Yöntem makalesi

Sulu Tek Adımlı Çapraz Bağlama ve Ko-nanopolimerizasyon Kullanılarak Uyaranlara Duyarlı Nanojellerin Sentezi

DOI:

10.3791/63981

⸱

24 Ocak 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry, Molecular Sciences Research Hub, Imperial College London

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanojeller, biyolojik maddelerin verilmesi için mükemmel ve çok yönlü bir nanoparçacık platformudur. Protein bazlı yükleri kapsülleyebilen uyaranlara duyarlı poli (etilen) glikol bazlı polimerik nano jeller, sulu koşullarda tek aşamalı çapraz bağlama ko-nanopolimerizasyon stratejisi kullanılarak sentezlendi. Bu yeni nanopartiküllerin optimal üretimi ve karakterizasyonu burada sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çapraz bağlı-polimerik nanopartiküllerden oluşan nanojeller, çok yönlü aşağıdan yukarıya sentezleri ve biyouyumlulukları sayesinde çok sayıda kimyasal ve biyolojik terapötiğin verilmesi için geliştirilmiştir. Bugüne kadar nanojel sentezi için çeşitli yöntemler kullanılmış olsa da, çok azı biyolojik yükün bütünlüğüne zarar verebilecek sert organik çözücüler veya yüksek sıcaklıklar kullanılmadan bunu başarmıştır. Buna karşılık, burada sunulan metodoloji, hafif reaksiyon koşulları kullanarak 100 nm altı boyutta, protein yüklü nanojellerin sentezini gerçekleştirir. Burada, sulu bazlı, tek aşamalı, çapraz bağlama kopolimerizasyon tekniği kullanılarak sentezlenen nano-jeller içindeki protein bazlı yüklerin kovalent olmayan kapsüllenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu teknikte, başlangıçta protein bazlı bir yükü katyonik bir kuaterner amonyum monomerine elektrostatik olarak bağlarız ve aynı anda amonyum persülfat ve N, N, N', N'-tetrametiletilendiamin kullanarak çapraz bağlar ve kopolimerize ederiz. Nanojellerin boyutu ve polidispersite indeksi, dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanılarak belirlenirken, yüzey morfolojisi, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile değerlendirilir. Nanojeller içinde sıkışan protein kütlesi, kapsülleme verimliliği hesaplanarak belirlenir. Ayrıca, redoksa duyarlı yapısal elemanların kademeli olarak bozunması yoluyla nanojellerin kontrollü salım kabiliyeti de biyoredüksiyon deneylerinde değerlendirilir. Bu tekniği kullanarak nanojel sentezi ve karakterizasyonunun tüm uyarılarını göstermek için nanopartikül optimizasyon verilerine örnekler sunuyoruz. Genel olarak, ortalama 57 nm büyüklüğünde ve 0.093 polidispersite indeksi değeri ile düzgün boyutta nanojeller elde edilmiştir. %76 gibi yüksek bir kapsülleme verimliliği elde edildi. Ayrıca, nanojeller, 48 saat boyunca glutatyon varlığında yeni redoksa duyarlı bileşenlerin kademeli olarak bozunmasıyla kapsüllenmiş proteinin% 86'sına kadar kontrollü salınımını sergiledi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanojeller, morfolojik bütünlüklerini etkilemeden çekirdek kabukları içinde büyük miktarlarda sıvı tutabilen çapraz bağlı polimer ağ yapılarına sahip üç boyutlu, mikron altı boyutlu hidrojellerdir1. Genel olarak nanojeller, yağda su ters mikroemülsiyonlar 2,3 gibi heterojen kolloidal sistemlerde fiziksel veya kimyasal çapraz bağlama yoluyla fonksiyonel monomerlerin polimerizasyonu ile sentezlenir. Amfifilik kopolimerler, sulu ortamlarda nano ölçekli yapılara kendi kendine monte edilebilir. Bununla birlikte, disülfitler veya amid bazlı kuplaj, tıklama kimyası içeren kimyasal çapraz bağlama stratejileri kullanılarak stabilize edilmeleri gerekir veya fiziksel olarak indüklenebilir (hidrofobik, elektrostatik veya hidrojen bağlama stratejileri) veya foto indüklenebilir4. Bu stratejiler arasında, polimerlerin fiziksel olarak kendi kendine birleştirilmesi ve ardından kimyasal çapraz bağlanmanın başarılı bir nanojel üretim tekniği olduğu bildirilmiştir5. Tarihsel olarak, ilk nanojel 1990'larda Vingradov ve ark.6, Akiyoshi ve ark.7 ve Lemieux ve ark.8 tarafından tanıtılırken, son zamanlarda hem doğal hem de sentetik polimerlerden oluşan çeşitli akıllı nanojeller geliştirilmiş ve çeşitli biyomedikal uygulamalar için araştırılmıştır9.

