kaybolacağını düşünün.
   4. Oluşturulan su contasını kırmak için Petri kabını eğin. Petri kabını ortaya çıkararak akriliği kloroformdan derhal çıkarın. Suyu dökmemeye dikkat edin.
      DİKKAT: Bu işlemi duman davlumbazında yapın ve kloroform oldukça toksik olduğundan eldiven kullanın.
3. Presleme ve ısıtma ile yapıştırma
   1. Her iki akrilik plakayı da çift taraflı banttan soyun.
   2. Her iki akriliği de gaz halindeki kloroforma maruz kalan taraflarla yüz yüze hizalayın ve bir sandviç oluşturun. Akrilikleri prese 18 kgf/^cm2 ve 90 °C sıcaklıkta yerleştirin (Şekil 5F,G).
      NOT: Akriliğin uzunlamasına hizalanmış olarak yerleştirilmesi ve daha iyi bir sızdırmazlık için 2 dakika sonra hizalamasının değiştirilmesi önerilir. Bu süreden sonra conta yetersizse, 1 dakikadan fazla olmayan aralıklarla tekrar prese yerleştirin. Stereoskobu kullanarak kanalların durumunu ve kısıtlamayı kontrol edin. Presleme süresinin aşılması durumunda, kısıtlamanın ortadan kaldırılması riski olduğunu düşünün.
4. Hortum bağlantısı
   1. 2-3 cm uzunluğunda hortum kesin. Tamamen düz bir kesim yapın. Her hortumu anında kuruyan sıvı yapıştırıcı ile cihazın deliklerine takın (Şekil 6A). Yapıştırıcının çipin içine girmesini önleyin.

Şekil 5: Cihazın sızdırmazlık işlemi . (A) Akrilik levhaların her biri, damıtılmış su ile yeniden kapatılabilir bir torbaya yerleştirilir ve ultrasonik banyoya daldırılır. (B) Soldaki görüntü, imalattan hemen sonra kanalları gösterir ve sağdaki görüntü, IPA ve ultrasonik banyo ile yıkandıktan sonra aynı cihazı gösterir, tüm safsızlıkları ve akrilik kalıntıları mikrokanaldan uzaklaştırır. 200 μm'lik merkezi kanalı kesen kısıtlamanın kenarları gözlenir ve bu da başarılı frezeleme işlemini doğrular. Ölçek çubukları = 500 μm. (C) Her iki akrilik de kurutulur ve kapaktaki cam platforma yapıştırılır. (D) Petri kabının tabanı daha büyük çaplı başka bir kabın içine yerleştirilir. (E) Petri kabını kapatırken, su contası gaz halindeki kloroformun kaçmasını önler. (F) 5 kg ağırlığındaki kol elemanlarının tanımı. (G) Akriliğin yerleştirildiği alanı kırmızı renkle gösteren açık kolun görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Cihaz hazırlama

1. Bir şırınga kullanarak kanalları damıtılmış suyla doldurun. Sızıntı olmadığından veya akışa karşı direnç olmadığından emin olun. Kanalların içinde kalan akrilik, yapışkan veya istenmeyen malzemeleri çıkarmak için cihazı 10 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya daldırın.
2. Cihaz kanallarının içindeki suyu boşaltın. 1x Tris tamponlu salin (TBS) içinde seyreltilmiş ve daha önce 0,2 μm polietersülfon (PES) şırınga filtresinden süzülmüş% 5 (w / v) sığır serum albümini (BSA) ile hazırlanan bir blokaj çözeltisi sunmak için bir şırınga kullanın.
3. % 5 BSA'da 7.5 μm çapında demir mikropartiküllerinin bir süspansiyonunu hazırlayın.
   NOT: Mikropartiküller daha önce protein emilimine direnç kazandıran bir silika-polietilen glikol (PEG) tabakası ile işlevselleştirilmiştir⁴.
4. Çipi ve mikropartikül süspansiyonunu blokaj çözeltisi ile oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca inkübe edin. Mümkünse, gece boyunca 4 ° C'de tıkanmaya izin verin.

