Yöntem makalesi

Hava yolu ve intrapulmoner arteriyel düz kasın kasılma regülasyonunu incelemek için hassas kesilmiş akciğer diliminin kullanılması

DOI:

10.3791/63932

⸱

5 Mayıs 2022

 , 
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, neredeyse in vivo bir ortamda hava yolunu ve intrapulmoner arteriyel düz kas kontraktilitesini değerlendirmek için fare hassasiyetiyle kesilmiş akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ve kullanılmasını açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düz kas hücreleri (SMC), sırasıyla hava akımı direncini ve pulmoner dolaşımı değiştirmek için hava yolunun ve intrapulmoner arterin kasılmasına aracılık eder, bu nedenle pulmoner sistemin homeostazında kritik bir rol oynar. SMC kontraktilitesinin deregülasyonu, astım ve pulmoner hipertansiyon dahil olmak üzere çeşitli akciğer hastalıklarına katkıda bulunur. Bununla birlikte, sınırlı doku erişimi ve in vivo SMC fenotiplerini korumak için kültür sistemlerinin eksikliği nedeniyle, bu hastalıklarda deregüle SMC kontraktilitesinin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak tanımlanmaya devam etmektedir. Hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), bu teknik zorlukları ortadan kaldıran bir ex vivo model sunar. Canlı, ince bir akciğer dokusu kesiti olarak PCLS, SMC'yi doğal ortamda tutar ve SMC kontraktilitesini düzenleyen SMC kontraksiyonunun ve hücre içi Ca2+ sinyallemesinin yerinde izlenmesini sağlar. Burada, sağlam hava yollarını ve intrapulmoner arterleri koruyan ayrıntılı bir fare PCLS hazırlama protokolü sağlanmaktadır. Bu protokol, akciğer lobunu dilimlemeye maruz bırakmadan önce iki temel adımı içerir: trakeadan düşük erime noktalı agaroz ile hava yolunu şişirmek ve pulmoner damarları sağ ventrikülden jelatin ile doldurmak. Bu protokol kullanılarak hazırlanan PCLS, hem hava yolu hem de intrapulmoner arteriyel kompartmanlarda SMC'nin Ca2 + aracılı kontraktil regülasyonunu değerlendirmek için biyotahliller için kullanılabilir. Solunum yolu hastalıklarının fare modellerine uygulandığında, bu protokol SMC'nin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağlar, böylece hastalıklarda SMC kontraktilitesi deregülasyonunun altında yatan mekanizma hakkında fikir verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düz kas hücresi (SMC), öncelikle hava yollarının ve pulmoner damarların medya duvarında bulunan, akciğerde önemli bir yapısal hücre tipidir. SMC'ler luminal kalibreyi değiştirmek için büzülür, böylece hava ve kan akışını düzenler 1,2. Bu nedenle, SMC'lerin kontraktil regülasyonu, hava ventilasyonu ve pulmoner dolaşımın homeostazını korumak için esastır. Buna karşılık, anormal SMC kontraktilitesi obstrüktif hava yolunu veya astım ve pulmoner arteriyel hipertansiyon gibi pulmoner vasküler hastalıkları tetikler. Bununla birlikte, akciğer SMC'lerinin fonksiyonel değerlendirmesi, akciğer dokusuna, özellikle de akciğerin distal kısmındaki küçük hava yollarına ve mikrodamarlara sınırlı erişim nedeniyle zorlanmıştır 2,3. Mevcut çözümler, hava yolu daralmasını yansıtmak için Flexivent ile hava akımı direncini ölçmek ve pulmoner vazokontraksiyonu değerlendirmek için sağ kalp kateterizasyonu ile pulmoner arteriyel kan basıncını kontrol etmek gibi dolaylı testlere başvurmaktadır 4,5. Bununla birlikte, bu dolaylı tahlillerin, yapısal faktörler tarafından karıştırılması, tüm akciğer skalası 6,7'deki hava yolunun veya vasküler yanıtların mekansal çeşitliliğini yakalayamaması ve hücresel düzeyde kontraktil regülasyonun mekanik çalışması için uygun olmaması gibi birçok dezavantajı vardır. Bu nedenle, SMC çalışması için in vitro olarak izole primer hücreler, trakea/bronş kas şeritleri 8,9 veya büyük vaskülersegmentler 10 kullanılarak alternatif yaklaşımlar uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin de sınırlamaları vardır. Örneğin,11,12 kültür koşulundaki primer SMC'lerin hızlı bir fenotipik adaptasyonu, bulguları hücre kültüründen in vivo ortamlara tahmin etmeyi sorunlu hale getirmektedir. Ek olarak, izole proksimal hava yolu veya vasküler segmentlerdeki SMC'lerin kontraktil fenotipi, distal akciğer 6,7'deki SMC'leri temsil etmeyebilir. Dahası, doku seviyesindeki kas kuvveti ölçümü, kasılma regülasyonuna mekanik bakış açısı için gerekli olan moleküler ve hücresel olaylardan ayrışmış olarak kalır.

