Kardiyak Fonksiyonun Görüntülenmesi ve Optogenetik Kontrolü için Drosophila melanogaster Modellerinin Geliştirilmesi

2010 yılının sonunda, Nature Methods dergisi optogenetiği^Yılın Yöntemi 1 olarak seçti. İlgilenilen biyolojik dokuları benzeri görülmemiş bir hassasiyet ve hızla kontrol etmek için ışıkla düzenlenen genetik araçların (transgenik opsinler) kullanılması, yeni uygulamalar için bir sel kapısı açtı. Bugüne kadar, başarıların çoğu sinirbilime aittir. Teknoloji, tek nöronların hassas kontrolü için yeni bir yöntem olarak tanıtıldı² ve canlı organizma bilişsel işlevleri alanındaki keşiflere^{ilerledi 3}. En başından beri, sinirbilimciler tüm organizmanın davranışını modüle etme yeteneğini gösterdiler. Farelerde dopaminerjik nöronlarda ChR2 opsin'in ekspresyonu ve ışık aktivasyonu aktivasyonlarına neden oldu ve davranışsal koşullanmayı sürdürmek için yeterliydi⁴. Kemirgen beyninin epileptik odağına verilen halorhodopsin NpHR2.0 içeren nöronların bir alt kümesinin optogenetik inhibisyonu elektroensefalografik nöbetlerin zayıflamasına neden olmuştur⁵.

Kardiyolojide optogenetik uygulamalar istikrarlı bir hızla gelişmektedir⁶. ChR2, kardiyomiyositler hücre kültüründe ve farelerde başarıyla eksprese edildi; kalp hızı, mavi ışığın yanıp sönmesiyle gerçekleştirildi (canlı hayvanlarda implante edilmiş bir lif kullanılarak gerçekleştirildi)⁷. Zebra balığında, ChR2 eksprese edildi ve hız yapan kalp bölgesini tanımlamak için kullanıldı; NpHR aktivasyonuna bağlı kalp durması⁸. Optogenetik kardiyak pacing, yeni pacing ve resenkronizasyon tedavileri geliştirmek için eşsiz bir potansiyele sahiptir⁹. Son zamanlarda otojen aritmi sonlandırma sistemi kurma girişimleri de bildirilmiştir¹⁰.

Kapsamlı araştırmalar ve yeni terapötik tedavilerin geliştirilmesi, hücre kültüründen memelilere kadar çeşitli model sistemlerin uygulanmasını gerektirir. Bir omurgalının kalbi çok karmaşık bir organdır. Kardiyomiyositler (CM) tüm kalp hücrelerinin üçte birini oluşturur; diğer hücreler arasında nöronlar, vasküler düz kas hücreleri ve uyarılamayan hücreler (yani, endotel hücreleri, fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri) bulunur. CM hücre kültürünün araştırılması, elde edilen sonuçların insan tıbbi uygulamalarına çevrilmesini sınırlar. Memeli model organizmaların genetik manipülasyonları sınırlıdır ve zaman alıcıdır. Daha küçük omurgasız modellerin birçok avantajı vardır; kardiyovasküler sistemleri tüm gerekli histolojik unsurları taşır. Drosophila melanogaster (meyve sineği), kalp hastalıkları da dahil olmak üzere insan hastalıklarıyla ilişkili genlerin rolünü araştırmak için basit ve güçlü bir genetik model sistemidir^11,12,13. Kısa ömürlü hayvanlar olarak, meyve sinekleri yaşam boyunca izlenebilen yaşa veya hastalığa bağlı kardiyak fonksiyon değişikliklerini modellemek için mükemmel bir fırsatı temsil eder^14,15,16,17. Meyve sineğinin kalp tüpü, vücudunun sırt tarafında, kütikül yüzeyinin 200 μm içinde bulunur ve yakın kızılötesi ışığın kalp tüpüne ulaşmasına izin verir. Bu anatomik özellik, mevcut optogenetik araçları kullanarak Drosophila kalbinin invaziv olmayan optik temposunu sağlar.

