Yöntem makalesi

Bakteriyel Glikoproteinler için Spesifik Olmayan Proteoliz Tabanlı Glikomik Stratejisi

763 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63977

⸱

30 Haziran 2022

 ,  , 
1Human Health Therapeutics Research Center, National Research Council Canada

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, pronaz E sindirimi, permetilasyon ve kütle spektrometresi analizinin bir kombinasyonu ile glikoproteinlerin glikomik analizi için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, bakteriyel N-glikanlar da dahil olmak üzere her türlü N-bağlı glikanı analiz etme yeteneğine sahiptir.

Özet

Protein glikozilasyonu, en yaygın ve karmaşık translasyon sonrası modifikasyonlardan biridir. Glikanların spesifik rollerini, yapıları arasındaki ilişkiyi ve proteinlerin işlevleri üzerindeki etkilerini karakterize etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Glikan analizi için yaygın bir yöntem, Peptit-N-Glikosidaz F (PNGase F) kullanılarak glikoproteinlerden veya glikopeptitlerden N-bağlı glikanları serbest bırakmak için ekzoglikozidaz bölünmesi kullanmaktır. Bununla birlikte, bakterilerdeki glikan-protein bağları farklıdır ve bakteriyel glikoproteinlerden glikanları serbest bırakacak bir enzim mevcut değildir. Ek olarak, memeli hücrelerinde, bakterilerde, mayalarda, bitkilerde ve balıklarda serbest glikanlar da tanımlanmıştır. Bu makalede, Campylobacter jejuni'deki N-bağlı glikozilasyon sistemini, hedef proteinlerine bağlı olmayan asparagin (Asn) bağlantılı ve serbest glikanları tespit ederek karakterize edebilen bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemde, C. jejuni'den elde edilen toplam proteinler, daha yüksek bir enzim / protein oranı (2: 1-3: 1) ve daha uzun bir inkübasyon süresi (48-72 saat) ile Pronase E tarafından sindirildi. Elde edilen Asn-glikanlar ve serbest glikanlar daha sonra gözenekli grafit karbon kartuşları kullanılarak saflaştırıldı, permetillendi ve kütle spektrometresi ile analiz edildi.

Giriş

Protein N-glikosilasyonu, ökaryotlarda en yaygın ve karmaşık translasyon sonrası modifikasyonlardan biridir1. N-glikanlar, protein katlanmasında önemli bir rol oynar ve ayrıca biyosentetik trafikte protein sıralaması üzerinde bir etkiye sahiptir2. Kütle spektrometresi, ekzoglikozidaz bölünmesi (glikomikler) tarafından salınan glikanların analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Kalan deglikosile peptitler (glikoproteomikler), ökaryotlarda3 glikosile edilmiş peptitlerin dizilerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılmıştır. Campylobacter jejuni'de N'ye bağlı glikanların tanımlanması, N-glikozilasyonun ökaryotlar 4,5,6,7,8 ile sınırlı olmadığını düşündürmektedir. Bununla birlikte, bakteriler için, glikan analizi için oligosakkaritleri serbest bırakmak için etkili ekzoglikozidazlar veya endoglikozidazlar eksikliği vardır.

Glikoproteinlerdeki glikozilasyon bölgelerini ve glikan yapılarını karakterize etmek için, çoğu peptidin omurgasını sindirmek ve sadece birkaç amino asit içeren psödo-oligosakkaritler üretmek için spesifik olmayan proteolizin kullanımına dayanan alternatif bir yaklaşım geliştirilmiştir. Psödo-oligosakkaritler üretmek için çeşitli spesifik olmayan enzimler kullanılmış ve Pronase E'nin en verimli ve tekrarlanabilir sindirimi sunduğu bulunmuştur9. C. jejuni N-glikanları10,11'i analiz etmek için Pronase E'ye dayalı bir glikomik strateji geliştirdik. Psödo-oligosakkaritler, permetilasyondan sonra doğrudan kapiler elektroforez kütle spektrometresi (CE-MS) ve/veya matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) ile analiz edildi.

Burada, mukozal patojen C. jejuni'den glikozilasyonu incelemek için spesifik olmayan Pronase sindirimi ve permetilasyonu kullanan glikomik analiz için evrensel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, hem ökaryotik hem de bakteriyel sistemler tarafından eksprese edilen N'ye bağlı glikanları karakterize etme yeteneğine sahiptir ve ayrıca N'ye bağlı glikozilasyon yollarındaki yeni ara ürünlerin tanımlanmasında da yararlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. C. jejuni 11168H kültürü ve toplam proteinlerin ekstraksiyonu

NOT: C. jejuni 11168H, NCTC 1116812'nin hipermotil klonal bir türevidir.

