Yöntem makalesi

Şizosakkaromices pombe'de Multicopy Suppressorların Tanımlanması için Genetik Ekran

DOI:

10.3791/63967

⸱

13 Eylül 2022

 ,  ,  , 
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Schizosaccharomyces pombe'de çok kopyalı baskılayıcı genetik ekran için bir protokolü açıklamaktadır. Bu ekran, bir sorgu mutant suşu ile ilişkili bir fonksiyon kaybı fenotipinin baskılayıcı klonlarını tanımlamak için genom çapında bir plazmid kütüphanesi kullanır. Bu ekran kullanılarak ell1 null mutantının yeni genetik baskılayıcıları tanımlandı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik etkileşimlerin tanımlanması, diğer genlerle olan işlevsel ilişkileri ve biyolojik yollar ve süreçler halinde organizasyonları hakkında fikir vererek genlerin işlevlerini deşifre etmek için güçlü bir araçtır. Genetik ekranların çoğunluğu başlangıçta Saccharomyces cerevisiae'de geliştirilmiş olmasına rağmen, bu genetik ekranların gerçekleştirilmesi için tamamlayıcı bir platform Schizosaccharomyces pombe tarafından sağlanmıştır. Genetik etkileşimleri tanımlamak için kullanılan yaygın yaklaşımlardan biri, fonksiyon kaybı mutantında genom çapında, yüksek kopya numaralı plazmid kütüphanesinden klonların aşırı ekspresyonu, ardından mutant fenotipini baskılayan klonların seçilmesidir.

Bu yazıda S. pombe'de bu 'çoklu kopya baskılama' tabanlı genetik taramanın gerçekleştirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu ekran, S. pombe'de Ell1 transkripsiyon uzama faktörünün yokluğu ile ilişkili genotoksik strese duyarlı fenotipin çoklu kopya baskılayıcılarının tanımlanmasına yardımcı olmuştur. Ekran, sorgu ell1 null mutant suşunun yüksek kopya numaralı S. pombe cDNA plazmid kütüphanesi ile dönüştürülmesi ve genotoksik strese neden olan bir bileşik olan 4-nitrokinolin 1-oksit (4-NQO) içeren EMM2 plakaları üzerindeki baskılayıcıların seçilmesiyle başlatıldı. Daha sonra, plazmid iki kısa listeye alınmış baskılayıcı koloniden izole edildi ve ekleme DNA'sını serbest bırakmak için kısıtlama enzimleri tarafından sindirildi. Bir insert DNA fragmanını serbest bırakan plazmidler, bu baskılayıcı plazmid klonlarının 4-NQO ve diğer genotoksik bileşiklerin varlığında ell1 delesyon mutantının büyümesini geri kazanma yeteneğini doğrulamak için ell1 delesyon suşuna yeniden dönüştürüldü. Delesyon fenotipinin kurtarıldığını gösteren plazmidler, ell1 delesyonla ilişkili genotoksik strese duyarlı fenotipin baskılanmasından sorumlu gen (ler) i tanımlamak için sıralandı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik etkileşim ağları, genler hakkında fonksiyonel bilgi sağlar ve bu genlerin in vivo olarak dahil olabileceği yolları ve biyolojik süreçleri tanımlar. Ek olarak, farklı genlerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğine dair içgörüler sağlayabilirler ve bu da spesifik bir fenotip 1,2,3 ile sonuçlanır. Yıllar geçtikçe, araştırmacılar tarafından temel biyolojik soruları cevaplamak ve insan hastalıklarını incelemek için çeşitli genetik ekranlar tasarlanmıştır. Genetik etkileşimlerin tanımlanması için ekranlar çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir. Farklı genetik ekranlarda tanımlanan genetik etkileşimler, genler arasındaki farklı mekanik ilişkileri temsil edebilir. Ayrıca, çalışmalar, ortak bir genetik etkileşimler kümesinin, aynı yola veya komplekse ait proteinleri kodlayan genler tarafından paylaşıldığını ortaya koymuştur 4,5. Bu nedenle, genetik etkileşim ağları, bir hücredeki işlevsel organizasyonu kurmak için kullanılabilir; burada en benzer profilleri paylaşan genler aynı komplekse veya yola aittir, biraz daha az benzer profilleri paylaşan genler aynı biyolojik sürece aittir ve örtüşen ancak daha çeşitli profiller sergileyen genler aynı hücresel bölmeye ait üyeleri yansıtır6.

