Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

Düz kas hücresi (SMC), öncelikle hava yollarının ve pulmoner damarların medya duvarında bulunan, akciğerde önemli bir yapısal hücre tipidir. SMC'ler luminal kalibreyi değiştirmek için büzülür, böylece hava ve kan akışını düzenler ^1,2. Bu nedenle, SMC'lerin kontraktil regülasyonu, hava ventilasyonu ve pulmoner dolaşımın homeostazını korumak için esastır. Buna karşılık, anormal SMC kontraktilitesi obstrüktif hava yolunu veya astım ve pulmoner arteriyel hipertansiyon gibi pulmoner vasküler hastalıkları tetikler. Bununla birlikte, akciğer SMC'lerinin fonksiyonel değerlendirmesi, akciğer dokusuna, özellikle de akciğerin distal kısmındaki küçük hava yollarına ve mikrodamarlara sınırlı erişim nedeniyle zorlanmıştır ^2,3. Mevcut çözümler, hava yolu daralmasını yansıtmak için Flexivent ile hava akımı direncini ölçmek ve pulmoner vazokontraksiyonu değerlendirmek için sağ kalp kateterizasyonu ile pulmoner arteriyel kan basıncını kontrol etmek gibi dolaylı testlere başvurmaktadır ^4,5. Bununla birlikte, bu dolaylı tahlillerin, yapısal faktörler tarafından karıştırılması, tüm akciğer skalası ^6,7'deki hava yolunun veya vasküler yanıtların mekansal çeşitliliğini yakalayamaması ve hücresel düzeyde kontraktil regülasyonun mekanik çalışması için uygun olmaması gibi birçok dezavantajı vardır. Bu nedenle, SMC çalışması için in vitro olarak izole primer hücreler, trakea/bronş kas şeritleri ^8,9 veya büyük vasküler^{segmentler 10} kullanılarak alternatif yaklaşımlar uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin de sınırlamaları vardır. Örneğin,^11,12 kültür koşulundaki primer SMC'lerin hızlı bir fenotipik adaptasyonu, bulguları hücre kültüründen in vivo ortamlara tahmin etmeyi sorunlu hale getirmektedir. Ek olarak, izole proksimal hava yolu veya vasküler segmentlerdeki SMC'lerin kontraktil fenotipi, distal akciğer ^6,7'deki SMC'leri temsil etmeyebilir. Dahası, doku seviyesindeki kas kuvveti ölçümü, kasılma regülasyonuna mekanik bakış açısı için gerekli olan moleküler ve hücresel olaylardan ayrışmış olarak kalır.

Canlı bir akciğer dokusu kesiti olan hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), pulmoner SMC'leri yakın in vivo mikro ortamda (yani, korunmuş çok hücreli mimari ve etkileşim) karakterize etmek için ideal bir ex vivo araç ^sağlar13. Dr. Placke ve Fisher, 1980'lerde agarozla şişirilmiş sıçan ve hamster akciğerlerinden akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ilk kez^14,15'te tanıttığından beri, bu teknik^, PCLS'lere biyomedikal araştırmalar için daha yüksek kalite ve çok yönlülük sağlamak için sürekli olarak geliştirilmiştir. Önemli bir gelişme, trakea yoluyla agarozlu akciğer enflasyonuna ek olarak, jelatin infüzyonu ile pulmoner arteriyel korumanın arttırılmasıdır. Sonuç olarak, ex vivo değerlendirme¹⁶ için PCLS'de hem hava yolu hem de pulmoner arterler sağlam tutulur. Ayrıca, PCLS kültürde uzun süre uygulanabilir. Örneğin, fare PCLS'lerinin kültürde en az 12 gün boyunca hücre canlılığı ve metabolizmasında önemli bir değişiklik olmadı ve ayrıca 7 güne kadar hava yolu kontraktilitesini korudular¹⁷. Ek olarak, PCLS kasılma ve gevşeme tahlilleri için farklı boyutlarda hava yolları veya damarlar tutar. Ayrıca, hücre kontraktilitesinin belirleyici faktörü olan SMC'lerin hücre içi Ca²⁺ sinyalizasyonu, bir konfokal veya 2-foton mikroskobu¹³ tarafından görüntülenen Ca 2⁺ muhabir boyaları ile test edilebilir.