Nanojeller, geniş kargo tutma kapasitesine, geniş yüzey alanına, in vivo stabiliteye ve ayrıca özelleştirilebilir kimyasal ve mekanik özellikleresahiptir 10. Nanojellerin sentezi de ölçeklenebilir ve su bazlı olabilir. Ek olarak, nanojellerin gelişmiş su içeriği, onları hassas biyolojik yüklerin etkili taşıyıcıları haline getirir11. Ayrıca, yüksek yüzey alanı birden fazla biyokonjugasyon ihtiyacını karşılayabilir, böylece aktif hedeflemeyi mümkün kılmak için hedefleme modalitelerinin eklenmesine izin verir. Özellikle, nanojel tasarımının çok yönlülüğü, fizikokimyasal özelliklerinin hassas kontrolüne izin veren çok çeşitli uyaranlara duyarlı monomerlerin kullanılmasına izin verir9. Bu benzersiz mühendislik yeteneği, geleneksel olarak kullanılan lipozomlar, miseller veya polimerozomlar12,13 ile elde edilmesi zor olan nanojel tasarımının rasyonel olarak iyileştirilmesini sağlar. Nanojeller, özel olarak tasarlanmış monomerler içinde uyaranlara duyarlı kısımları dahil ederek, pH, redoks koşulları, enzimler vb. gibi fizyolojik olarak ilgili çeşitli uyaranlara yanıt olarak yüklerinin kontrollü salınımını tetikleyecek şekilde tasarlanabilir.9,14. Bu tür akıllı nanojeller, uzun süreli kan dolaşımı için üstün stabiliteye sahip oldukları için geleneksel nanojellerden daha faydalıdır ve yüklerinin bütünlüğünü korumak ve istenen hedef bölgelerde kontrollü salınımına aracılık etmek için fizyolojik koşullara dayanabilirler15. Gerçekten de, çok yönlü yapıları nedeniyle, nanojeller, çok sayıda teranostik ve diagnostik uygulama için uyaranlara duyarlı nanojellerin geliştirilmesinde kayda değer ilerlemelerle biyomedikal arenada ilgi görmüştür 2,16,17.