  1. Hücre peletini (yaklaşık 0.15 g, NCTC) yaklaşık 5 mL Mueller-Hinton kültür ortamı ile yeniden sulandırarak hücre kültürünü başlatın. Bir Mueller-Hinton agar plakasını aşılamak için birincil et suyu tüpünün birkaç damlasını kullanın. Mikroaerofilik bir atmosfer altında 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin, yani% 5 O2,% 10 CO2 ve% 85N2.
  2. Bakteriyel çimleri 1 mL Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) suyu ile hasat edin. Hasatı BHI suyu ile yaklaşık 1 x 105 cfu/mL'ye ulaşacak şekilde seyreltin. 37 ° C'de mikroaerofilik bir atmosferde çalkalama (100 rpm) ile 18 saat boyunca hücreleri büyütün.
  3. Plakaları 10 dakika boyunca buzun üzerine koyarak hücreleri soğutun ve hücreleri santrifüjleme ile hasat edin (4 ° C'de 4.500 x g ). Süpernatanı atın ve hücreleri 3 L'de 2 kez buz gibi soğuk 0.1 M Tris-HCl'de (pH 7.8) yıkayın.
  4. Hücreleri (10,8-10,11 C. jejuni hücreleri) 8 mL buz gibi soğuk 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8) içinde yeniden askıya alın ve sonikasyonla parçalayın (Malzeme Tablosu). Sonikasyonu aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 4 s darbe, 1 s kapalı, her seferinde 1 dakika ve toplam üç kez.
  5. 4 ° C'de 45 dakika boyunca 9.500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı başka bir tüpe aktarın. Süpernatanttaki proteinleri 0.1 M Tris-HCl'ye (pH 7.5) karşı 2x 4 ° C'de 3 saat boyunca diyaliz edin.
  6. Protein konsantrasyonlarını ticari olarak temin edilebilen bir Protein Testi13 ile belirleyin (4 ila 6 μg / μL aralığında olmalıdır).
  7. 1 mg proteini 1 mL 0.1 M Tris-HCl tamponunda (pH 7.5) çözün ve çözeltiye 2.5 mg Pronase E ekleyin. 37 ° C'de 48 saat inkübe edin, ardından enzimi etkisiz hale getirmek için çözeltiyi 100 ° C'de 5 dakika kaynatın.
  8. Protein sindirim solüsyonunu daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

2. Gözenekli grafit karbon (PGC) kullanarak saflaştırma

  1. % 0.1 trifluoasetik asit (TFA) içeren 1 mL %80 (h/h) asetonitril (ACN) ekleyerek PGC kartuşlarını (100 mg, 5 mL) etkinleştirin ve 2 kez tekrarlayın.
  2. PGC kartuşunu 1 mL su ile 3 kez yıkayın.
  3. Pronase E sindirimini 1 mg proteinden PGC'ye yükleyin (hacim protein konsantrasyonuna bağlıdır).
  4. Tuzları çıkarmak için kartuşu 3x 1 mL su ile her seferinde yıkayın.
  5. % 0.1 TFA'da 1 mL% 25 ACN ile Elute Asn-glikanlar,% 0.1 TFA'da 1 mL% 50 ACN izler.
  6. Her iki fraksiyonu da birleştirin ve daha sonraki işlemler için numuneleri soğutmalı vakumlu yoğunlaştırıcı (Malzeme Tablosu) ile kurutun.
    NOT: Asn-glikan saflaştırması için MS sınıfı çözücüler kullanın.

3. Asn-glikanların permetilasyonu

  1. Kurutulmuş Asn-glikanları 1.5 mL'lik bir tüpte 100 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ile çözündürün.
  2. İki pelet NaOH'yi 2 mL DMSO ile karıştırarak DMSO-NaOH bulamacını hazırlayın. Numuneye 200 μL DMSO-NaOH bulamacı ve 100 μL metil iyodür ekleyin.
  3. Tüpü sıkıca kapatın ve bir girdap karıştırıcı ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.000 rpm'de karıştırın.
  4. 1 mL su ekleyerek permetilasyonu söndürün.
  5. Permetillenmiş Asn-glikanları çıkarmak için 1 mL kloroform ekleyin ve 1 dakika boyunca girdap yapın.
  6. 3 dakika boyunca 9.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve düşük kloroform fazını permetillenmiş Asn-glikanlarla tutun.
  7. Organik tabakayı 1 dakika boyunca girdap ile 1 mL su ekleyerek yıkayın. 9.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. 2x tekrarlayın.
  8. Organik fazı bir çeker ocak içine yerleştirin ve oda sıcaklığında bir nitrojen akışı ile kurumaya bırakın.
  9. Kütle spektrometrik analizi için permetillenmiş Asn-glikanları -80 ° C'de saklayın.

4. Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi (ESI-MS) ve ESI-MS/MS analizi

  1. Permetillenmiş Asn-glikanları 20 μL% 50% 2-propanol içinde suda (h / h) çözün.
  2. 1 μL/dk'da suda %50 2-propanol kılıf akışına sahip 90 cm çıplak erimiş silika kılcal damar kullanarak CE-ESI-MS analizi gerçekleştirin.
    NOT: CE-MS, kapiler elektroforez (CE) ve kütle spektrometresini birleştiren bir sistemdir. CE, iyonları iyon hareketliliklerine göre ayırır. Bu protokolde, CE sistemi, çok küçük miktarda numuneyi tanıtmak ve on-line tuzdan arındırma işlemini gerçekleştirmek için kullanılır.
  3. Pozitif modda ESI voltajını 5 kV'a ayarlayın.
  4. Permetillenmiş Asn-glikan örneklerini 500 mbar'da 0,2 dakika boyunca yükleyin, bu yaklaşık 100 nL'ye karşılık gelir.
  5. Aşağıdaki toplama parametrelerini kullanarak bir kütle spektrometresi (Malzeme Tablosu) kullanarak MS verilerini elde edin.
    1. Tam MS için, bekleme süresini 0,1 m/z birimin adım başına 2,0 ms olarak ayarlayın. MS2 ve MS3'te gelişmiş ürün iyon taraması (EPI) ile deneyler, tarama hızını 4,000 Da/s'ye ayarlayın, Q0 yakalama ile. Bindirme doldurma süresini Dinamik ve Q1 çözünürlüğünü Birim olarak ayarlayın. MSiçin 3 deneyler, tek bir yüklü öncü için yalnızca monoizotopik tepe noktasının seçildiğinden emin olmak için uyarma katsayısını ayarlayın. Uyarma sürelerini 100 ms'ye ayarlayın.