Drosophila kalbini izlemek için, entegre kırmızı ışık LED uyarma modülüne sahip özel bir spektral-alan optik koherens tomografi (SD-OCT) görüntüleme sistemi geliştirilmiştir¹⁸. Nispeten basit bir meyve sineği kalbindeki morfolojik ve ritmik değişiklikler, bu non-invaziv biyomedikal görüntüleme teknolojisi ile kolayca analiz edilebilir 12,19,20,21. Gelişmiş optik kesitleme performansı ve mikron ölçeğinde uzamsal çözünürlük ile OCT, Drosophila kalbinin yapısını araştırmak ve 3. instar larva ve erken pupa¹⁸ dahil olmak üzere farklı gelişim aşamalarındaki işlevini izlemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu sistem aynı zamanda Drosophila'nın bozulmamış hayvandaki kalp durumunun eşzamanlı olarak izlenmesini ve uyarılmasını sağlar. OCT sisteminin şematik görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir. SD-OCT sistemi, ışık kaynağı olarak bir süperlüminesan diyot (SLD) kullanır (merkez dalga boyu: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, bakınız Malzeme Tablosu). 10x objektif lens kullanarak, OCT görüntüleme sistemi havada ~ 4.4 μm ve dokuda ~ 3.3 μm'lik bir eksenel çözünürlük ve ~ 2.8 μm'lik bir yanal çözünürlük elde edebilir, bu da sinek kalp yapılarının ince ayrıntılarını çözmek için yeterlidir^18,22. Referans kolundan ve örnek koldan yansıyan ışığın parazit sinyalleri, 2048 piksel çizgi tarama kameralı bir spektrometre kullanılarak algılanır (maksimum çizgi hızı: 80 kHz, bkz. Ölçülen sistem hassasiyeti ~ 95.1 dB'dir. Her B modu OCT taraması, xz görüntü düzleminde kesitsel bir görüntü oluşturur. Tekrarlanan B modu görüntüleri, ~ 30 s ^18,22,23'ün üzerinde atan kalbi yakalayan M modu görüntüleri oluşturmak için aynı yerde elde edilir. M modu görüntüleme için kare hızı, meyve sineği kalp atış dinamiklerini yakalamak için yeterli olan ~ 125 kare / s'dir.

Drosophila kalp fonksiyonunun optogenetik regülasyonu için, 617 nm LED ışık kaynağına sahip bir aydınlatma modülü, SD-OCT sisteminin örnek koluna entegre edilmiştir. Stimülasyon ışığı, numune yüzeyindeki ~ 2,2 mm çapında bir noktaya, görüntüleme odak noktasıyla aynı konumda odaklanır. Aydınlatma modunu (ışık yoğunluğu, darbe genişliği ve görev döngüsü) kontrol etmek, ışık darbesi stimülasyon frekansını ayarlamak ve LED modül aydınlatmasını ve M modu OCT görüntüleme alımını senkronize etmek için özel olarak yazılmış bir yazılım kullanılır²².

Son yayınlar, UAS / GAL4 genetik sistemini kullanarak mekansal olarak düzenlenmiş ChR2, ReaChR ve eNpHR2.0 opsinlerinden oluşan Drosophila transgenik sistemini tanımladı. Elde edilen sonuçlar, eNpHR2.0'ın kırmızı ışık aktivasyonunun neden olduğu kalp durması ve bradikardi ve ChR2'nin mavi ışık aktivasyonunun neden olduğu daha yüksek frekanslı kalp temposunu başlatma yeteneğini göstermiştir. Benzer pacing deneyleri, kırmızı ışık aydınlatması^22,23,24 ile indüklenebilen başka bir channelrhodopsin olan ReaChR ile gerçekleştirildi. Tarif edilen tüm deneylerdeki opsin ekspresyonu, opsin ekspresyonunun kardiyomiyositler ve çevresindeki kas hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli dokularda gözlendiği 24B-GAL4 tarafından yönlendirildi. Bu çalışmada, kalbe özgü eNpHR2.0 ve ReaChR opsins ekspresyonunu elde etmek için 24B-GAL4 bir Hand-GAL4 sürücüsü ile değiştirildi.