Biyolojikler, proteinler, peptitler ve/veya nükleik asitlerden oluşan bir farmasötik ürün kategorisini temsil edebilir ve dikkate değer seçicilikleri nedeniyle terapötik ortamda devrim yaratmış ve böylece en hızlı büyüyen terapötik sınıf haline gelmiştir18. Gerçekten de, bu tür terapötikler için büyüyen pazar, biyolojik ilaçların 2023'te toplam ilaç onaylarının ~%40'ını temsil ettiği ABD Federal İlaç Birliği (FDA) tarafından onaylarındaki keskin artışta açıkça görülmektedir19. Özgüllüklerine ve potansiyellerine ek olarak, yeni ilaç hedeflerinin hızlı keşfi, daha verimli biyomühendislik süreçleri ve bu terapötiklerin in vivo kaderi hakkında daha fazla bilgi, kullanımlarının artmasına yol açmıştır20. Geleneksel biyolojikler, genellikle rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak üretilen enterferans yapan RNA, replasman proteinleri, sitokinler ve hormonları içerir21. 1982'de insan rekombinant insülinin onaylanmasından bu yana, kanser (örneğin, trastuzumab, avelumab), inflamatuar bağırsak hastalığı (örneğin, adalimumab, certolizumab) ve nadir genetik hastalıklar (örneğin, mipomersan, myozyme, aldurazime, fabrazyme) dahil olmak üzere birçok durum için biyolojikler geliştirilmiştir21. Biyolojiklerin hedefleriyle etkileşimlerinin yüksek özgüllüğü teorik olarak herhangi bir hedef dışı etkiyi dengelemek zorunda olsa da, istenmeyen yan etkilerle ilgili kullanımlarıyla ilgili çeşitli klinik endişeler ortaya çıkmıştır22. Bu yan etkiler, abartılı farmakoloji (hedeflerin aşırı uyarılması) ve immünojenisite dahil olmak üzere iki kategoriye ayrılabilir. Buna ek olarak, kısa yarı ömürleri, sınırlı biyoyararlanımları, proteaz hasarı, kısa raf ömrü ve maliyetli üretim süreçleri terapötik faydalarını sınırlar21. Bu sorunları hafifletmek için geleneksel yöntemler, işlevlerini tehlikeye atabilecek bu biyolojiklerin kovalent modifikasyonunu içerir ve bu nedenle etkinlik23. Alternatif olarak, terapötik yükleri kapsüllemeye yönelik nanotıp yaklaşımı, farmakolojik özelliklere, en önemlisi, gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi yoluyla iltihaplı bölgeye pasif hedefleme olmak üzere çok sayıda avantaj sağlayabilir24. Nanopartikül ile ilişkili diğer faydalar arasında gelişmiş dolaşım süreleri, azaltılmış temizleme oranı, daha fazla formülasyon esnekliği, gelişmiş damar sistemi geçirgenliği ve hücresel alım sayılabilir25. Biyolojik yüklerin teslimi için şu anda çok çeşitli nanopartikül formülasyonları araştırılırken, çok azı nanojellerin çok işlevliliğini taklit edebilir. Gerçekten de, nanojeller, lipozomal ve misel bazlı nanopartiküller tarafından elde edilen yükleme kapasitelerini aşar ve çoğu inorganik nanopartiküllerden daha fazla kolloidal stabilite sergilerler. Bu nedenle, nanojeller çeşitli biyolojik terapötiklerin verilmesi için değerli bir platform sunar.

Daha önce, kullanılan hafif kapsülleme stratejisinin,26 salındıktan sonra proteinin biyoaktivitesini koruduğu, yeni matris metalloproteinaza duyarlı çapraz bağlı polimerik nanojeller içinde bir anti-oksidatif enzimi başarıyla teslim ettik. Bu çalışmada, protein bazlı yüklerin verilmesi için redoksa duyarlı nanojellerin optimize edilmiş sentezini gösteriyoruz. Özellikle, sentetik metodoloji, sert organik çözücüler veya yüksek sıcaklıklar kullanmadan istenen yükü kapsüllemek için hafif koşullar kullanarak nanojel sentezini mümkün kılar. Kapsüllenmiş yükün27,28 salınımını düzenlemek için hücre içi ortamdaki redoks homeostazından yararlandık. Tipik olarak, doğal olarak bol miktarda bulunan antioksidan glutatyon (GSH), konsantrasyonunun sırasıyla 2-20 μM ile 1-10 mM arasında değiştiği hücre dışı ve hücre içi redoks potansiyellerini kontrol eder29,30. Bugüne kadar, çok sayıda redoksa duyarlı nanopartikül rapor edilmiştir, bu da bu, ilaçların in vivo olarak kontrollü salınmasını sağlamak için kanıtlanmış ve güvenilir bir strateji haline getirmektedir 27,28. Gerçekten de, disülfür bağları, disülfür içeren çapraz bağlayıcılar31,32, disülfür içeren monomerlerden33 biyolojik olarak parçalanabilen polimerlerin kendi kendine montajı ve redoksa duyarlı polimer ön ilaçlar veya ilaç/polimer konjugatları34,35 kullanılarak polimerik nanomalzemeler içine yerleştirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışma, polimerik nanopartiküller içinde benzersiz, yüksek derecede GSH'ye duyarlı bir disülfür çapraz bağlayıcının dahil edilmesini araştırır ve böylece kapsüllenmiş bir protein yükünün kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasını sağlar.