Dozaj baskılamaya dayalı genetik etkileşim ekranları ('yüksek kopya veya çoklu kopya supresyonu') yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardan biridir. Bu ekranlar, bir sorgu mutant suşunu yüksek kopya numaralı genomik veya cDNA kütüphanesi ile dönüştürerek, ardından genetik etkileşimleri baskılayan veya geliştirentanımlamak için uygun tahliller / seçim teknikleri ile gerçekleştirilebilir 7,8,9. Genom çapında kapsamlı bir kapsama alanı sağlamak için, bu ekranlar aynı zamanda genom çapında fonksiyon kaybı mutantı koleksiyonunda belirli bir genin aşırı eksprese edilmesiyle veya fonksiyon kaybı sorgusu mutantı 9,10,11,12,13,14,15 yüksek kopya numaralı plazmid kodlu genomik veya cDNA kütüphanesinin aşırı eksprese edilmesiyle gerçekleştirilmiştir. . Çok kopyalı strateji, düzenlenebilir bir destekleyiciyi kullanarak baskın / aşırı ifade yaklaşımı kullanarak da çalışabilir.

Baskılayıcı bazlı ekranların kullanılmasının temel avantajları, mutant bir suştaki önceden var olan bir fenotipin başka bir gen tarafından bastırılmasının, bu iki gen ürünü arasında başka yaklaşımlar kullanılarak gösterilemeyen genetik bir ilişki kurmasıdır. İkincisi, önceden var olan bir mutasyonun varlığının belirli bir yolu hassaslaştırdığı ve bu yolun ek bileşenlerinin, daha doğrudan genetik seleksiyonlarla tanımlanmamış olabilecek baskılayıcıların izolasyonu ile tanımlanmasına izin verdiği gözlenmiştir. Ayrıca, bu ekran farklı bastırma mekanizmalarına sahip baskılayıcıları tanımlamak için kullanılabilir16. Baskılayıcı etkileşimler genellikle işlevsel olarak ilişkili genler arasında meydana gelir ve yollardaki hiyerarşileri aydınlatmak için kullanılabilir. Baskılamanın tam altında yatan mekanizma, ekranda kullanılan sorgu mutantının türü, deneysel koşullar ve gen ekspresyon seviyesi gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak farklılık gösterebilir. Yaygın dozaj bastırma mekanizmalarından biri, aynı komplekste veya aynı hücresel/biyolojik süreçte paralel olarak işlev gören ürünleri kodlayan genleri içerir. Maya gibi daha basit model organizmalardaki bu tür ekranların sonuçları, en temel biyolojik yollar ve süreçler evrim boyunca korunduğundan, daha yüksek ökaryotik organizmalara genişletilebilir.

Bu genetik ekranlar, farklı biyolojik soruları cevaplamak için çeşitli şekillerde de değiştirilebilir. Örneğin, sorgu mutant suşunun fenotipini baskılayabilen farklı organizmalardan gelen ortolog genler tanımlanabilir. Ayrıca, potansiyel direnç mekanizmalarını tanımlamak ve yeni antibakteriyel17,18, antifungal 19,20, antiparaziter21 veantikanser 22 bileşiklerinin protein hedeflerini belirlemek için kullanılmıştır. Bu ekran ayrıca, etki mekanizması bilinmeyen farmasötik ilaçların aktivitesinin baskılayıcılarını tanımlamak için de kullanılmıştır. Bu nedenle, prensip olarak, bu çoklu kopya bastırıcı ekranlar optimize edilebilir ve farklı organizmalardaki çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Maya araştırmacıları tarafından kullanılan genetik ekranların çoğu başlangıçta S. cerevisiae'de geliştirilmiş olmasına rağmen, S. pombe çeşitli genetik taramalar ve tahliller23 yapmak için tamamlayıcı bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Dahası, S. pombe'deki genomik organizasyon ve biyolojik süreçler, örneğin daha fazla gende intronların oluşumu, DNA replikasyonunun kökenlerinin karmaşıklığı, sentromer yapısı, hücre döngüsünün organizasyonu ve RNAi makinesinin varlığı, S. pombe ve daha yüksek ökaryotlar23,24 arasında daha fazla benzerlik göstererek, S. pombe'de genetik araçların tasarlanmasının ve kullanılmasının önemini vurgulamaktadır.