Genel olarak, sunulan deneysel sonuçlar restore edilebilir kalp durması ve indüklenebilir bradikardi ve taşikardi kalp rahatsızlıklarını göstermektedir. Transgenik Drosophila modelleri oluşturma ve canlı hayvanlarda eşzamanlı OCT görüntüleme ve optogenetik pacing deneyleri yapma konusunda adım adım talimatlar içeren ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

Bu çalışmada eNpHR2.0 transgenik hat w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR transgenik çizgi w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO ve El geni düzenleyici fragmanı içeren kalbe özgü GAL4 sürücüsü w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (bu sürücü stoğu Hand-GAL4 olarak belirtilecektir) kullanılmıştır. y[*] w[*]; GFP muhabir satırı olarak P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 kullanılmıştır. Söz konusu Drosophila stokları Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden (BDSC, bakınız Malzeme Tablosu) elde edilmiş ve standart mısır unu ortamında oda sıcaklığında veya 18 °C'de muhafaza edilmiştir. Bu çalışmada geliştirilen Drosophila modelleri, işbirlikçi çalışma için talep üzerine mevcuttur.

1. Drosophila genetik haçları ve medya hazırlığı

1. 3. kromozom dengeleyici TM3 Sb[1] 'yi TM6 Sb Tb olarak değiştirin, w [1118] oluşturun; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Geçiş şeması için Ek Şekil 1'e bakınız. Haçları normal mısır unu ortamı ile şişelere yerleştirin.
   NOT: Bir Tb işaretleyicisinin varlığı, kullanıcıların opsin transgeni içeren larva ve pupaları ve GAL4 sürücüsünü opsin içeren hayvanlardan ayırt etmelerini sağlar, ancak sürücü²⁵ içermez.
2. Genetik haçları, larva toplama için 5 gün ve pupa toplama için 6 gün boyunca karanlıkta özel olarak formüle edilmiş all-trans retinaI (ATR) içeren ortam üzerinde 25 °C, %70 nem inkübatöründe tutun ( Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Şişe başına beş Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb bakire dişi ve UAS-opsin stoklarından (eNpHR2.0 veya ReaChR) iki ila üç erkeği birleştirin. Sırasıyla Şekil 2A ve Şekil 2B'deki eNpHR2.0 ve ReaChR opsin için çapraz diyagrama bakın.
4. Ertesi gün, ATR içeren medya şişeleri hazırlayın.
   1. BDSC^26'nın talimatlarına göre Yarı Tanımlı Yiyecekler hazırlayın. Sakkaroz ve glikoz yerine, sadece sakkaroz (5.14 g / 100 mL) ekleyin. Sürekli karıştırarak ~ 60 ° C'ye kadar soğutun.
   2. Dar sinek şişeleri hazırlayın ve her şişeye 50 μL 100 mM ATR-etanol çözeltisi ekleyin.
   3. Serolojik bir pipet kullanarak, sinek şişelerini daraltmak için sinek yiyeceklerini atın, şişe başına 5 mL. 10 s için maksimum hızda vorteks.
   4. Şişeleri takın ve ışıktan korumak için koyu renkli kumaşa sarın. Şişeleri en az 12 saat (gece boyunca) kurumaya bırakın.
5. Ertesi gün, sinekleri Adım 1.3'ten sürekli olarak yumurta bırakarak aktarın. ATR içeren gıdalara sahip şişelere (Adım 1.4.4.). Rafları şişelerle ışıktan koruyun.
6. 24-48 saat sonra (döşenen yumurta sayısına bağlı olarak), şişenin aşırı popülasyonunu önlemek için ebeveynleri atın.
7. Tb olmayan soyları toplayın ve kalp görüntülemesi için kullanın.
   NOT: Larva ve pupa evrelerindeki fenotipik farklılıklar Şekil 2C'de gösterilmiştir. Numune hazırlama adımlarının özeti ve yaklaşık zaman çizelgesi Şekil 3'te gösterilmiştir.

