Toprağın opaklığı nedeniyle, kurucu mikroplar arasındaki etkileşimler hücresel çözünürlükle kolayca görselleştirilemez. Burada, mantar-mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için yeni fırsatlar sunan iki mikroakışkan araç sunulmaktadır. Cihazlar çok yönlü ve kullanımı kolaydır, bu da hücresel düzeyde yüksek mekansal zamansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar
Bu makalede
Özet
Özet
Filamentli mantarlar toprağın başarılı sakinleridir ve organik ve inorganik maddenin ayrışması ve besin seviyelerinin düzenlenmesi gibi toprak ekosistemlerinde önemli bir rol oynarlar. Orada ayrıca bakteri veya diğer mantarlar gibi çeşitli diğer mikroplarla etkileşime girmek için sayısız fırsat bulurlar. Bununla birlikte, mantar etkileşimlerini hücresel düzeyde incelemek, toprağın kara kutu benzeri doğası nedeniyle zor olabilir. Mantar etkileşimlerinin incelenmesi için yeni mikroakışkan araçlar geliştirilmektedir; bakteriyel-fungal ve mantar-fungal etkileşimlerini incelemek için tasarlanmış iki platform vurgulanmıştır. Bu mikrokanallar içinde, mantar-mikrobiyal etkileşimler, kontrollü fiziko-kimyasal ortamlarda, daha önce mümkün olandan daha yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte izlenebilir. Bu araçların uygulanması, hifalara bakteriyel polar bağlılığın gözlemlenmesi veya karakterize edilmemiş mantar-mantar antagonizmalarının ortaya çıkarılması gibi çok sayıda yeni biyolojik anlayış sağlamıştır. Bu metodolojilerin önemli bir özelliği, bu aracın uzman olmayanlar tarafından kullanım kolaylığı ile ilgilidir ve mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılmak üzere oldukça çevrilebilir teknolojiler ortaya koymaktadır.
Giriş
Toprak, karbon ve fosfor döngüleriiçin etkili olan mikroorganizmaların bolluğunu içeren olağanüstü çeşitli bir ortamdır 1,2. Filamentli mantarlar, organik ve inorganik maddelerin ayrıştırıcıları olarak çok sayıda ekosistemin önemli bir bileşenidir ve simbiyotik ilişkilerin oluşumu yoluyla bitkilerin beslenmesini artırabilir 3,4. Toprakta, mantarlar diğer mantarlar5, bakteri6, virüsler7 ve nematodlar8 gibi çok sayıda mikropla dinamik olarak etkileşime girer. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokolde özetlenen prosedürlerin bir özeti Şekil 2'de görsel olarak gösterilmiştir.
Şekil 2: Bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan beş ana bölümden oluşan sunulan metodolojinin şematik gösterimi. Cihaz tasarımları bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı ve fotolitografi kullanılarak üretilen bir ana kalıp kullanılarak oluşturulur (1). Bu, poli (dimetilsiloksan) (PDMS) dökmek için kullanılı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Örnek BFI40 ve FFI41 cihazlarından temsili sonuçlar sunulmuştur. Hifal büyüme hızı ölçümleri, temel mikroskopi teknikleri ile birlikte bu cihazlar kullanılarak kolayca elde edilebilir. Şekil 3A-B, C. CINEREA HYPHAE ve B. subtilis NCIB 3610 arasındaki bakteriyel-fungal etkileşimleri göstermektedir. B. subtilis varlığı, ko-aşılamadan yaklaşık 5 saat sonra C. cinerea'nın büyümes.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, kanal mikroakışkanları kullanılarak mantar-mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi için bir protokol sunulmaktadır. Yazarlar, bu cihazların çok yönlülüğünü göstermeyi ve araştırmacının ilgi alanlarına uyacak şekilde adaptasyonu teşvik etmeyi amaçlamaktadır. Örnek BFI ve FFI cihazları kullanılarak, mantar-mikrobiyal etkileşimler daha önce erişilenden daha ayrıntılı olarak incelenebilir. Toprağın arka plan karmaşıklığını ve heterojenliğini ortadan kaldırarak, hiflerin büyümesini tek bir tek katmanla sınırlı kala.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Imperial College London Biyomühendislik Bölümü ve The Leverhulme Trust'ın (Araştırma Hibe Referansı: RPG-2020-352) finansal desteğini kabul ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Petri kapları içinde bakteri ve mantar yetiştiriciliği için kültür ortamını katılaştırmak için kullanılır |
| Alüminyum folyo | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, ABD | ||
| Otoklav (VX-75) | Systec | ||
| Santrifüj (5810R) | Eppendorf | ||
| Klorotrimetilsilan | Merck Yaşam Bilimleri | 386529 | DİKKAT: Klorotrimetilsilan tehlikeli bir maddedir. Uygun KKD giyin ve dikkatli kullanın. Cilt ve gözlerle temasından kaçının ve solunmasını önleyin. Tutuşturucu kaynaklardan uzak tutun ve iyi havalandırılan bir alanda kullanın. |
| Mantar delici | SLS | COR1000 | |
| Geliştirici çözümü (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | DİKKAT: mr-Dev 600 geliştirici çözümü yanıcıdır | |
| Erlenmeyer şişeleri | VWR | 214-1108 | örneğin 200 mL; İhtiyaçlarınıza tam olarak uygun boyutu seçin |
| Etanol (%70 v/h) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | %99,8'den seyreltilmiş (Analitik Reaktif Sınıfı) |
| Fiji | ImageJ | Görüntüleme işleme için örnek yazılım paketi | |