Bu yazıda, S. pombe'deki fonksiyon kaybı mutant fenotipinin 'dozaj baskılanmasına' dayanan genetik interaktörlerin tanımlanması için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokolün temeli, çok kopyalı bir plazmid üzerinde ve / veya güçlü bir promotörden vahşi tip genleri aşırı eksprese eden bir cDNA kütüphanesini taramanın hızlı ve etkili bir yöntem olmasıdır. Bu protokolün dört ana adımı vardır: kütüphanenin bir sorgu mutant suşuna dönüştürülmesi, sorgu mutant suşunun istenen fenotipini baskılayan plazmid klonlarının seçimi, plazmidlerin bu baskılayıcı klonlardan alınması ve fenotipin baskılanmasından sorumlu genin tanımlanması. Bir kütüphaneden cDNA'ların seçilmesine ve tanımlanmasına dayanan herhangi bir yöntem için geçerli olduğu gibi, ekranın başarısı yüksek kaliteli ve yüksek karmaşıklıklı bir kütüphane kullanılmasına bağlıdır, çünkü ekran yalnızca kütüphanede bulunan cDNA klonlarını alabilir.

Bu protokolü kullanarak, S. pombe ell1 null mutant sorgusunun genotoksik strese duyarlı fenotipinin iki yeni baskılayıcısını başarıyla tanımladık. Transkripsiyon uzama faktörlerinin ELL (Onbir Ondokuz Lizin Bakımından Zengin Lösemi) ailesi, in vitro biyokimyasal tahlillerde DNA şablonlarında RNA polimeraz II'nin geçici duraklamasını baskılar ve fisyon mayasından insanlara kadar çeşitli organizmalarda korunur25. Daha önceki çalışmalar, bir S. pombe ell1 null mutantının, 4-nitrokinolin 1-oksit (4-NQO) ve metil metansülfonat (MMS) 26 varlığında genotoksik stres duyarlılığı gösterdiğine dair kanıtlar sağlamıştır. Bu nedenle, bir S. pombe plazmid kodlu multicopy cDNA kütüphanesini sorgu S. pombe ell1 null mutantına dönüştürdük ve DNA lezyonlarını indükleyen bir bileşik olan 4-NQO varlığında S. pombe ell1 null mutantının genotoksik stres duyarlılığını bastırma yeteneğini sergileyen iki varsayılan klon tanımladık. Plazmid klonlarında bulunan ekin daha sonraki dizilimi, rax2 + ve osh6 + kodlayan genlerin, ell1 null mutantında aşırı eksprese edildiğinde ell1 null mutantın genotoksik stres duyarlılığını baskılamaktan sorumlu olduğunu tespit etti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cDNA kütüphanesinin sorgu S. pombe mutant suşuna dönüştürülmesi ve çoklu kopya baskılayıcıların taranması

NOT: S. pombe cDNA kütüphanesini birkaç değişiklikle sorgu S. pombe ell1 Δ suşunadönüştürmek için Standart Lityum-Asetat yöntemi27 izlenmiştir:

  1. S. pombe ell1 Δ suşunu32 ° C'de her biri 225 μg / mL adenin, lösin ve urasil ile desteklenmiş bir YE orta (Tablo 1) plaka üzerinde büyütün. Yukarıdaki plakadan ell1Δ suşu inokulumunun inokulumuyla dolu bir ilmeği, her biri 225 μg / mL adenin, lösin ve urasil ile desteklenmiş 15-20 mL YE ortamında aşılayın. Gece boyunca 32 ° C'de sallanarak (200-250 rpm) inkübe edin.
  2. Ertesi gün, gece kültürünü 100 mL taze YE ortamında istenen takviyelerle 0,3 OD 600 nm'ye (600 nm'de optik yoğunluk) seyreltin ve OD600 nm orta kütük fazına ulaşana kadar200-250 rpm'de sallayarak 32 ° C'de inkübe edin.
  3. 100 mL kültürü iki adet 50 mL santrifüj tüpüne bölün, ardından oda sıcaklığında 4.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleme yapın.
  4. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL steril suyla yıkayın, yani hücreleri 1 mL steril suda yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4.000 × g'de santrifüj yapın.
  5. Süpernatantı atın ve her hücre peletini adım 1.4'te açıklandığı gibi 1 mL 1x LiAc-TE (100 mM lityum asetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) çözeltisi ile yıkayın.
  6. Süpernatantı çıkarın ve her hücre peletini 250 μL 1x LiAc-TE'de yeniden askıya alın. Bu S. pombe yetkin hücrelerini (500 μL) ilgilenilen DNA ile dönüşüm için kullanın. Sonraki dönüşüm adımları için yetkin hücrelerin 125 μL'sini dört farklı steril mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. Somon testislerinden veya ringa balığı spermlerinden taşıyıcı DNA'yı 1 dakika kaynatın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Her transformasyon için, yetkin hücrelerin 125 μL'sini içeren mikrosantrifüj tüpüne 10 μL 10 mg / mL denatüre, tek sarmallı taşıyıcı DNA'yı ekleyin, ardından bir mikropipet ucu kullanılarak nazik bir şekilde karıştırılır. Daha sonra, yetkili hücreler-taşıyıcı DNA karışımı içeren mikrosantrifüj tüpüne 50 μg S. pombe cDNA kütüphanesi ekleyin.
  8. Mikrosantrifüj tüplerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından tüplere 260 μL polietilen glikol-lityum asetat çözeltisi (% 40 [w/v] PEG 4.000, 100 mM lityum asetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) ekleyin ve bir mikropipet ucu yardımıyla yavaşça karıştırın.
  9. Transformasyon karışımını içeren mikrosantrifüj tüplerini 32 °C'de sallanmadan 2 saat boyunca inkübe edin. Mikrosantrifüj tüpüne 43 μL önceden ısıtılmış dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Daha sonra, tüpleri 5 dakika boyunca 42 ° C'de ısı şokuna maruz bırakın.
  10. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4.000 × g'da toplayın. Süpernatantı atın ve artık PEG-LiAc-TE çözeltisini bir mikropipet ucu yardımıyla çıkarın.
  11. Hücreleri 100 μL steril su ve plaka içinde bir EMM2 (Tablo 1) plaka (150 mm) üzerinde gerekli takviyeler ve 0.2 μg / mL 4-NQO ile yeniden askıya alın.
  12. Kolonilerin plakalarda görünmesine izin vermek için plakaları 5-6 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edin. Elde edilen kolonileri aynı orta plaka üzerinde 0.2 μg / mL 4-NQO varlığında çizin ve daha fazla tarama için kullanın.
  13. Bir kütüphane dönüşüm deneyi için, yukarıdaki 1.8 ila 1.14. adımlarda açıklandığı gibi transformasyon için 500 μL yetkin hücre (125 μL yetkin hücre x 4 mikrosantrifüj tüpü) kullanın.
  14. Bir kontrol olarak, kütüphanenin dönüştürülmesinden sonra elde edilen kütüphane klonlarının toplam sayısını hesaplamak ve baskılayıcı klonların izolasyonu için tarama yapmak için gerekli takviyelerle bir EMM2 plakası (150 mm) üzerindeki dönüşüm karışımının 1 /10'uncu plakası, ancak 4-NQO'dan yoksundur.

2. Sorgu mutant suşu ile ilişkili fenotipin varsayılan baskılayıcı tarafından kurtarılmasını/bastırılmasını test edin ve doğrulayın

NOT: Stres noktası testleri, ell1 delesyonla ilişkili 4-NQO stres duyarlılığının varsayılan baskılayıcı (lar) tarafından kurtarılmasını / bastırılmasını test etmek ve doğrulamak için aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirilmiştir.