2. Drosophila kalbinin optogenetik kontrolü

1. Şişeden UAS-opsin / Hand-GAL4 larva / pupa'yı seçin (Adım 1.7.), mendil üzerine koyun ve bir boyama fırçası kullanarak ortamı vücut yüzeyinden nazikçe silin.
2. Mikroskop slaytını hazırlayın ve ortasına küçük bir çift taraflı bant parçası yerleştirin.
3. Bir fırça veya ince cımbız kullanarak, larva / pupa'yı sırt tarafı yukarı ve slaytın uzun tarafına dik olacak şekilde bant yüzeyine yavaşça yerleştirin. Larva / pupa'yı bant yüzeyine tutturmak için hafif basınç uygulayın.
4. Kaydırmayı görüntüleme aşamasında, larva / pupa aşağı bakacak şekilde ayarlayın.
5. Lazer kontrol yazılımı ile OCT ışık kaynağını açın (bkz. Özel olarak yazılmış SD-OCT kontrol yazılımını açın, ardından Önizleme penceresine tıklayın.
6. SD-OCT yazılımında tarama parametrelerini ayarlayın.
   NOT: Amaç, atan kalbin optimum görüntülenmesi için numuneyi hizalamaktır, bu nedenle X aralığı ve Y aralığı seçildiğinde kalbin bölgesi kapsanır. Bu adımda, hem A-tarama hem de B-tarama sayısı 400'dür. X ve y yönlerindeki aralık ~490 μm ve ~537 μm'dir ve kalbin iki ortogonal kesitini (xz ve yz) gösterir.
7. Sinek kalbini odak noktasına getirmek için numune aşamasını kontrol etmek için mikromanipülatörler kullanın. Sinek kütikülü yüzeyinden ışık yansımasını en aza indirmek için odak konumunu ayarlayın. Yansımayı en aza indirmek için larva / pupa yüzeyine mineral yağ uygulamayı düşünün.
   NOT: Yağ, bant yapıştırıcı özelliklerinden ödün vererek hayvan hareketi riskini artırabilir.
8. Sinek kalbinin görüntü penceresinde herhangi bir bozulma, doku tarafından engellenme ve ihmal edilemez gölgeler ve yansımalar olmadan tam olarak görülebilmesini sağlayın; aksi takdirde, Adım 2.7'ye geri dönün.
9. M modu OCT görüntü alma için tarama parametrelerini ayarlayın.
   NOT: A-tarama sayısı Adım 2.7'ye kıyasla daha azdır. sinek kalbinin atış dinamiklerini yakalamak için daha hızlı kare hızı için (birkaç Hz). B-tarama sayısı, kayıt süresine ve kullanılabilir sistem belleğine göre ayarlanabilen M modu görüntüleme için tekrarlanan karelerin sayısını gösterir. Bu deneyde, 128 A-taraması ~ 125 kare / sn hıza izin verebilir ve ~ 32 s'lik sürekli bir kayıt sağlayan 4.000 tekrarlanan B-taraması kaydedilir.
10. Dinlenme kalp atış hızını (RHR) hesaplamak için kırmızı ışık stimülasyon darbeleri olmadan beş kontrol verisi kümesi alın.
11. Özel OCT kontrol yazılımında hız stimülasyonu için ışık darbesini tasarlayın. "Ayarlar" da, farklı stimülasyon protokollerine göre darbe frekansını, darbe genişliğini, stimülasyon süresini ve bekleme süresini kontrol etmek için tasarlanmış ışık darbesi dizilerini ekleyin.
    NOT: RHR, ışık aydınlatması olmadan kontrol deneyinden ölçülür ve taşiklik ve bradikat deneyleri²² için ışığın hangi frekansta yanıp sönmesi gerektiğini hesaplamak için kullanılır.
12. Kırmızı ışık darbeleri oluşturmak için ışık kontrol cihazı yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu). " Mod Seçimi " nde Darbe Modunu seçin. "Darbe Profili" ayarları için rakama çift tıklayın ve Takipçi Modu'nu seçin. KAPALI yoğunluğunu 0 olarak tutun ve gerçek güç yoğunluğunu hesaplarken AÇIK yoğunluk yüzdesini ayarlayın.
    NOT: Stimülasyon ışığı darbeleri, Adım 2.12'deki ayarlara göre OCT kontrol yazılımından gelen bir sinyalle tetiklenir.
13. OCT kontrol yazılımında Acquire (Elde Et) seçeneğine tıklayarak atan Drosophila kalbinin ışık stimülasyonlu M-mode videolarını edinin . Ölçümleri 5x tekrarlayın.