Canlı bir akciğer dokusu kesiti olan hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS), pulmoner SMC'leri yakın in vivo mikro ortamda (yani, korunmuş çok hücreli mimari ve etkileşim) karakterize etmek için ideal bir ex vivo araç sağlar13. Dr. Placke ve Fisher, 1980'lerde agarozla şişirilmiş sıçan ve hamster akciğerlerinden akciğer dilimlerinin hazırlanmasını ilk kez14,15'te tanıttığından beri, bu teknik, PCLS'lere biyomedikal araştırmalar için daha yüksek kalite ve çok yönlülük sağlamak için sürekli olarak geliştirilmiştir. Önemli bir gelişme, trakea yoluyla agarozlu akciğer enflasyonuna ek olarak, jelatin infüzyonu ile pulmoner arteriyel korumanın arttırılmasıdır. Sonuç olarak, ex vivo değerlendirme16 için PCLS'de hem hava yolu hem de pulmoner arterler sağlam tutulur. Ayrıca, PCLS kültürde uzun süre uygulanabilir. Örneğin, fare PCLS'lerinin kültürde en az 12 gün boyunca hücre canlılığı ve metabolizmasında önemli bir değişiklik olmadı ve ayrıca 7 güne kadar hava yolu kontraktilitesini korudular17. Ek olarak, PCLS kasılma ve gevşeme tahlilleri için farklı boyutlarda hava yolları veya damarlar tutar. Ayrıca, hücre kontraktilitesinin belirleyici faktörü olan SMC'lerin hücre içi Ca2+ sinyalizasyonu, bir konfokal veya 2-foton mikroskobu13 tarafından görüntülenen Ca 2+ muhabir boyaları ile test edilebilir.

Fare modelinin akciğer araştırmalarında kapsamlı bir şekilde uygulanması göz önüne alındığında, burada ex vivo akciğer araştırması için sağlam hava yolları ve intrapulmoner arterlere sahip fare PCL'lerinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Hazırlanan PCLS'leri kullanarak, konstrüktif veya gevşetici uyaranlara karşı hava yolu ve pulmoner arteriyel yanıtların nasıl değerlendirileceğini gösterdik. Ek olarak, PCLS'yi Ca 2+ muhabir boyası ile yükleme ve daha sonra kasılma veya gevşetici yanıtlarla ilişkili SMC'lerin Ca2+ sinyallemesini görüntüleme yöntemi de tanımlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan bakımı, Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygundu. Bu çalışmada 8 haftalık vahşi tip C57/B6 erkek fareler kullanılmıştır.