Fare modelinin akciğer araştırmalarında kapsamlı bir şekilde uygulanması göz önüne alındığında, burada ex vivo akciğer araştırması için sağlam hava yolları ve intrapulmoner arterlere sahip fare PCL'lerinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Hazırlanan PCLS'leri kullanarak, konstrüktif veya gevşetici uyaranlara karşı hava yolu ve pulmoner arteriyel yanıtların nasıl değerlendirileceğini gösterdik. Ek olarak, PCLS'yi Ca 2+ muhabir boyası ile yükleme ve daha sonra kasılma veya gevşetici yanıtlarla ilişkili SMC'lerin Ca²⁺ sinyallemesini görüntüleme yöntemi de tanımlanmıştır.

Tüm hayvan bakımı, Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygundu. Bu çalışmada 8 haftalık vahşi tip C57/B6 erkek fareler kullanılmıştır.

1. Deneysel hazırlık

1. Çalışma çözümünü hazırlayın.
   1. 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini hazırlayın (HBSS, Ca 2+ ve Mg 2⁺ ile ve pH²⁰ mM HEPES ile dengelenmiştir, Malzeme Tablosuna bakınız). PCLS'yi hazırlamak ve işlemek için HBSS çözümünü kullanın. PCLS'leri hazırlarken HBSS solüsyonunu buz üzerinde soğuk tutun.
2. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı ve F-12'yi (DMEM-F12) bir antibiyotik-antimikotik ajanla destekleyerek PCLS'nin kültür ortamını hazırlayın (1:100 hacim oranı, bakınız Malzeme Tablosu).
3. % 1.5 agaroz ve% 6 jelatin çözeltisi hazırlayın.
   1. Düşük erime noktalı (LMP) agaroz veya jelatin tozunu (bakınız Malzeme Tablosu) HBSS çözeltisi ile ayrı ayrı 15 mL steril santrifüj tüplerinde (veya çözelti hacmi >10 mL) 50 mL tüplerde) nihai konsantrasyonlara karıştırın.
      NOT: Agaloz çözeltisinin toplam hacmi = 5 mL/fare x fare sayısı; jelatin çözeltisi = 2 mL / fare x fare sayısı.
   2. Çözelti tüplerini, toz tamamen çözünene kadar kaynar suda ısıtın. Hem agaroz hem de jelatin çözeltilerini 42 °C su banyosunda tutun.
      NOT: Diseksiyon masasındaki bir ısıtma lambası, çalışma ortamını sıcak tutmak ve agaroz çözeltisinin fare akciğerine enjekte edilmeden önce katılaşmasını önlemek için yararlı olabilir.
4. Bir çift diseksiyon makas, iki çift kavisli mikro diseksiyon forseps ve bir çift hemostatik forseps dahil olmak üzere tüm diseksiyon aletlerini, sterilizasyon için en az 20 dakika boyunca% 70 etanol çözeltisine batırın.
5. Akciğer dokusunu ince dilimler halinde bölmek için bir vibratomu hazır tutun (bkz.
6. Hava yolu veya vasküler kontraktil yanıtları değerlendirmek için CCD kameralı ters faz kontrastlı bir mikroskop ve pulmoner SMC'lerde Ca ²⁺ sinyallemesini değerlendirmek için özel yapım bir lazer taramalı konfokal mikroskop (bakınız Malzeme Tablosu) bulundurun¹⁸.