3. Görüntü analizi

1. Özel olarak geliştirilmiş sinek kalbi segmentasyon yazılımını açın.
2. Dosya Seç'e tıklayın ve ardından görünen GUI'de analiz edilecek dosyayı seçin.
3. Kalp bölgesinin hem dikey hem de yatay sınırlarını üstteki metin kutularına piksel cinsinden girin. Yeniden Boyutlandır'a tıklayın. Alttaki kaydırıcıyı kullanarak tüm kalp bölgesinin görünür olduğundan ve tüm koleksiyon için tüm kutuyu doldurduğundan emin olun. Değilse, bu işlemi tekrarlayın ve sınırları ayarlayın.
4. Kalp bölgesini tahmin etmek için Tahmin Et'e tıklayın. Program şimdi koleksiyondaki her dilimden geçecek ve yaklaşık 3 dakika sürecek şekilde kalp bölgesini seçecek.
5. Tahmin tamamlandıktan sonra İK Grafiği'ne tıklayın. Bu, zaman içinde kalp bölgesinin bir grafiğini gösteren yeni bir pencere açacaktır. Doğru tepe veya vadi alanlarının seçildiğinden emin olun. Son bir rakam oluşturmak için Pulse'u ve ardından HR'yi seçin ve işlevsel parametreler aynı anda .csv dosyalarına kaydedilecektir.

Kalp tüpünde kırmızı ışığa duyarlı opsinler eNpHR2.0 veya ReaChR'yi eksprese eden D. melanogaster hayvanları, her UAS-opsin transgenik hattı ile Hand-GAL4 sürücüsü arasındaki haçtan soy elde edilerek üretildi. GAL4 sürücüsünün doku özgüllüğü GFP ekspresyonu görüntülenerek doğrulandı (Şekil 4). Drosophila 3. instar larva ve erken pupa gelişim aşamaları, kırmızı ışıkla eNpHR2.0 ve ReaChR aktivasyonunun etkilerini göstermek için kullanıldı. LED tarafından verilen ~ 617 nm kırmızı ışık darbeleri tasarlandı, larva / pupa'yı aydınlattı ve kalpteki eNpHR2.0 ve ReaChR'yi aktive etti. NpHR'nin bildirilen maksimum yanıt dalga boyu ~ 580 nm ve ReaChR'nin ~ 600 nm olmasına rağmen, 617 nm ışık aydınlatması, opsin eksprese eden kalp dokusuna doğru gelişmiş ışık enerjisi iletimi ile daha derine nüfuz edebilir22.

Ters çevrilmiş mikroskop kurulumunda dorsal tarafı aşağı bakacak şekilde mikroskop kaydırağına monte edilen larva / pupa, A7 vücut segmentine yönlendirilen bir LED ışık demeti ile aydınlatıldı. Vücut kesit görüntülerinin örnekleri Şekil 5A ve Şekil 6A'da gösterilmiştir. Kalp, 4.000 kareden oluşan video kayıtlarında kasılan ve genişleyen dairesel bir şekil olarak görünür (Ek videolar 1-6). Farklı kalp rahatsızlıklarını taklit etmek için, dört tip ışık darbesi tasarlandı. 5 s bekleme süresinden sonra 10 s süren tek bir nabız, Şekil 5B'de gösterildiği gibi eNpHR2.0 tarafından indüklenen restore edilebilir kalp durması üretti. eNpHR2.0'ın aracılık ettiği dinlenme kalp atış hızından (RHR) daha yavaş frekanslardaki kalp atış hızı için, aralarında 6 sn bekleme süresi olan RHR / 2 ve RHR / 4'e eşit tempo frekanslarına sahip iki ışık darbesi dizisi kullanılmıştır (Şekil 5C). Her ışık darbesi dizisinin görev döngüsü% 90 idi. Bu hafif stimülasyon rejimi, bradikardiye benzeyen bir kalp rahatsızlığına neden oldu. ReaChR aktivasyonu nedeniyle kalp atış hızını artırmak için stimülasyon paterni, sırasıyla RHR + 0.5 Hz, RHR + 1 Hz ve RHR + 1.5 Hz frekanslarında, 20 ms nabız genişliğine sahip üç ışık darbesi dizisinden oluşuyordu (Şekil 5D). Bu nabız rejimi taşikardik kalp rahatsızlığına neden olmayı amaçlıyordu. Işık gücü yoğunluğu tüm deneyler sırasında 7.49 mW /mm2 idi. Kontrol deneyleri için ışık aydınlatması ayarlanmadı.