  1. Steril 96 delikli bir mikrotitre plakasının farklı kuyularının her birine 100-200 μL steril su ekleyin.
  2. Steril bir kürdan veya 20-200 μL mikropipet ucu kullanarak 4-NQO içeren plakada cDNA kütüphanesi dönüşümünden sonra elde edilen farklı kolonilerin her birinden az miktarda inokülum seçin. Farklı kolonilerin her birinden inokulumu, 100-200 μL steril su içeren mikrotiter plakasının ayrı bağımsız kuyucuklarına ekleyin. İyice karıştırın.
  3. Her bir kuyucuktan adenin (225 μg / mL) ve urasil (225 μg / mL) içeren ancak lösin içermeyen EMM2 agar plakalarına hücre süspansiyonunun 3 μL'sini (bu çalışmada kullanılan kütüphanenin yapımında kullanılan plazmid vektöründe bulunan seçilebilir auxotrophic marker) noktalayın. Plakalara uygun konsantrasyonlarda 4-NQO ekleyin.
  4. Hücrelerin büyümesine izin vermek için plakaları 3-4 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edin. Farklı konsantrasyonlarda 4-NQO varlığında büyüme gösteren kolonileri varsayılan baskılayıcılar olarak tanımlayın.
  5. Baskılayıcıları daha da doğrulamak için, seçilen baskılayıcıları, her biri 225 μg / mL adenin ve urasil içeren ancak lösin içermeyen EMM2 ortamında sallama (200-250 rpm) ile gece boyunca 32 ° C'de uygun kontrol suşlarıyla birlikte büyütün.
  6. Ertesi gün, hücreleri taze EMM2 ortamındaOD 600 nm 0.3'e kadar seyreltin ve orta log fazına kadar sallayarak 32 ° C'de büyütün (yaklaşık OD600 nm 0.6-0.8).
  7. EMM2 plakalarındaki kültürlerin uygun seri seyreltmelerini (1:10 veya 1:5), 0.4 μM 4-NQO veya% 0.01 MMS içeren gerekli takviyelerle tespit edin. Kontrol için, gerekli takviyelerle bir EMM2 plakasındaki suşları tespit edin, ancak DNA'ya zarar veren herhangi bir ajandan yoksundur.
  8. Büyümeyi izlemek için plakaları 3-5 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Fenotipin kurtarılmasını veya baskılanmasını test etmek için sorgu mutant suşu ile ilişkili fenotipe dayalı uygun testler kullanılmalıdır. Örneğin, bir sorgu mutant suşunun soğuğa duyarlı bir fenotipinin baskılayıcılarının tanımlanması gerekiyorsa, baskılayıcı klonların test edilmesi ve doğrulanması için yapılan tahlil, düşük sıcaklıkta büyüyen dönüştürücüleri içerecektir.
  9. Tam uzunlukta ilgi geni (bu durumda Spell1 ) veya boş vektör ile dönüştürülen mutant suşları, kütüphane dönüştürücüleri ile birlikte sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak tespit edin.

3. Plazmidin S. pombe baskılayıcı klonlarından izolasyonu

NOT: S. pombe'den plazmid izolasyonu, Fisyon mayasında açıklanan protokol izlenerek gerçekleştirildi: birkaç modifikasyon içeren bir laboratuvar el kitabı28 .

  1. EMM2 ortamında 225 μg / mL adenin ve urasil içeren tek bir maya kolonisini aşılayın ve hücreleri gece boyunca 32 ° C'de 200-250 rpm'de sallayarak büyütün. Ertesi gün, oda sıcaklığında 4.000 × g'da 2 dakika santrifüj yaparak 5 O.D. hücresini (yani, 10 mL O.D. 0.5 kültürü) hasat edin.
  2. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 0.2 mL lizis tamponunda (% 2 Triton X-100,% 1 SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8.0) ve 1 mM Na2EDTA) yeniden askıya alın.
  3. Mikrosantrifüj tüpüne 0.2 mL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) ve 0.3 g asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünü 4 ° C'de 2 dakika boyunca vorteks yapın ve 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu adımı 6 kat yineleyin.
  4. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj yapın. Üst sulu tabakayı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 200 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) ekleyin.
  5. Tüpü 10.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst sulu tabakayı taze bir tüpe aktarın ve tüpe iki hacim% 100 etanol (~ 400 μL) ve 1/10 hacim sodyum asetat (3 M, pH 5.8) (~ 20 μL) ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünü 1 saat boyunca -70 °C inkübe edin.
  6. DNA'yı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10.000 × g'de santrifüjleme ile çökeltin ve süpernatanı çıkarın. DNA peletini% 70 etanol (~ 500 μL) ile yıkayın ve hava kuruması için oda sıcaklığında tutun.
  7. DNA'yı 20 μL steril suda yeniden askıya alın. Yetkin E. coli hücrelerinin transformasyonu için 2-5 μL plazmid DNA'sı kullanın.
    NOT: Plazmid, ticari olarak temin edilebilen maya plazmid izolasyon kitlerinden herhangi biri kullanılarak maya hücrelerinden de izole edilebilir.