| Filtrelenmiş, basınçlı hava | Çoğu laboratuvarda standart olarak mevcuttur. Alternatif olarak, hava regülatörlü yağsız bir kompresör kullanılabilir. | ||
| Düz başlı gofret cımbız | SLS | INS5026 | |
| Forseps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bükülmüş, keskin |
| Cam tabanlı petri kabı | Dünya Hassas Aletler | FD35-100 | 35 mm |
| Cam tabanlı petri kabı | Dünya Hassas Aletler | FD5040-100 | 50 mm |
| Cam kristalizasyon kapları | VWR | 216-1865 | Kullanılmış PDMS plakalarının yıkanması için |
| Cam kristalizasyon kapları | VWR | 216-1866 | Ana kalıpların geliştirilmesinde kullanılır |
| Cam medya şişeleri | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | örneğin 250 mL; ihtiyaçlarınıza tam olarak uygun boyutu seçin |
| Cam şırınga (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Klorotrimetilsilan dağıtmak için kullanılır |
| Sıcak plaka (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Aşılama döngüsü | VWR | COPA175CS01 | |
| İzopropil alkol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminer akış başlığı | Hava Bilimi (PCR) | Cihaz imalatı için kullanılan örnek laminer akış başlığı | |
| LB ortamı | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Bakteriyel gece kültürü |
| için örnek besin suyuIşık yayan diyot ışık motoru (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilecek örnek ışık kaynağı (floresan) | |
| MA6 Ultraviyole maske hizalayıcı | Suss Microtec | ||
| Malt özü | VWR | 84618 | Örnek mantar kültürü ortamı yapmak için kullanılır (Malt özü agar) |
| Maske Yazarı | Uygulamalı Malzemeler | 4700DP | Fotolitografi için fotoğraf maskesi basmak için kullanılabilecek bir maske yazarı örneği |
| Ana kalıp, plastik montaj | 3D baskı, ısmarlama tutucu, şirket içinde üretilmiştir, | ||
| Mikrobiyolojik güvenlik kabini (BiyoMat2) | İçerdiği Hava Çözümleri | Mikrobiyal kültür ve cihaz aşılaması için kullanılan örnek MSC | |
| Milli-Q arıtılmış su | Biyoloji laboratuvarlarında standart olarak mevcuttur. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research görüntüleme yazılımı | Görüntü | Exemplar yazılım paketi | |
| NIS-Elements Free Viewer | Elde | edilen görüntüleri görüntülemek için | |
| Fırın (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Poli (dimetilsiloksan) (PDMS) kürlemek için kullanılır |
| )Fırın (CLO-2AH-S) | KOYO | Silikon gofret hazırlamak için kullanılır | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | şeffaf film |
| Petri kapları, kare steril | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120,5 mm |
| Petri kapları, steril | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Fotolitografi maskesi | Mikro Litografi Hizmetleri Ltd. İngiltere | ||
| Plazma temizleyici (Zepto) | Diener Elektronik | 100012601 | |
| Plastik bardak | Semadeni | 8323 | |
| Plastik spatula | Semadeni | 3340 | |
| Taşınabilir hassas terazi (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | PDMS, ortamı tartmak için kullanılır bileşenler vb. |
| Hassas kesici | Syneo | HS1251135P1183 | Kesme kenarı çapı: 3,18 mm |
| Hassas kesici& | Syneo | HS1871730P1183S | Kesme kenarı çapı: 4,75 mm |
| Profilometre | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Tıraş bıçakları | Hä berle Labortechnik | 9156110 | |
| Buzdolabı | Haden | 4-6 & derece; C | |
| Retiga R1 CCD kamera | Qimaging | Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilecek örnek kamera | |
| Scotch sihirli bant | Ofis Deposu | 3969954 | 19 mm görünmez bant; şeffaf bant |
| Çalkalama kuvözü (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Silikon gofret | Inseto | 100 mm | |
| Soda kireç camı plaka | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Fotolitografi maskesini maske hizalayıcıda tutmak için kullanılır | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 fotorezist | MicroChem | DİKKAT: SU-8 fotorezist tehlikelidir, kullanırken dikkatli olun ve solunmasını ve cilt ile temasını önleyin. Yanıcı, potansiyel olarak kanserojen ve çevre için toksiktir. | |
| Sylgard 184 elastomer kiti | VWR | 634165S | Poli (dimetilsiloksan) (PDMS) cihazlarının hazırlanması için kullanılır |
| Sıcaklık kontrollü inkübatör | Okolab | Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilen örnek inkübatör | |
| Ti2-E ters epifloresan mikroskobu | Nikon | MEA54000 | Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilen örnek mikroskop |
| Ultrasonik temizleyici S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vakumlu kurutucu | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianizasyon ve PDMS gaz giderme ayrı desikatörlerde yapılmalıdır |
| x10 / 0.3 NA CFI Plan Fluor DL objektif lensi | Nikon | MRH20105 | Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilecek örnek objektif lens |
| x20 / 0.45 NA CFI Plan Fluor DL objektif lens | Nikon | MRH48230 | Mantar-mikrobiyal etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilen örnek objektif objektif lensi |
Kaynaklar
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial fun....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