Her deneysel varyant beş kez kaydedildi. Sinek kalbinin M modu videoları, FlyNet 2.027 kullanılarak 2D maskelere işlendi. Bu yazılım, kalp fonksiyonu veri kümelerini üretmek için kalp bölgesini otomatik olarak bölümlere ayırır. Program, her karede, kalp atış hızı (HR), diyastolik son boyut (EDD) ve sistolik sonu boyutu (ESD), fraksiyonel kısalma (FR), diyastolik sonu alanı (EDA), son sistolik alan (ESA) gibi atan kalbin fonksiyonel parametrelerinin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için gerekirse manuel olarak daha da düzeltilebilen bir kalp maskesi sağlar. Kalp atış hızı, kalp bölgesini zaman içinde analiz ederek ölçülür. Işık darbesi olmayan kontrol videosu, her hayvan için bir temel kalp atış hızı (örneğin, RHR) oluşturmak için kullanılır.

Şekil 5B ve Şekil 6B, larva ve pupada sırasıyla kırmızı ışık (617 nm) kullanan Hand>eNpHR2.0 aktivasyonunun neden olduğu 10 s uzunluğundaki kalp durmasını göstermektedir. Kırmızı ışık yandığında, Drosophila'nın kalbi atmayı bıraktı ve ışık aydınlatmasının sonuna kadar bu durumda kaldı. Kırmızı ışık kapatıldıktan sonra kalp fonksiyonu geri yüklendi. Opsin eksprese edilmeyen hayvanlar ("opsin" kontrolü yok) kırmızı ışık aydınlatmasına cevap vermedi (Ek Şekil 2A ve Ek Şekil 3A). 10 s kırmızı ışık aydınlatmasının açılmadığı Hand>eNpHR2.0 hayvanlarıyla yapılan kontrol deneyleri ("ışık yok" kontrolü), kalbin normal şekilde attığını gösterdi (Ek Şekil 4A ve Ek Şekil 4C).

Hand>eNpHR2.0 hayvanları kullanılarak, RHR'den daha düşük frekanslarda kırmızı ışık darbeleri uygulandı. Işık sinyallerini takiben kalp kasılma frekansı azaldı; Bu daha yavaş kalp atış hızı, bir tür kalp aritmisini, bradikardiyi taklit eder (larva ve pupa için sırasıyla Şekil 5C ve Şekil 6C). Daha yavaş kalp temposu "opsin yok" (Ek Şekil 2B ve Ek Şekil 3B) ve "ışık yok" (Ek Şekil 4A ve Ek Şekil 4C) kontrol deneylerinde gözlenmedi.

Kalp atış hızlarının arttırılması , Hand>ReaChR opsin'in kırmızı ışıklı darbe trenleri ile verilen hayvanın RHR'sinden daha yüksek bir frekansta aktive edilmesiyle sağlanabilir. Hand>ReaChR larvaları ve pupa kalplerine farklı stimülasyon frekanslarında (örneğin, RHR + 0.5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1.5 Hz) bir dizi üç ışık darbe treni uygulandı. Elde edilen veriler, ışık darbelerini takiben artmış kalp atış hızını açıkça göstermektedir (larva ve pupa için sırasıyla Şekil 5D ve Şekil 6D ). Bu deneylerde gösterilen kalp rahatsızlığı taşikardiyi taklit eder. Negatif kontrol deneyleri Ek Şekil 2C, Ek Şekil 3C ve Ek Şekil 4B, D'de gösterilmiştir.

Genel olarak, sonuçlar D. melanogaster'in transgenik hayvan modellerinde çeşitli gelişim aşamalarında kalp ritminin non-invaziv ve spesifik optogenetik kontrolünün fizibilitesini göstermektedir.