4. Baskılayıcı klon tarafından kodlanan genin tanımlanması

  1. Standart protokol 29'u kullanarak izole edilmiş maya plazmidlerini E. coli Top10 suşuna [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] 'ye dönüştürün ve hücreleri LB (Luria Broth) plakalarına gerekli antibiyotiklerle yayın.
  2. Standart alkali lizis protokolü29'u kullanarak plazmidleri E. coli transformanlarından izole edin ve kısıtlama sindirimi ile insert DNA fragmanının salınımını kontrol etmek için uygun kısıtlama enzim kombinasyonlarını izleyin.
    NOT: Suppressor plazmid 84 Bam HI restriksiyon enzimi ile, Suppressor plazmid 104 ise PstI/BamHI restriksiyon enzimleri ile sindirildi.
  3. Ell1Δsuşunda kısıtlama sindiriminden sonra kesici uç salınımını gösteren plazmidleri, ell1Δ suşunun genotoksik strese duyarlı fenotipini kurtarma yeteneklerini kontrol etmek için yeniden dönüştürün.
  4. Genotoksik stres duyarlılığının baskılandığını gösteren plazmid klonlarını seçin ve vektöre özgü ileri ve geri primerler kullanarak bu plazmid klonlarında bulunan DNA fragmanını sıralayın.
    NOT: Bu çalışmada adh1 promotöre özgü üniversal ileri astar (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30 kullanılmıştır.
  5. Baskılamadan sorumlu geni tanımlamak için, NCBI nükleotid patlaması (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) veya Pombase dizi hizalama aracı (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core) kullanılarak elde edilen diziyi hizalayın. Maksimum hizalamayı gösteren diziyi seçin ve çok kopyalı baskılayıcı plazmidin geni olarak tanımlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. pombe'de ell1 delesyonla ilişkili genotoksik stres duyarlılığının multikopya baskılayıcılarının taranması
Genetik ekranı, sorgu ell1 delesyon mutant suşunun fonksiyon kaybı fenotipinin çoklu kopya baskılayıcılarını tanımlamak için yukarıda açıklanan protokolü kullanarak gerçekleştirdik. 4-NQO genotoksik ajan varlığında gözlenen ell1 delesyon suşunun büyümeye bağlı duyarlılığı, multikopya baskılayıcıları seçmek i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mayalar, ökaryotik organizmalar arasında evrimsel olarak korunan temel biyolojik süreçleri ve yolları araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Genetik ve genomik araçların mevcudiyeti ve çeşitli biyokimyasal, genetik ve moleküler prosedürlere uygunlukları, mayaları genetik araştırmalar için mükemmel bir model organizma haline getirmektedir34,35,36. Yıllar geçtikçe, maya araştırmacıları tarafından, bireysel genlerin işlevl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü'nden bir araştırma hibesi ile finanse edilmiştir (Hibe No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) Nimisha Sharma'ya. Yazarlar, S. pombe cDNA kütüphanesinin hediyesi için Prof. Charles Hoffman'a (Boston College, ABD) ve maya plazmidleri için Prof. Susan Forsburg'a teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-NQOSigmaN8141
Asetik Asit, buzulSigma1371301000
Adenin SülfatHimediaGRM033
AgarHimediaGRM026
AgarozLonza50004L
Amonyum KlorürHimediaMB054
BamHIFermentasER0051
BiotinHimediaRM095
Borik Asit HimediaMB007
Kalsiyum Klorür SigmaC4901
Kloroform: İzoamil alkol 24: 1SigmaC0549
Sitrik Asit HimediaRM1023
Somon testislerinden tek sarmallı DNA
EDTA disodyumSigma324503
Ferrik Klorür HekzahidratHimediaRM6353
GlikozAmresco188
İyonositolHimediaGRM102
İzopropanolQualigenQ26897
LösinHimediaGRM054
Lityum AsetatSigma517992
Magnezyum Klorür HekzahidratHimediaMB040
Molibdik AsitHimediaRM690
Nikotinik AsitHimediaCMS177
PEG, MW 4000Sigma81240
Pentothinic AsitHimediaTC159
Fenol HimediaMB082
Plazmit Ekstraksiyon KitiQiagen27104
Potasyum KlorürSigmaP9541
Potasyum hidrojen PthallateMercDDD7D670815
Potasyum iyodürHimediaRM1086
RNAseFermentasEN0531
SDSHimediaGRM205
Sodyum HidroksitHimediaGRM1183
Sodyum SülfatHimediaRM1037
Tris ücretsiz BazHimediaMB209
UrasilHimediaGRM264
Maya Özü TozuHimediaRM668
Çinko Sülfat HeptahidratMercDJ9D692580
GRM3960 disodyum hidrojen fosfat susuz Himedia Sigma D7656

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712(2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840(2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969(2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932(2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090(2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601(2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444(2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Supres r TaramasPlazmit K t phanesi TransformasyonuGenotoksik StresEll1 Delesyon MutanRestriksiyon SindirimiFenotipik SupresyonDNA zolasyonu

İlgili makaleler