1. Deneysel hazırlık

  1. Çalışma çözümünü hazırlayın.
    1. 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini hazırlayın (HBSS, Ca 2+ ve Mg 2+ ile ve pH20 mM HEPES ile dengelenmiştir, Malzeme Tablosuna bakınız). PCLS'yi hazırlamak ve işlemek için HBSS çözümünü kullanın. PCLS'leri hazırlarken HBSS solüsyonunu buz üzerinde soğuk tutun.
  2. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı ve F-12'yi (DMEM-F12) bir antibiyotik-antimikotik ajanla destekleyerek PCLS'nin kültür ortamını hazırlayın (1:100 hacim oranı, bakınız Malzeme Tablosu).
  3. % 1.5 agaroz ve% 6 jelatin çözeltisi hazırlayın.
    1. Düşük erime noktalı (LMP) agaroz veya jelatin tozunu (bakınız Malzeme Tablosu) HBSS çözeltisi ile ayrı ayrı 15 mL steril santrifüj tüplerinde (veya çözelti hacmi >10 mL) 50 mL tüplerde) nihai konsantrasyonlara karıştırın.
      NOT: Agaloz çözeltisinin toplam hacmi = 5 mL/fare x fare sayısı; jelatin çözeltisi = 2 mL / fare x fare sayısı.
    2. Çözelti tüplerini, toz tamamen çözünene kadar kaynar suda ısıtın. Hem agaroz hem de jelatin çözeltilerini 42 °C su banyosunda tutun.
      NOT: Diseksiyon masasındaki bir ısıtma lambası, çalışma ortamını sıcak tutmak ve agaroz çözeltisinin fare akciğerine enjekte edilmeden önce katılaşmasını önlemek için yararlı olabilir.
  4. Bir çift diseksiyon makas, iki çift kavisli mikro diseksiyon forseps ve bir çift hemostatik forseps dahil olmak üzere tüm diseksiyon aletlerini, sterilizasyon için en az 20 dakika boyunca% 70 etanol çözeltisine batırın.
  5. Akciğer dokusunu ince dilimler halinde bölmek için bir vibratomu hazır tutun (bkz.
  6. Hava yolu veya vasküler kontraktil yanıtları değerlendirmek için CCD kameralı ters faz kontrastlı bir mikroskop ve pulmoner SMC'lerde Ca 2+ sinyallemesini değerlendirmek için özel yapım bir lazer taramalı konfokal mikroskop (bakınız Malzeme Tablosu) bulundurun18.