Şekil 1: Drosophila kalp fonksiyonunun optogenetik kontrolü için 617 nm LED modülü ile entegre OCT görüntüleme sistemi . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kalpte opsin eksprese eden D. melanogaster hayvanlarının üretilmesi. (A) Genetik çapraz diyagram. Hand-GAL4/TM6 SbTb dişileri eNpHR2.0 taşıyan erkeklere geçti. Elde edilen Hand-GAL4 / eNpHR2.0 soyu (kırmızı yıldız ile işaretlenmiş) OCT görüntüleme için toplandı ve Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb, fenotipik görünümlerine göre atıldı. (B) Genetik çapraz diyagram. Hand-GAL4/TM6 SbTb dişileri ReaChR taşıyan erkeklere geçti. Elde edilen Hand-GAL4 / ReaChR soyu (kırmızı yıldız ile işaretlenmiş) OCT görüntüleme için toplandı ve Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb fenotipik görünümlerine göre atıldı. (C) Hand-GAL4/opsin (kırmızı yıldız) ve Hand-GAL4/TM6 Tb soyu arasındaki fenotipik farklar. TM6 kromozomunda Tb gen mutasyonunu taşıyan hayvanlar, normal, Tb olmayan larva veya pupaya kıyasla "tubby" vücut şekline sahiptir. Sol panel larvaları gösterir; sağ panel erken pupaları gösterir. Görüntüler ayrıca 1 mm işaretli bir cetvel içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Görüntüleme hazırlama prosedürlerinin şematik sunumu ve zaman çizelgesi. Ebeveyn stokları sinek şişelerinde tutulur; bakire dişiler ve erkekler, normal yiyeceklerle dolu dar şişelerde (sarı renkle gösterilir) çaprazlanır. Aktif olarak yumurtlayan sinekler, ATR içeren ortamlara (kahverengi olarak gösterilmiştir) şişelere aktarılır. Gelişmekte olan soyu olan şişelerin bu adımdan karanlıkta tutulması gerekir. 3. instar larvaları ve erken pupalar görüntüleme için flakon duvarlarından toplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Hand-GAL4 (BDSC 48396) tarafından tahrik edilen UAS-GFP'YI (BDSC 6658) ifade eden D. melanogaster erken pupa. Floresan desen, Hand-GAL4 sürücüsünün kalbe özgüllüğünü doğrular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: D. melanogaster larvalarında kalp durması, bradikardi ve taşikardi simülasyonu. (A) Larva gövdesi kesitinin OCT görüntüsü. Kalp, vücut yüzeyinin altında bir daire olarak görünür. (B) Geri yüklenebilir kalp durmasının grafik sunumu. Üst panel, kırmızı ışık aydınlatmasının zamanlamasını (X ekseni) gösterir (Y ekseni, ışık kaynağı güç seviyesi yüzdesi). Orta panel, kalp alanındaki (Y ekseni, mikrometre kare) zamanla (X ekseni) değişimi gösterir. Alt panel, kalp atış hızının zaman içindeki değişimini (Y ekseni, hertz) gösterir (X ekseni). (C) eNpHR2.0 aracılı restore edilebilir bradikardisinin grafik sunumu. Üst panel, iki bradikardi periyoduna neden olan kırmızı ışık aydınlatmasının darbelerini gösterir: RHR'nin% 50'si ve RHR'nin% 25'i. Kalp alanı ve kalp atış hızı değişiklikleri sırasıyla orta ve alt panellerde gösterilir. (D) Aktif ReaChR ile kalp hızının grafik sunumu. Üst panel, RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz ve RHR + 1,5 Hz frekanslarında meydana gelen bir dizi 20 ms kırmızı ışık darbesini gösterir. Kalp kasılmaları, orta ve alt panellerde gösterildiği gibi ışık darbesi frekanslarını takip eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: D. melanogaster pupasında kalp durması, bradikardi ve taşikardi simülasyonu . (A) Pupa vücut kesitinin OCT görüntüsü. Kalp, vücut yüzeyinin altında bir daire olarak görünür. (B) Geri yüklenebilir kalp durmasının grafik sunumu. Üst panel, kırmızı ışık aydınlatmasının zamanlamasını (X ekseni) gösterir (Y ekseni, ışık kaynağı güç seviyesi yüzdesi). Orta panel, kalp alanındaki (Y ekseni, mikrometre kare) zamanla (X ekseni) değişimi gösterir. Alt panel, kalp atış hızının zaman içindeki değişimini (Y ekseni, hertz) gösterir (X