4. Mikropartikül tuzağı oluşumu

1. Mikropartikülleri, yan kanal çıkış hortumundan bir şırınga iğnesi ile çipin içine yerleştirin. Çipi dikey olarak yerleştirin ve mikropartiküllerin yan kanaldan yerçekimi etkisi altında akmasına izin verin. Çipi 90°'lik iki adımda 180° döndürün ve mikropartiküllerin 5 μm kısıtlamada hedeflemesine ve sıkıştırmasına izin verin.
2. Yerçekimi yan kanala doğru 45 ° dönerek fazla mikropartikülleri uzaklaştırın.
3. Mikropartikül tuzağının geri alınmasını önlemek için cihazı dik tutun. Mikropartikül tuzağı oluşum sürecinin bir özeti için Şekil 6B'ye bakınız.

5. İmmünoassay

1. Nanopartikül hazırlama
   1. Daha önce lizozim (antijen modeli) ile konjuge edilmiş 100 nm nanopartiküllerin süspansiyonunun 2 μL'sini alın. 100 μL blokaj çözeltisi ile 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   2. 150 μL yıkama tamponu ekleyin (1x TBS, %0,05 Ara 20).
   3. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. Nanopartiküllerin ayrılmasına izin vermek için 15 dakika bekletin (Ek Şekil S4).
      NOT: Manyetik ayırıcı için minimum hacim 200 μL'dir.
   4. Sıvıyı tüpten bir mikropipetle çıkarın. Nanopartikül peletinin oluştuğu tüpün duvarı ile temastan kaçının.
   5. 250 μL taze yıkama tamponu ekleyin. Tüpü 15 dakika boyunca ajitasyon altında tutun.
   6. 5.1.3.-5.1.5 arasındaki adımları yineleyin. 2x daha fazla, sadece 5 dakika sallanıyor.
   7. İstenilen konsantrasyonda primer antilizozim antikoru ekleyin ( bakınız Malzeme Tablosu). Antikor seyrelticide 100 μL'lik bir son hacme ayarlayın (1x TBS,% 1 BSA,% 0.05 Ara 20).
   8. 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında 15 dakika daha sallanmaya devam edin.
   9. 5.1.2.-5.1.6 yıkama adımlarını tekrarlayın.
   10. 100 μL antikor seyreltici ekleyin. Yaban turpu peroksidaz ile eşleşmiş sekonder antikoru (HRP-AbII) ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1:500 seyreltmede ekleyin.
   11. 5.1.2.-5.1.6 yıkama adımlarını tekrarlayın.
   12. Nanopartikülleri 50 μL antikor seyrelticisinin son hacminde tutun.

6. Deneysel montaj

1. İki adet 100 μL cam şırıngayı suyla doldurun, her bir şırıngaya 6,5 cm uzunluğunda bir hortum bağlayın, hortumun ucuna metal bir pim yerleştirin ve her iki şırıngayı da bilgisayar kontrollü şırınga pompasına yerleştirin.
2. Akrilik cihazın tüm hortumlarını ısı ile kapatın.
3. Giriş hortumunu kesin ve sadece birkaç milimetre tutun. Dağıtım iğnesini yıkama tamponu ile doldurun ve kesilmiş hortuma yerleştirin. Cihaza hava erişimini önlemek için iğneyi cihaza bağlamadan önce çözeltinin damlamasına izin verin.
4. Çıkış hortumunu yanal kanaldan kesin. Şırınga pompasına bağlayın. Ardından, ana kanal çıkış hortumu için aynı prosedürü uygulayın.
   NOT: 6.3.-6.4 adımlarını gerçekleştirmek çok önemlidir. mikropartikül tuzağının ambalajından çıkmasını önlemek için. Mümkünse, bu adımlar sırasında tuzağın durumunu bir büyüteç yardımıyla doğrulayın.
5. Mikroskop aşamasına bir cam slayt yerleştirin. Mıknatısı çift taraflı bantla slayda takın ve talaş kenarlarını cama sabitlemek için her iki tarafa da küçük bir bant parçası yerleştirin.
6. Şırınga pompası kontrolöründeki Akış Hızı ve Birimler sekmeleri aracılığıyla 50 μL/s'lik bir akış hızı ayarlayın. Para çekme modunu seçin ve yıkama tamponunun akışını etkinleştirmek için Başlat düğmesine tıklayın.
7. Dikkatlice, cihazı mıknatısla slayta doğru yatay bir şekilde yaklaştırın, böylece tuzağı içeren çipin alanı mıknatısla temas eder.
8. Hareketi önlemek için cihazın kenarlarını çift taraflı bantla cama yapıştırın. Mikroskopi için optik yolu engellemekten kaçının (Şekil 6C).