2. Fare akciğerlerinin agaroz ve jelatin çözeltisi ile şişirilmesi

  1. Fareyi ötenazileştirin.
    1. Fareyi% 5 izofluran içeren plastik bir odaya (yaklaşık 750cm3) yerleştirin. Fareyi en az 1 dakika boyunca nefes almayı bırakana kadar odada tutun.
      NOT: İntraperitoneal ketamin (240 mg/Kg) ve ksilazin (32 mg/Kg)19 veya pentobarbital (0.3 mL)20 enjeksiyonu gibi diğer primer ötenazi yöntemleri, inhale izoflurana alternatif olarak uygulanabilir.
    2. Fare gövdesini sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtasına yerleştirin. Kuyruğu, ön pençeleri ve kafayı 25 G şırınga iğneleriyle sabitleyerek vücudu yerinde sabitleyin ve% 70 etanol spreyi ile vücudu sterilize edin.
    3. Farenin karnını cerrahi makasla kesin (kesi, ~2 cm uzunluğunda x 2 cm genişliğinde). Ardından, kan hacmini tüketmek için abdominal aortu kesin.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek akciğer loblarını şişirin.
    1. Göğüs boşluğunu diyaframın üzerindeki sternum ve bilateral inferior göğüs kafesi boyunca dikkatlice açın ve göğüs boşluğu açıldığında akciğer loblarının çöktüğünü gözlemleyin.
    2. Kalbi açığa çıkarmak için bilateral ventral göğüs kafeslerinin bir kısmını çıkarın. Keskin makas ucunu akciğer dokusundan uzağa işaret ederek akciğer hasarından kaçının.
    3. Trakeayı açığa çıkarmak için fare boynundaki timus ve yumuşak dokuyu ayırmak için forseps kullanın.
    4. Trakeanın üst ucunda, 20 G Y şeklinde bir IV kateterin ucunun geçişine izin veren küçük bir delik (1,2 mm çapında) kesin (bkz.
    5. Y şeklindeki kateterin bir adaptör portunu 0,5 mL hava ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya ve diğer portu 2 mL sıcak% 1,5 agaroz çözeltisi (42 ° C) ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.
    6. Kateteri doldurmak için agaroz çözeltisi enjekte edin ve ardından kateteri önceden kesilmiş açıklıktan 5-8 mm uzunluğunda trakeaya itin.
    7. Agaroz çözeltisini yavaşça yaklaşık 1 mL / 5 s'de enjekte edin. Akciğer, proksimal-distal eksen boyunca genişleyecektir. Her akciğer lobunun kenarı şişirildiğinde enjeksiyonu durdurun.
      NOT: Akciğeri aşırı şişirmeyin, çünkü bu onu yırtabilir. Genç yetişkin bir farenin tüm akciğerini şişirmek için agaroz çözeltisinin hacmi yaklaşık 1.3 ± 0.1 mL'dir.
    8. Kateterdeki ve iletken hava yollarındaki artık agarozu distal alveol boşluğuna itmek için diğer şırıngadan 0.2-0.3 mL hava enjekte edin.
    9. Klipsle trakeayı bir çift kavisli hemostatik forseps ile kapatın (bkz.
  3. Pulmoner vaskülatürü doldurun.
    1. 1 mL'lik bir şırıngayı ılık% 6 jelatin ile doldurun. Bir iğne derisi damar kateterine bağlayın, kateteri jelatin çözeltisi ile doldurun ve ardından sağ ventrikülü iğne ile inferior duvara yakın delin.
    2. İğneyi 2-3 mm uzunluğunda sağ ventriküle itin ve iğne ucunu ana pulmoner artere doğrultun.
    3. 0.2 mL jelatin çözeltisini yavaşça sağ ventrikül ve pulmoner arteriyel damarlara enjekte edin.
      NOT: Akciğer lobları uygun jelatin şişirmesi ile biraz daha solgun görünür.
    4. İğneyi enjeksiyondan sonra 5 dakika yerinde tutun, kalp ve akciğere buz gibi soğuk HBSS çözeltisi dökerek akciğer loblarını soğutun, ardından vücudu diseksiyon tahtası ile 4 ° C'lik bir buzdolabına veya toplam 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
    5. Fare akciğerini ve kalbini çevredeki bağ dokularından makasla çıkarın. Daha sonra, her akciğer lobunu ayırın ve buz üzerinde HBSS çözeltisinde saklayın.

3. Akciğer loblarının ince dilimlere ayrılması

  1. Numune kolonunun üstündeki akciğer lobunu süper yapıştırıcı ile kesin ve takın ve kesme yönünün hiladan akciğer yüzeyine kadar çoğu hava yoluna dik olmasını sağlamak için lobu (Şekil 1A, B) yönlendirin.
  2. Akciğer lobunu 150 μm dilimler halinde kesmek için taze ince bir tıraş bıçağı ile bir vibratom kullanın. Dilimleri soğuk HBSS çözeltisi ile önceden doldurulmuş 100 mm steril Petri kaplarında toplayın.
    NOT: Dilimlemeye başlamadan önce uygun bıçak hareket hızını ve salınım frekansını ayarlayın. Bir Compresstom için tipik bir ayar Hız seviyesi 4 ve Salınım seviyesi 4'tür.
  3. Dilimleri DMEM/F-12 kültür ortamı (20 dilim/15 mL orta/çanak) ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın ve deneylerden önce gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde saklayın.
    NOT: Fare PCLS'leri hava yolu kontraktil yanıtlarını kaybetmeden yaklaşık 7 gün boyunca kültürde tutulabilir17. Pulmoner arterlerin ömrü tam olarak değerlendirilmemiştir. Gözlemlerimizde, DMEM / F12 ortamında en az 3 gün boyunca sağlam yapı ve vazoreaksiyonu korurlar. Uzun süreli depolama için, fare PCLS'leri% 10 DMSO (şişe başına 1 mL ortamda 5 dilim) içeren DMEM / F12 ortamı ile doldurulmuş kriyovyallere yerleştirilebilir, gece boyunca -80 ° C'de izopropil alkol dolu bir kapta dondurulabilir ve haftalarcaila 21. aylar boyunca sıvı azotta kriyo-korunabilir.