2. Fare akciğerlerinin agaroz ve jelatin çözeltisi ile şişirilmesi

1. Fareyi ötenazileştirin.
   1. Fareyi% 5 izofluran içeren plastik bir odaya (yaklaşık 750^cm3) yerleştirin. Fareyi en az 1 dakika boyunca nefes almayı bırakana kadar odada tutun.
      NOT: İntraperitoneal ketamin (240 mg/Kg) ve ksilazin (32 mg/Kg)¹⁹ veya pentobarbital (0.3 mL)²⁰ enjeksiyonu gibi diğer primer ötenazi yöntemleri, inhale izoflurana alternatif olarak uygulanabilir.
   2. Fare gövdesini sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Kuyruğu, ön pençeleri ve kafayı 25 G şırınga iğneleriyle sabitleyerek vücudu yerinde sabitleyin ve% 70 etanol spreyi ile vücudu sterilize edin.
   3. Farenin karnını cerrahi makasla kesin (kesi, ~2 cm uzunluğunda x 2 cm genişliğinde). Ardından, kan hacmini tüketmek için abdominal aortu kesin.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek akciğer loblarını şişirin.
   1. Göğüs boşluğunu diyaframın üzerindeki sternum ve bilateral inferior göğüs kafesi boyunca dikkatlice açın ve göğüs boşluğu açıldığında akciğer loblarının çöktüğünü gözlemleyin.
   2. Kalbi açığa çıkarmak için bilateral ventral göğüs kafeslerinin bir kısmını çıkarın. Keskin makas ucunu akciğer dokusundan uzağa işaret ederek akciğer hasarından kaçının.
   3. Trakeayı açığa çıkarmak için fare boynundaki timus ve yumuşak dokuyu ayırmak için forseps kullanın.
   4. Trakeanın üst ucunda, 20 G Y şeklinde bir IV kateterin ucunun geçişine izin veren küçük bir delik (1,2 mm çapında) kesin (bkz.
   5. Y şeklindeki kateterin bir adaptör portunu 0,5 mL hava ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya ve diğer portu 2 mL sıcak% 1,5 agaroz çözeltisi (42 ° C) ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
   6. Kateteri doldurmak için agaroz çözeltisi enjekte edin ve ardından kateteri önceden kesilmiş açıklıktan 5-8 mm uzunluğunda trakeaya itin.
   7. Agaroz çözeltisini yavaşça yaklaşık 1 mL / 5 s'de enjekte edin. Akciğer, proksimal-distal eksen boyunca genişleyecektir. Her akciğer lobunun kenarı şişirildiğinde enjeksiyonu durdurun.
      NOT: Akciğeri aşırı şişirmeyin, çünkü bu onu yırtabilir. Genç yetişkin bir farenin tüm akciğerini şişirmek için agaroz çözeltisinin hacmi yaklaşık 1.3 ± 0.1 mL'dir.
   8. Kateterdeki ve iletken hava yollarındaki artık agarozu distal alveol boşluğuna itmek için diğer şırıngadan 0.2-0.3 mL hava enjekte edin.
   9. Klipsle trakeayı bir çift kavisli hemostatik forseps ile kapatın (bkz.
3. Pulmoner vaskülatürü doldurun.
   1. 1 mL'lik bir şırıngayı ılık% 6 jelatin ile doldurun. Bir iğne derisi damar kateterine bağlayın, kateteri jelatin çözeltisi ile doldurun ve ardından sağ ventrikülü iğne ile inferior duvara yakın delin.
   2. İğneyi 2-3 mm uzunluğunda sağ ventriküle itin ve iğne ucunu ana pulmoner artere doğrultun.
   3. 0.2 mL jelatin çözeltisini yavaşça sağ ventrikül ve pulmoner arteriyel damarlara enjekte edin.
      NOT: Akciğer lobları uygun jelatin şişirmesi ile biraz daha solgun görünür.
   4. İğneyi enjeksiyondan sonra 5 dakika yerinde tutun, kalp ve akciğere buz gibi soğuk HBSS çözeltisi dökerek akciğer loblarını soğutun, ardından vücudu diseksiyon tahtası ile 4 ° C'lik bir buzdolabına veya toplam 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
   5. Fare akciğerini ve kalbini çevredeki bağ dokularından makasla çıkarın. Daha sonra, her akciğer lobunu ayırın ve buz üzerinde HBSS çözeltisinde saklayın.