Şekil 6: Son cihaz konfigürasyonu . (A) İlgili giriş ve çıkışlara bağlı hortumlarla akrilik cihaz. Ölçek, cihazın boyutlarını santimetre cinsinden gösterir. (B) Mikroparçacık tuzağının oluşumu için protokol. Mikropartiküller, cihaz dikey bir konuma yerleştirildiğinde yerçekimi ile kanaldan akar. Mikropartiküller 5 μm kısıtlamasında yoğunlaşır. Fazla mikropartiküller, çip yan kanaldan döndürülerek kolayca çıkarılır. İmmünoassay öncesi tuzağı korumak için çip dikey tutulur. (C) Mıknatısı içeren cam bir slayt üzerine, ters floresan mikroskobun sahnesine monte edilmiş mikroakışkan cihaz. Reaktiflerin eklendiği dağıtım iğnesinin yanı sıra bir şırınga pompasına bağlanan çıkış hortumları da gözlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. İmmün tespit

1. Fazla BSA'yı gidermek için yıkama tamponunu 50 μL/s'de 10 dakika boyunca akmaya devam ettirin.
2. Kalan yıkama tamponunu dağıtım iğnesinden bir mikropipetle çıkarın. Nanopartikül süspansiyonunun 50 μL'sini ekleyin.
3. Nanopartiküllerin süspansiyonunu 7 dakika boyunca 100 μL / s akış hızında akıtın. Daha sonra, akış hızını 50 μL / s olarak değiştirin ve 15 dakika daha deyin.
4. Dağıtım iğnesini değiştirin. Yıkama tamponunu 50 μL/s'de 10 dakika boyunca akıtın. Florojenik substratı, yıkama adımı sırasında üreticinin spesifikasyonlarına göre hazırlayın.
5. Kalan yıkama tamponunu dağıtım iğnesinden bir mikropipetle çıkarın. Florojenik substrattan 100 μL ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Florojenik substratı 50 μL/s'de 6 dakika boyunca akıtın.
6. Şırınga pompasını kontrol eden arayüzün ilgili Akış Hızı ve Zamanlayıcı Ayar sekmelerinde akış hızı (1 μL/s, 3 μL/h, 5 μL/h ve 10 μL/h) ve zaman (6 dakika) ölçüm parametrelerini ayarlayın. Gerçekleştirilecek ölçümlerin her biri için Geri çekme modunu seçtiğinizden emin olun.
7. Yıkama adımı için ek bir Akış Hızı sekmesini 50 μL/s'ye ayarlayın ve Zamanlayıcıyı 3 dakikaya ayarlayın.
8. Substrat 50 μL/s'de durmadan 15 s önce mikroskopun floresansını açın. Substrat 1.000 milisaniyelik bir pozlama süresiyle durmadan 10 s önce mikroskop kamerasının yazılımıyla görüntü yakalamaya başlayın. 1 kare/sn'de (FPS) 6 dakika boyunca görüntüleme gerçekleştirin.
9. 50 μL/s'de substrat yıkama akış hızı durduktan hemen sonra istenen akış hızı parametresinin Başlat düğmesine tıklayın. Seçilen ölçüm akışı durduktan hemen sonra yıkama akışının Başlat düğmesine ( 50 μL/h) tıklayın.
10. Görüntü yakalamayı durdurun ve substratın fotobeyazlamasını önlemek için mikroskopun floresansını kapatın.
11. 7.8.-7.10 arasındaki adımları yineleyin. kullanılan her ölçüm akış hızı için.