4. İntrapulmoner hava yolları ve arterlerin kontraktil yanıtlarının analizi

  1. PCLS'leri HBSS dolgulu 24 delikli bir kültür plakasına, her bir kuyucuğa bir tane yerleştirin. PCLS'yi kuyunun ortasına yerleştirin, ardından HBSS solüsyonunu bir pipetle çıkarın.
  2. Mikroskop altındaki dilimde hedef hava yolunu ve kabı bulun, ardından hedef alanı ortaya çıkarmak için önceden kesilmiş merkezi bir deliğe (2-3 mm çapında) sahip naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün.
  3. Dilimleri yerinde tutmak için ağın üzerine içi boş bir metal yıkayıcı yerleştirin (Şekil 2A).
  4. PCLS'yi suya batırmak için 600 μL HBSS çözeltisi ekleyin. Dilimi 10 dakika dinlendirin, ardından hava yollarının veya gemilerin temel görüntülerini kaydedin.
  5. Boş HBSS solüsyonunu bir pipetle dikkatli bir şekilde emerek ve 1 μM metakolin (MCh) veya 10 nM endotelin gibi bir agonistle 600 μL HBSS ekleyerek hava yolunu veya vasküler kontraksiyonu indükleyin (bkz.
    NOT: Alet seti standardı olarak KCl stimülasyonu, metakolin veya endotel maruziyetinden önce gerekli değildir. Fare hava yollarında 100 mM KCl stimülasyonu sadece küçük ve düzensiz bir hava yolu kasılmasına neden olur (%10-%15)20. Benzer şekilde, aynı agonistin, örneğin metakolin veya serotoninin, ilk ve tekrarlayan maruziyetlerde benzer hava yolu kasılmasını tetiklediğini doğruladığımız için bir astarlama metakolin stimülasyonu zorunlu değildir20,22.
  6. Luminal alan değişimi dengeleyici bir duruma ulaşana kadar mikroskop altında reaksiyonu gözlemleyin ve ardından analiz için hava yolunu veya vasküler görüntüleri kaydedin.
  7. MCh veya endotelin solüsyonunu bir pipetle çıkarın ve aynı agonist konsantrasyonuna ve gevşeticiye sahip yeni bir 600 μL HBSS çözeltisi ekleyin; hava yolunu veya vasküler gevşemeyi gözlemleyin ve kaydedin.
  8. Aşağıdaki adımları izleyerek hava yolunu veya vasküler reaksiyonu ölçün.
    1. Görüntüleri NIH sponsorluğundaki özgür yazılım FIJI'ye yükleyin.
    2. Her çerçevedeki hava yolunu veya vasküler lümeni ana hatlarıyla belirtmek için araç çubuğunda Poligon Seçimi'ni seçin.
    3. Analiz Et > Ölçümleri > Ayarla'yı seçin.
    4. İlgi alanını ölçmek için Analiz > Ölçü'yü seçin. Sonuçlar istatistiksel analiz için ayrı bir pencerede gösterilir.