3. Akciğer loblarının ince dilimlere ayrılması

1. Numune kolonunun üstündeki akciğer lobunu süper yapıştırıcı ile kesin ve takın ve kesme yönünün hiladan akciğer yüzeyine kadar çoğu hava yoluna dik olmasını sağlamak için lobu (Şekil 1A, B) yönlendirin.
2. Akciğer lobunu 150 μm dilimler halinde kesmek için taze ince bir tıraş bıçağı ile bir vibratom kullanın. Dilimleri soğuk HBSS çözeltisi ile önceden doldurulmuş 100 mm steril Petri kaplarında toplayın.
   NOT: Dilimlemeye başlamadan önce uygun bıçak hareket hızını ve salınım frekansını ayarlayın. Bir Compresstom için tipik bir ayar Hız seviyesi 4 ve Salınım seviyesi 4'tür.
3. Dilimleri DMEM/F-12 kültür ortamı (20 dilim/15 mL orta/çanak) ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın ve deneylerden önce gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde saklayın.
   NOT: Fare PCLS'leri hava yolu kontraktil yanıtlarını kaybetmeden yaklaşık 7 gün boyunca kültürde tutulabilir¹⁷. Pulmoner arterlerin ömrü tam olarak değerlendirilmemiştir. Gözlemlerimizde, DMEM / F12 ortamında en az 3 gün boyunca sağlam yapı ve vazoreaksiyonu korurlar. Uzun süreli depolama için, fare PCLS'leri% 10 DMSO (şişe başına 1 mL ortamda 5 dilim) içeren DMEM / F12 ortamı ile doldurulmuş kriyovyallere yerleştirilebilir, gece boyunca -80 ° C'de izopropil alkol dolu bir kapta dondurulabilir ve haftalarca^{ila 21}. aylar boyunca sıvı azotta kriyo-korunabilir.

4. İntrapulmoner hava yolları ve arterlerin kontraktil yanıtlarının analizi

1. PCLS'leri HBSS dolgulu 24 delikli bir kültür plakasına, her bir kuyucuğa bir tane yerleştirin. PCLS'yi kuyunun ortasına yerleştirin, ardından HBSS solüsyonunu bir pipetle çıkarın.
2. Mikroskop altındaki dilimde hedef hava yolunu ve kabı bulun, ardından hedef alanı ortaya çıkarmak için önceden kesilmiş merkezi bir deliğe (2-3 mm çapında) sahip naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün.
3. Dilimleri yerinde tutmak için ağın üzerine içi boş bir metal yıkayıcı yerleştirin (Şekil 2A).
4. PCLS'yi suya batırmak için 600 μL HBSS çözeltisi ekleyin. Dilimi 10 dakika dinlendirin, ardından hava yollarının veya gemilerin temel görüntülerini kaydedin.
5. Boş HBSS solüsyonunu bir pipetle dikkatli bir şekilde emerek ve 1 μM metakolin (MCh) veya 10 nM endotelin gibi bir agonistle 600 μL HBSS ekleyerek hava yolunu veya vasküler kontraksiyonu indükleyin (bkz.
   NOT: Alet seti standardı olarak KCl stimülasyonu, metakolin veya endotel maruziyetinden önce gerekli değildir. Fare hava yollarında 100 mM KCl stimülasyonu sadece küçük ve düzensiz bir hava yolu kasılmasına neden olur (%10-%15)²⁰. Benzer şekilde, aynı agonistin, örneğin metakolin veya serotoninin, ilk ve tekrarlayan maruziyetlerde benzer hava yolu kasılmasını tetiklediğini doğruladığımız için bir astarlama metakolin stimülasyonu zorunlu değildir^20,22.
6. Luminal alan değişimi dengeleyici bir duruma ulaşana kadar mikroskop altında reaksiyonu gözlemleyin ve ardından analiz için hava yolunu veya vasküler görüntüleri kaydedin.
7. MCh veya endotelin solüsyonunu bir pipetle çıkarın ve aynı agonist konsantrasyonuna ve gevşeticiye sahip yeni bir 600 μL HBSS çözeltisi ekleyin; hava yolunu veya vasküler gevşemeyi gözlemleyin ve kaydedin.
8. Aşağıdaki adımları izleyerek hava yolunu veya vasküler reaksiyonu ölçün.
   1. Görüntüleri NIH sponsorluğundaki özgür yazılım FIJI'ye yükleyin.
   2. Her çerçevedeki hava yolunu veya vasküler lümeni ana hatlarıyla belirtmek için araç çubuğunda Poligon Seçimi'ni seçin.
   3. Analiz Et > Ölçümleri > Ayarla'yı seçin.
   4. İlgi alanını ölçmek için Analiz > Ölçü'yü seçin. Sonuçlar istatistiksel analiz için ayrı bir pencerede gösterilir.