Bu çalışmada, nanojel tasarımı, özgüllük ve yük dağıtımını ele almak için aşağıdaki kriterlere odaklanmıştır: endotelin verimli penetrasyonunu ve in vivo stabiliteyi sağlamak için küçük boyut (~ 100 nm) ve tek tip bir boyut dağılımı (polidispersite indeksi (PI) < 0.3); protein yükünün verimli bir şekilde kapsüllenmesi ve GSH'ye yanıt olarak yükün kontrollü olarak serbest bırakılması. İstenen protein yükünün %76'lık bir kapsülleme verimliliği ile homojen 100 nm altı boyutlu nanopartiküller gösteren GSH'ye duyarlı çapraz bağlı nanojellerin sentezini rapor ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Redoks duyarlı çapraz bağlayıcının sentezi

  1. 3 mL susuz diklorometana 2-aminoetilmetakrilat hidroklorür (44.79 mg, 0.270 mmol) ve 0.063 mL trietilamin ekleyin ve 25 mL yuvarlak tabanlı bir şişede inert birN2 gazı altında 20 dakika karıştırmaya bırakın.
  2. 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-Hekzadekaoksa-28,29-ditiaheksapentacontanedioik asit di-N-süksinimidil esteri (100 mg, 0.045 mmol) 1 mL susuz diklorometan içinde çözün ve şişeye ekleyin.
  3. Şişeye 4 mL susuz diklorometan ekleyin. Reaksiyon şişesini alüminyum folyoya sarın ve oda sıcaklığındaN2 altında karıştırmaya bırakın.
  4. İnce tabaka kromatografisi ile ürün oluşumunu onaylayın. Bu yöntemle ürün oluşumunu onaylarken başlangıç malzemesi için doğru referanslar sağlayın.
    1. İnce tabaka kromatografisi, istenen bileşikleri reaksiyon karışımından ayırmak için kullanılan afinite tabanlı bir yöntemdir. Burada, sabit bir faz olarak yüksek polar ve adsorban silika plakayı kullanın. Başlangıç malzemesi numunesini ve reaksiyon karışımı numunesini silika plakanın bir ucuna yerleştirin ve eluent ile kapalı bir cam kabın içine dikey olarak yerleştirin (mobil faz: %5 metanol: diklorometan).
    2. Kılcal hareket ile, mobil faz silika plakayı yukarı doğru hareket ettirir ve numune bileşikleri, sabit ve mobil fazlara olan afinitelerine bağlı olarak değişen mesafelerde hareket eder. Solvent cephesiplakanın 3 /4'ünü geçtiğinde, plakayı çıkarın ve kurutun. Ayrılan bileşikler plaka üzerinde lekeler olarak görünür. İstenen bileşiğin tutma faktörünü (RF), bileşiğin kat ettiği mesafe/çözücünün kat ettiği mesafe olarak nicelleştirin. Burada, ürünün Rf'si 0.35 idi. Lekeleri görselleştirmek için UV ışığı veya boyama kullanılabilir (potasyum permanganat).
  5. Karışımı vakumda konsantre edin ve flaş kolon kromatografisi (% 5 metanolün izokratik karışımı: diklorometan) ile saflaştırın36. Reaksiyon karışımını silika (sabit faz) ile doldurulmuş bir cam sütunun üstüne verin ve ardından çözücü sistemi (mobil faz) ile elüte edin36. Tüm fraksiyonları toplayın ve önceden belirlenen Rf değerini kullanarak ürün fraksiyonlarını ayırt etmek için TLC kullanarak tahlil edin.
  6. Çözücüyü döner bir buharlaştırıcı (sıcaklık: 40 °C) kullanarak buharlaştırarak saflaştırılmış fraksiyonları konsantre edin, önce daha düşük kaynama diklorometanı çıkarmak için vakum basıncını atmosferik basınca ayarlayın. Çözücü seviyesinin düşmesi durduğunda, metanolü uzaklaştırmak ve soluk sarı bir yağ elde etmek için vakum basıncını 337 mbar'a ayarlayın, bu daha sonra ürün oluşumunu doğrulamak için daha fazla karakterizasyona tabi tutulacaktır37.
  7. Fourier Dönüşümü Kızılötesi (FT-IR) analizi38, 1H NMR (döteryumlu dimetilsülfoksit (DMSO-d 6) içinde)39, 13C NMR39 ve matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş süresi (MALDI-ToF)40 analizi yapın sonraki adımları gerçekleştirmeden önce ürün oluşumunu doğrulamak için.
    1. FT-IR analizi için, spektrumları elde etmek için cihaza 1 mg yağ yükleyin.
    2. NMR analizleri için, 10 mg ürünü 0,75 mL ilgili NMR çözücüsü içinde yeniden çözün, bir NMR tüpüne aktarın ve sızıntıyı önlemek için sıkıca kapatın. Numuneyi NMR cihazına yükleyin, ardından spektrumlarelde edilir 39.
    3. Kütle spektrometresi analizi için, 1 mg ürünü bir şişeye kapatın, DMSO'da çözün ve cihaza yükleyin.
      NOT: Kızılötesi analiz, istenen üründeki temel fonksiyonel gruplar hakkında bilgi sağlar, yani 1650 cm-1'deki keskin tepe ile tanımlanan karbonil gerilmeleri (C=O), amid bağının oluşumunu gösterir ve böylece ürün oluşumunu vurgular. 1H NMR ve 13C, kimyasal ortamlar hakkında bilgi sağlar ve böylece bileşikte bulunan kimyasal ortamların tanımlanması yoluyla istenen ürünün kimyasal bileşimini belirlemek için kullanılabilir. Son olarak, kütle spektrometresinin kullanılması, istenen ürünün tam kütlesini doğrulayabilir.