5. Hava yolu veya vasküler SMC'lerin Ca2+ sinyalizasyonunun analizi

  1. Ca2+ boya yükleme tamponunu hazırlayın.
    1. Ca2+ boya, Oregon Green 488 BAPTA-1-( Malzeme Tablosuna bakınız), 50 μg (bir şişe) 10 μL DMSO ile çözün.
    2. % 20'lik bir Pluronik çözelti oluşturmak için 0.2 g Pluronik F-12 tozunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL DMSO'da çözün.
    3. 10 μL% 20 Pluronik çözeltiyi, 10 μL Ca2+ boya-DMSO çözeltisi ile karıştırın.
    4. 200 μM sülfobromoftalin içeren 2 mL HBSS çözeltisine 20 μL karışım ekleyerek Ca 2+ boya yükleme tamponu yapın (bkz.
  2. 2 mL Ca 2+ yükleme tamponuna 15 fare PCL'si yerleştirin ve 1 saat boyunca 30 °C'de inkübe edin. Daha sonra dilimleri, oda sıcaklığında floresan boya deesterifikasyonu için 30 dakika daha 100 μM sülfobromoftalin içeren 2 mL HBSS çözeltisine taşıyın.
  3. SMC'lerin Ca2+ sinyalizasyonunu tespit edin.
    1. Ca2+ boya yüklü dilimleri büyük bir kapak camına yerleştirin.
    2. 3 mL'lik bir şırıngayı yüksek vakumlu silikon gres ile doldurun. Gresi 18 G körelmiş bir iğneden sıkarak dilimin üstündeki ve altındaki kapak camı boyunca iki paralel çizgi çizin.
    3. İki gres hattı arasında naylon bir ağ kullanarak dilimi örtün. Yanlarda gresle kapatılmış bir oda oluşturmak için ikinci kapak camını ağın üzerine yerleştirin (Şekil 3A).
      NOT: Naylon ağ, dilimi alt kapak kaymasına bağlı tutmak ve böylece 40x yağ gibi yüksek büyüklükte ters çevrilmiş bir hedefin çalışma mesafesinde kalmak için gereklidir.
    4. HBSS veya agonist solüsyonunu manuel olarak veya bir perfüzyon sistemi aracılığıyla pipetleme yaparak bir ucundan hazneye ekleyin. Sürekli sıvı perfüzyonu durumunda diğer ucundan kağıt mendil veya vakum ile emerek sıvıyı odadan çıkarın.
    5. PCLS odasını mikroskop aşamasına yerleştirin. SMC23'ün Ca2+ sinyalini, 15 veya 30 görüntü/sn lazer tarama hızına sahip özel yapım rezonans taramalı konfokal mikroskopla algılayın.
      NOT: Alternatif olarak, şu anda yaygın olarak bulunan yüksek hızlı bir ticari lazer taramalı konfokal mikroskop, PCLS'deki pulmoner SMC'lerin Ca2+ sinyal tahlilinde uygulanabilir.
  4. SMC'lerde Ca2+ floresansını ölçün.
    1. Kaydedilen görüntü dizisini FIJI'ye yükleyin ve 8 bit gri tonlamalı Görüntü > Türü>nü seçin.
    2. Araç çubuğunda Dikdörtgen Seçimi'ni seçin ve düz bir kas hücresinde 5 piksel x 5 piksellik bir ilgi alanı (YG) tanımlayın.
    3. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla > Ca 2+ floresan yoğunluğunu temsil eden Ortalama gri değer'i seçin.
    4. Bir yatırım getirisinin konumu SMC daralmasıyla birlikte değişirse, Ca2+ floresan yoğunluğunu kare kare ölç > Analiz Et'i seçin.
    5. SMC'nin yatırım getirisi bir görüntü yığınında benzer bir konumda kalırsa, Görüntü > Yığınları > Ca 2+ floresan yoğunluğunun yığınını ölç'ü seçin.
      NOT: Özel olarak yazılmış bir makro, bir görüntü yığınında daralma ile hareket ettiğinde SMC içindeki YG'yi izlemek için takılabilir ve YG'nin Ca2+ yoğunluğunu (gri değer) kare kare otomatik olarak ölçer.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bozulmamış intrapulmoner hava yollarını ve arterleri koruyan fare PCLS preparatı