ekseni). (C) eNpHR2.0 aracılı restore edilebilir bradikardisinin grafik sunumu. Üst panel, iki bradikardi periyoduna neden olan kırmızı ışık aydınlatmasının darbelerini gösterir: RHR'nin% 50'si ve RHR'nin% 25'i. Orta ve alt paneller sırasıyla kalp alanı ve kalp atış hızı değişikliklerini gösterir. (D) Aktif ReaChR ile kalp hızının grafik sunumu. Üst panel, RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz ve RHR + 1,5 Hz frekanslarında bir dizi 20 ms kırmızı ışık darbesi gösterir. Kalp kasılmaları, orta ve alt panellerde gösterildiği gibi ışık darbesinin frekanslarını takip eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: TM3 Sb dengeleyici kromozomunu TM6 Sb Tb ile değiştirmek için genetik haçlar. Bakire dişiler Hand-GAL4 w+/ TM3 Sb nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w+/ TM6 Sb Tb erkeklerle çaprazlandı. Bakire dişiler ve erkekler de dahil olmak üzere Hand-GAL4 w+/ TM6 Sb Tb soyu seçildi (tubby vücut şekli ile birlikte pigmentli gözlerin taranması). Seçilen sinekler istikrarlı bir stok oluşturmak için kendiliğinden geçti. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Kontrol deneylerinde, vahşi tip (wt) larvaların kalp ritmi kırmızı ışık aydınlatması üzerine değişmez. (A) Larvalarda kırmızı ışık aydınlatması sırasında kalp durması gözlenmedi. Üst panelde M modu kalp görüntüleri gösterilir. Kırmızı çizgi aydınlatma zamanlamasını gösterir. Orta ve alt paneller, 32 s görüntüleme süresi boyunca kalp bölgesini ve kalp atış hızlarını gösterir. (B,C) Kırmızı ışık darbeleri wt larvalarında kalp atış hızlarını değiştirmez. Üst paneller M modu kalp görüntülerini gösterir. Kırmızı çizgi aydınlatma zamanlamasını gösterir. Orta ve alt paneller, 32 s görüntüleme süresi boyunca kalp bölgesini ve kalp atış hızlarını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Kontrol deneylerinde, vahşi tip (wt) pupa'nın kalp ritmi kırmızı ışık aydınlatması üzerine değişmez. (A) Larvalarda kırmızı ışık aydınlatması sırasında kalp durması gözlenmedi. Üst panelde M modu kalp görüntüleri gösterilir. Kırmızı çizgi aydınlatma zamanlamasını gösterir. Orta ve alt paneller, 32 s görüntüleme süresi boyunca kalp bölgesini ve kalp atış hızlarını gösterir. (B,C) Kırmızı ışık darbeleri wt pupadaki kalp atış hızlarını değiştirmez. Üst paneller M modu kalp görüntülerini gösterir. Kırmızı çizgi aydınlatma zamanlamasını gösterir. Orta ve alt paneller, 32 s görüntüleme süresi boyunca kalp bölgesini ve kalp atış hızlarını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: El>eNpHR2.0 veya El>ReaChR'yi ifade eden D. melanogaster larvaları ve pupaları, kırmızı ışık aydınlatması olmadan OCT görüntüleme sırasında önemli İK değişiklikleri göstermez. (A) Hand>eNpHR2.0 larvalarının kalp atış hızları. (B) Hand>ReaChR larvalarının kalp atış hızları. (C) Hand>eNpHR2.0 pupasının kalp atış hızları. (D) Hand>ReaChR pupa'nın kalp atış hızları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Video 1: Aktif eNpHR2.0, D. melanogaster larvalarında kalp durmasına neden olur. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Video 2: Aktif eNpHR2.0, D. melanogaster pupa'da kalp durmasına neden olur. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Video 3: D. melanogaster larvalarında eNpHR2.0 aracılı restore edilebilir bradikardi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Video 4: D. melanogaster pupasında eNpHR2.0 aracılı restore edilebilir bradikardi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Video 5: D. melanogaster larvalarında aktif ReaChR ile kalp temposu. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Video 6: D. melanogaster pupasında aktif ReaChR ile kalp temposu. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.