Results

Geleneksel mikrofrezeleme tekniğinin çözünürlüğünü artıran yüksek oranda tekrarlanabilir bir imalat protokolü oluşturmak mümkündü. Bu protokolü kullanarak, 200 μm yüksekliğindeki bir kanalda kademeli bir kısıtlama olarak çalışan 5 μm yüksekliğinde bir kanalın üretimi sağlanır. Kademeli kısıtlamanın basit tasarımı, mikrokanalda sıkıştırıldığında, harici bir mıknatıs cihaza yaklaştığında manyetik bir tuzak oluşturulmasına izin veren 7,5 μm çapındaki demir mikropartiküllerini yakalar. Bu cihaz, immünolojik destek olarak ilg...

Discussion

İmmüno-destek olarak nanopartikülleri kullanan immünotahliller için akrilik bir mikroakışkan cihaz, bir mikrofrezeleme tekniği kullanılarak üretildi. Substrat üzerinde doğrudan üretim yöntemi, bir ana kalıbın kullanımından ve bunun ima ettiği zaman ve maliyetlerden kaçınma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, hızlı prototipleme ve yüksek hacimli cihaz üretimi ile sınırlıdır.

Burada, freze makinesi¹² için daha önce bildirilen bir aksesuar piezoelektrik platform kulland...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Parmak Freze	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Parmak Freze	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032x1 / 8x0.48x1-1 / 12
Karbonil-demir mikropartikülleri	Sigma-Aldrich	44890	7 μ m
Kloroform	Fermont	6201	Sağlık Tehlikesi: Orta Yanıcılık: Yok Reaktivite: Yok Temas Tehlikesi: Orta
CMOS kamera Moment	Teledyne Fotometri		Sensör Teknolojisi: CMOS < br / > Kuantum Verimliliği:% 73 < br / > Piksel Boyutu: 4.5 ve mikro; m x 4,5 ve mikro; m Desteklenen Arayüzler: USB 3.2 Gen 2
Dr Gravür Yazılımı	Roland DGA Corporation		Yüzeyde gravür yolunu tasarlamak ve oluşturmak için gravür yazılımı
Ekstraksiyon davlumbazı		Bilinmiyor Bilinmeyen
Esnek Plastik Boru	Tygon	AAD04103	ID = 0.020, OD = 0.060
Floresan mikrosop ve nbsp;	ZEISS	Axio Vert.A1
Yüksek Hassasiyetli Dağıtım İğnesi	Loctite	98612
Ev yapımı piezoelektrik kontrol cihazı uygulaması	LabView		Daha fazla ayrıntı için referans 12'ye bakın.
Loctite 495 anında yapıştırıcı	Henkel	49503	Mikropipet ucu veya dağıtım iğnesi ile uygulayın
MagJET Ayırma Rafı	termobilimsel		12 x 1.5 mL
Mekanik pres	Ev Yapımı
Freze Makinesi	Roland	MDX-50
Piezoelektrik platform	Ev yapımı		Referansa bakın 12
Polimetilmetakrilat - Levha - PMMA, Akrilik	Goodfellow	ME303018/1	Kalınlık: 1,3 mm, Şeffaflık: Şeffaf/Şeffaf
PVCamTest yazılımı	Teledyne Photometrics	Sürüm 3.10.107	Görüntü elde etme yazılımı
Stereo mikroskop	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Karboksil Boncuk	Okyanus NanoTech	KSC0100	100 nm
Şırınga pompası	kd Scientific	KDS200	İki şırıngaya kadar tutabilir
Utrasonic banyosu	Branson	2800
VPanel yazılımı	Windows İşletim Sistemi	Sürümü 1.0.3.0	Mikro freze makinesini kontrol etmek için yazılım