Ters faz kontrast mikroskobu altında 150 μm kalınlığında bir PCLS gözlendi. Fare akciğerlerinde, iletken hava yollarına, hilustan periferik akciğere uzanan intrapulmoner arterler eşlik eder. Bir fare PCLS'sinde temsili bir pulmoner hava yolu-arter demeti Şekil 2B'de gösterilmiştir. Hava yolu, lümenin iç yüzeyini kaplayan aktif siliyal atımlı küboidal epitel hücreleri ile kolayca tanımlanabili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCLS'nin hazırlanması birkaç kritik adımı içerir. İlk olarak, doku sertliğinin düzensiz agaroz dağılımından değişmesini önlemek için akciğer lobunu homojen olarak şişirmek esastır. Sıvı agaroz, 37 ° C'nin altındaki bir sıcaklıkta ince kateterlerde veya hava yollarında hızla jelleştikçe, distal akciğer alanında ortaya çıkan dolgu defekti, akciğer dokusu sertliğinin eşitsizliğini artırabilir ve vibratom kesiti sırasında doku yırtılmasına neden olabilir. Bu nedenle, düşük erime noktalı agaroz çözeltisini bir su banyosunda 4...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH hibeleri, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırıngaBD309626
15 mL steril santrifüj tüpleriCelltreat229411
3 mL şırıngaBD309585
50 mL steril santrifüj tüpleriCelltreat229422
Asetil-beta-metakolinMillipore Sigma62-51-1
Antibiyotik-anitikotikTermo Fisher15240-062
CCD fotoğraf makinesiNikonNikon Ds-Ri2 fotoğraf makinesi
Kapak gözlükleriFisher Scientific12-548-5CP; 12-548-5PP
Kriyojenik şişelerFisher Scientific430488
Özel yapım lazer taramalı konfokal mikroskopReferans 18
DMEM/F12Fisher ScientificMT-10-092-CM
Endotelin 1Milipor SigmaE7764
İnce diseksiyon makasFisher ScientificNC9702861
Dondurma kabıSigma-AldrichC1562
Domuz derisinden jelatinSigma-Aldrich9000-70-8
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Thermo Fisher
Hemostatik forsepFisher Scientific16-100-117
HEPESThermo Fisher15630080
Yüksek vakumlu silikon gresFisher Scientific146355d
İzopropil alkolSigma-AldrichW292907-1KG-K
Metal yıkayıcılarHome Depot Ürün Otoritesi800442Everbilt Düz Pullar # 10
Mikro diseksiyon forsepSigma-AldrichF4142
İğne kafa derisi damar seti (25 G)EXELINT26708
NOC-5Cayman Chemical16534
Naylon örgüBileşen KaynağıU-CMN-300
Oregon yeşili 488 BAPTA-1Yaşam Teknolojilerio-6807
Faz kontrastı mikroskopNikonNikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127Thermo FisherP-6867
Tıraş bıçağıPersonnaPersonna Çift Kenarlı Tıraş Bıçağı Beyaz Ambalajlı 100 adet
SülfobromoftaleinSigma-AldrichS0252
Süper YapıştırıcıKrazy TutkalKrazy Tutkal, Çok amaçlı
Ultra saf düşük erime noktası agarozThermo Fisher16520050
VibratomHassasVF 310-0Z
Vibratom soğutma bloğuHassasSKU-VM-CB12.5-NC
Vibratom numune tüpüHassasSKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y şekilli IV kateterBD383336BD Saf-T-Intima kapalı IV kateter
14025092

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172(2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252(2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636(2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795(2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566(2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Havayolu D z Kasntrapulmoner ArterD z Kas KontraktilitesiKalsiyum G r nt lemeKonfokal MikroskopiPulmoner Dola mEx Vivo Akci er ModeliHavayolu KontraksiyonuPulmoner Hipertansiyon

İlgili makaleler