5. Hava yolu veya vasküler SMC'lerin Ca²⁺ sinyalizasyonunun analizi

1. Ca²⁺ boya yükleme tamponunu hazırlayın.
   1. Ca²⁺ boya, Oregon Green 488 BAPTA-1-( Malzeme Tablosuna bakınız), 50 μg (bir şişe) 10 μL DMSO ile çözün.
   2. % 20'lik bir Pluronik çözelti oluşturmak için 0.2 g Pluronik F-12 tozunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL DMSO'da çözün.
   3. 10 μL% 20 Pluronik çözeltiyi, 10 μL Ca²⁺ boya-DMSO çözeltisi ile karıştırın.
   4. ²⁰⁰ μM sülfobromoftalin içeren 2 mL HBSS çözeltisine 20 μL karışım ekleyerek Ca 2+ boya yükleme tamponu yapın (bkz.
2. 2 mL Ca 2⁺ yükleme tamponuna 15 fare PCL'si yerleştirin ve 1 saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Daha sonra dilimleri, oda sıcaklığında floresan boya deesterifikasyonu için 30 dakika daha 100 μM sülfobromoftalin içeren 2 mL HBSS çözeltisine taşıyın.
3. SMC'lerin Ca²⁺ sinyalizasyonunu tespit edin.
   1. Ca²⁺ boya yüklü dilimleri büyük bir kapak camına yerleştirin.
   2. 3 mL'lik bir şırıngayı yüksek vakumlu silikon gres ile doldurun. Gresi 18 G körelmiş bir iğneden sıkarak dilimin üstündeki ve altındaki kapak camı boyunca iki paralel çizgi çizin.
   3. İki gres hattı arasında naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün. Yanlarda gresle kapatılmış bir oda oluşturmak için ikinci kapak camını ağın üzerine yerleştirin (Şekil 3A).
      NOT: Naylon ağ, dilimi alt kapak kaymasına bağlı tutmak ve böylece 40x yağ gibi yüksek büyüklükte ters çevrilmiş bir hedefin çalışma mesafesinde kalmak için gereklidir.
   4. HBSS veya agonist solüsyonunu manuel olarak veya bir perfüzyon sistemi aracılığıyla pipetleme yaparak bir ucundan hazneye ekleyin. Sürekli sıvı perfüzyonu durumunda diğer ucundan kağıt mendil veya vakum ile emerek sıvıyı odadan çıkarın.
   5. PCLS odasını mikroskop aşamasına yerleştirin. SMC^23'ün Ca²⁺ sinyalini, 15 veya 30 görüntü/sn lazer tarama hızına sahip özel yapım rezonans taramalı konfokal mikroskopla algılayın.
      NOT: Alternatif olarak, şu anda yaygın olarak bulunan yüksek hızlı bir ticari lazer taramalı konfokal mikroskop, PCLS'deki pulmoner SMC'lerin Ca²⁺ sinyal tahlilinde uygulanabilir.
4. SMC'lerde Ca²⁺ floresansını ölçün.
   1. Kaydedilen görüntü dizisini FIJI'ye yükleyin ve 8 bit gri tonlamalı Görüntü > Türü>nü seçin.
   2. Araç çubuğunda Dikdörtgen Seçimi'ni seçin ve düz bir kas hücresinde 5 piksel x 5 piksellik bir ilgi alanı (YG) tanımlayın.
   3. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla > Ca ²⁺ floresan yoğunluğunu temsil eden Ortalama gri değer'i seçin.
   4. Bir yatırım getirisinin konumu SMC daralmasıyla birlikte değişirse, Ca²⁺ floresan yoğunluğunu kare kare ölç > Analiz Et'i seçin.
   5. SMC'nin yatırım getirisi bir görüntü yığınında benzer bir konumda kalırsa, Görüntü > Yığınları > Ca ²⁺ floresan yoğunluğunun yığınını ölç'ü seçin.
      NOT: Özel olarak yazılmış bir makro, bir görüntü yığınında daralma ile hareket ettiğinde SMC içindeki YG'yi izlemek için takılabilir ve YG'nin Ca²⁺ yoğunluğunu (gri değer) kare kare otomatik olarak ölçer.