5. Permetillenmiş glikanların MALDI-TOF MS ile analizi

  1. Permetillenmiş Asn-glikanları 10 μL% 50% metanol / su (h / h) içinde çözün.
  2. 1 μL çözünmüş Asn-glikanları 2 μL 2,5-dihidroksibenzoik asit çözeltisi (% 50 asetonitril / su (h / h) içinde 10 mg / mL) karıştırın.
  3. 384 oyuklu bir MALDI plakasına 1 μL karışık numune ekleyin ve numune tamamen kuruyana kadar bekleyin.
  4. Plakayı, darbeli nitrojen lazeri (337 nm) ile donatılmış MALDI-TOF kütle spektrometresine yerleştirin. Pozitif modda hızlanma voltajını 20 kV'a ayarlayın.
  5. Lazer gücünü 6.000'lik rastgele bir ölçeğe ayarlayın ve pozitif reflektron modunda m/z 1.000 ila 5.000 arasında veri elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Pronaz E sindirimi ve permetilasyon kombinasyonuna dayanan yöntem, C. jejuni 11168H'nin toplam protein ekstraktlarından N-glikan analizine uygulandı. Şekil 1, deneysel prosedürün bir akış şemasını göstermektedir. Tipik sindirimde, enzimin glikoproteine oranı 1:100 ila 1:20 arasında ayarlanmıştır. Burada, Pronaz E'nin proteine oranı 2: 1-3: 1'e yükseltildi ve 37 ° C'de 48 saat inkübe edilerek egzoz sindirimi elde etmek için daha uzun sindirim kullanıldı. Egzoz sindiriminden elde edil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu evrensel glikomik stratejinin uygulanması için protokolde iki kritik adım vardır. İlk kritik adım, egzoz sindiriminin tamamlanmasıdır. Bu yöntem büyük ölçüde Pronase E sindiriminin tamamlanmasına bağlıdır. Bu nedenle, uzun bir sindirim süresi ve yüksek bir enzim-protein oranı kullanmak önemlidir. Tipik olarak, Pronase E / proteini için 2: 1-3: 1 oranında bir oran ve 48 saatlik bir inkübasyon süresi kullanılması önerilir. Önerilen bu egzoz sindiriminin, ana bileşen10<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar Kenneth Chan, David J. McNally, Harald Nothaft, Christine M. Szymanski, Jean-Robert Brisson ve Eleonora Altman'a yardımları ve yardımcı tartışmaları için teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB),Sigma-Aldrich (St. Louis, MO149357
2-PropanolFisher Scientific (Ottawa, Ontario, Kanada),AA22906K7
4000 Q-TrapAB Sciex (Concord, Kanada),Kütle spektrometresi
4800 MALDI-TOF/TOFUygulamalı Biyosistemler (Foster City, CA),Kütle spektrometresi
asetonitril ( ACN)Fisher Scientific ( Ottawa, Ontario, Kanada)A996-4
Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) suyuSigma-Aldrich (St. Louis, MO)5121
C18 Sep-Pak kartuşlarıSular (Milford, MA).
kloroformSigma-Aldrich (St. Louis, MO)CX1054
DifcoFisher Science (Ottawa, Ontario, Kanada)DF0037-17-8Fisher Science
dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)276855
Eppendorf tüpüDiamed (Missisauga, Ontario, Kanada)SPE155-N
buzul asetik asitSigma-Aldrich (St. Louis, MO)A6283
metanolFisher Scientific, Ottawa, Ontario, Kanada)A544-4
metil iyodürSigma-Aldrich (St. Louis, MO),289566
PGC kartuşuThermo Scientific (Waltham, MA)60106-303Gözenekli grafit karbon
PronaseSigma-Aldrich (St. Louis, MO)7433-2
Protein Test KitiBio-rad (Mississauga, Ontario, Kanada)5000001
Soğutmalı vakum yoğunlaştırıcıThermo Scientific (Waltham, MA)SRF110P2-230
sodyum hidroksitSigma-Aldrich (St. Louis, MO)367176
Sonikatör Ultrasonik İşlemciMandel Scientific (Guelph, Ontario, Kanada)XL 2020
Trifluoasetik asit (TFA)Fisher Scientific ( Ottawa, Ontario, Kanada)A11650
Tris-HClSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T3253
),,WAT036945

Kaynaklar

  1. Dwek, R. A. Glycobiology: more functions for oligosaccharides. Science. 269 (5228), 1234-1235 (1995).
  2. Scheiffele, P., Peränen, J., Simons, K. N-glycans as apical sorting signals in epithelial cells. Nature. 378 (6552), 96-98 (1995).
  3. Hofmann, J., Hahm, H. S., Seeberger, P. H., Pagel, K. Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry. Nature. 526 (7572), 241-244 (2015).
  4. Kowarik, M., et al. N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science. 314 (5802), 1148-1150 (2006).
  5. Young, N., et al. Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42530-42539 (2002).
  6. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
  7. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  8. Linton, D., et al. Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Molecular Microbiology. 55 (6), 1695-1703 (2005).
  9. Nwosu, C. C., et al. Simultaneous and Extensive Site-specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures. Analytical Chemistry. 85, 956-963 (2013).
  10. Liu, X., et al. Mass spectrometry-based glycomics strategy for exploring N-linked glycosylation in eukaryotes and bacteria. Analytical Chemistry. 78 (17), 6081-6087 (2006).
  11. Nothaft, H., Liu, X., McNally, D. J., Li, J., Szymanski, C. M. Study of free oligosaccharides derived from the bacterial N-glycosylation pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 15019-15024 (2009).
  12. Macdonald, S. E., et al. Draft genome sequence of Campylobacter jejuni 11168H. Genome Announcements. 5 (5), e01556(2017).
  13. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  14. Liu, X., Chan, K., Chu, I. K., Li, J. Microwave-assisted nonspecific proteolytic digestion and controlled methylation for glycomics applications. Carbohydrate Research. 343 (17), 2870-2877 (2008).
  15. Liu, X., et al. 34;One-pot" methylation in glycomics application: Esterification of sialic acids and permanent charge construction. Analytical Chemistry. 79 (10), 3894-3900 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein GlikozilasyonuGlikan AnaliziN Ba l GlikanlarEkzoglikozidaz KesimiPronase E SindirimiAsn Ba l GlikanlarSerbest GlikanlarG zenekli Grafitik KarbonK tle Spektrometrisi
Video yakında

İlgili makaleler