Bozulmamış intrapulmoner hava yollarını ve arterleri koruyan fare PCLS preparatı
Ters faz kontrast mikroskobu altında 150 μm kalınlığında bir PCLS gözlendi. Fare akciğerlerinde, iletken hava yollarına, hilustan periferik akciğere uzanan intrapulmoner arterler eşlik eder. Bir fare PCLS'sinde temsili bir pulmoner hava yolu-arter demeti Şekil 2B'de gösterilmiştir. Hava yolu, lümenin iç yüzeyini kaplayan aktif siliyal atımlı küboidal epitel hücreleri ile kolayca tanımlanabilir. Buna karşılık, yakındaki pulmoner arter düz endotel tarafından öne çıkar. Periferik akciğer alanına ulaştığında, iletken hava yolları, küçük intraasiner arteriolleri çevreleyen solunum kanallarına ve keselere dallanır (Şekil 2C).

Pulmoner hava yolunu ve arteriyel kontraksiyonu değerlendirmek için fare PCL'lerinin kullanılması
Metakolin (MCh, 1 μM) kaynaklı hava yolu kontraksiyonu Şekil 2B'de gösterilmiştir. Hava yolu kontraktil yanıtları, MCh maruziyetini takiben luminal alan azalması yüzdesi ile ölçülür (Şekil 2D). Buna karşılık, pulmoner arter MCh uyaranlarına yanıt vermez (Şekil 2B). Hava yolları, 1 günlük veya 5 günlük kültürü takiben PCLS'de MCh'ye benzer doza bağımlı kontraktil yanıtları sürdürür (Şekil 2D). PCLS endotele (10 nM) maruz kaldığında, hem hava yolları hem de pulmoner arterler daralır (Şekil 2C, E), ardından NOC-5 (100 μM) kaynaklı gevşeme (Şekil 2E).

Hava yolu ve arteriyel SMC'nin Ca 2+ sinyalini değerlendirmek için fare PCL'lerini kullanma
Ca2+ boya yüklü PCLS, konfokal floresan mikroskop altında gözlenir. Hava yolundaki Ca 2 + floresan (Şekil 3B) ve vasküler (Şekil 3C) SMC'ler dinlenme durumunda düşüktür, hücre içi Ca2 + sinyalinin fokal kıvılcımı dikkate değer değildir. Agonistlere maruz kaldıktan sonra, Ca2 + floresan yoğunluğu SMC'de yükselir (Şekil 3B, C), genellikle bir noktadan ve daha sonra tüm hücreye yayılır. Ca2+ floresan dalgaları, salınımlı sinyallerle aynı hücrede tekrar tekrar ortaya çıkar (Şekil 3D, E). Genel olarak, Ca 2+ salınım sıklığı, agonist konsantrasyonu plato seviyesi24'e ulaşana kadar yükseldikçe artar. Hava yolu SMC gevşemesi, Ca 2+ salınımlarınınazalması veya durması ile ilişkilidir25.

Resim 1: Vibratom dilimleme için fare akciğer loblarının oryantasyonu. Fare akciğer lobları bölümler için ayrı ayrı loblara ayrılır. (A) Sol (1), sağ kraniyal (2) ve kaudal loblar (3), düz kesme yüzeyini numune sütununa yapıştırmadan önce beyaz noktalı çizgiler boyunca hilumun yakınında kesilir. Sol lobun yerleşimi (4)'te gösterilmiştir. (B) Sağ orta lob doğrudan numune kolonuna yapıştırılabilir. Doğru aksesuar lobu, küçük boyutu nedeniyle yaygın olarak kullanılmamıştır. Farklı lobların uygun oryantasyonu, çoğu hava yolunun ve pulmoner damarın PCLS'de enine kesitler göstermesini sağlar. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fare PCLS'lerinde hava yollarının ve pulmoner arterlerin kontraktil ve gevşetici yanıtları. (A) Bir PCLS'nin kasılma testi için bir kültür plakasına iyi yerleştirilmesini gösteren şema. (B) İstirahatte ve 1 μM metakoline (MCh) maruz kaldıktan sonra HBSS'de yakındaki bir pulmoner artere (siyah ok uçları) sahip bir hava yolunu (siyah oklar) gösteren temsili görüntüler. (C) İstirahatte ve 10 nM endotele (Endo) maruz kalındığında HBSS'de intraasinar arteriol gösteren temsili görüntüler. (D) 1 günlük (gri çizgi) ve 5 günlük (siyah noktalı çizgi) kültürü takiben PCLS'lerde MCh'ye doza bağımlı hava yolu kontraktil yanıtları. Her nokta, iki fareden dokuz hava yolunun ortalama ± SEM'ini temsil eder. (E) 10 nM endotelin indüklediği hava yolunu ve pulmoner arteriyel kontraksiyonu, ardından nitrik oksit donörü olan 100 μM NOC-5'i gösteren temsili görüntüler, indüklenmiş gevşeme. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: PCLS'de hava yolu ve pulmoner arteriyel SMC'lerin Ca2+ sinyalizasyonu. (A) SMC'lerin Ca 2+ görüntülemesi için odak düzleminde bir PCLS'yi tutmak için üst ve alt kapak camı, gres contası ve naylon bir ağ içeren bir odanın kurulumunu gösteren şema. (B) İstirahatte ve 1 μM MCh'ye maruz kaldıktan sonra hava yolu SMC'lerinin Ca2+ sinyalini gösteren temsili floresan görüntüler. Epi, epitel hücresi. (C) İstirahatte ve 10 nM endotele (Endo) maruz kaldıktan sonra pulmoner arteriyel SMC'lerin Ca2+ floresan görüntüleri. Koyu beyaz oklar pulmoner arterin uzunlamasına eksenini gösterir ve uç oklu noktalı çizgiler arteriyel duvar etrafındaki vasküler SMC'lerin sarmal dağılımını gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Ca2+ floresan yoğunluğunun (Ft) salınımlı yükselmesi, dinlenme durumundaki floresan yoğunluğuna (F0) oranla, bir hava yolu SMC'sinde 1 μM MCh'ye (D) ve pulmoner arteriyel SMC'de 10 nM endotelin stimülasyonuna (E) yanıt olarak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.