2. Disülfür çapraz bağlayıcının glutatyon ile bölünmesini test edin

  1. Disülfür çapraz bağlayıcıyı (4.55 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar) indirgeyici ajan glutatyon (nihai [GSH]: 10 mM) ile 1.5 mL'lik bir cam şişede 24 saat boyunca 1 mL'lik bir nihai hacme kadar inkübe edin.
  2. Disülfür bağlayıcının bölünmesini doğrulamak için, şişeyi MALDI-ToF analizi26,40 için gönderin.

3. Redoksa duyarlı nanojel sentezi

  1. Reaksiyon için kullanılacak tüm cam eşyaların filtrelenmiş (0,20 μm) deiyonize su ile yıkayarak ve ardından cam eşyaları, çeker ocak tarafındaki basınçlı hava şebekesi aracılığıyla erişilebilen basınçlı hava kullanarak kurutarak tozdan arındırıldığından emin olun. Erişilebilirliği kolaylaştırmak için basınçlı hava çıkışına güvenli bir nozul takın. Şişeyi güvenli bir şekilde tutun ve nozulu içine yerleştirin. Basınçlı havayı etkinleştirin ve şişeye kontrollü bir akış bırakın. Etkili kurutma sağlamak için işlemi gözlemleyin, kalan kirleticileri veya nemi kontrol edin.
  2. Deiyonize su ile doldurarak 10 mL'lik bir cam şişe hazırlayın ve şişeyi kauçuk bir septum ile kapatın. Reaksiyona başlamadan önce en az 30 dakika boyuncaN2'yi köpürterek suyun oksijenini giderin. Bunu yapmak için, bir balonuN2 gazı ile doldurun ve balona bir iğne takın; septumun üzerine yerleştirin ve kauçuk septumu delmek veN2 akışına izin vermek için iğneyi kullanın. N2'nin sabit akışını sağlamak için şişeye bir çıkış iğnesi takın.
  3. Sığır serum albüminini (BSA; 2 mg, 30 nmol) veya Cy7 etiketli BSA'yı (2 mg, 30 nmol) 1 mL oksijensiz deiyonize suda çözün ve başka bir temiz 10 mL cam şişeye ekleyin.
  4. Şişeye [2- (akriloyloksi) etil] trimetilamonyum klorür (AETC) çözeltisi (12.00 mg / 10.86 μL, 0.060 mmol) ekleyin ve başka bir kauçuk septum kullanarak kapatın. Reaksiyon karışımının sabit birN2 gazı akışı altında tutulduğundan emin olun ve 30 dakika karıştırın.
  5. Akrilamid'i (9.21 mg, 0.13 mmol) 1 mL oksijeni giderilmiş deiyonize suda çözün ve şişedeki karışıma ekleyin.
  6. Disülfür çapraz bağlayıcıyı (4.44 mg, 0.004 mmol) 1 mL deiyonize su içinde çözün ve şişedeki karışıma ekleyin. Karışımı N2 gazı ile 20 dakika yıkayın.
  7. Sodyum dodesil sülfatı (2 mg, 0.007 mmol) 1 mL oksijeni alınmış deiyonize su içinde çözün veN2 gazla yıkanmış bir şırınga ile karışıma ekleyin ve karışımı 30 dakika karıştırın.
    NOT: ŞırıngayıN2 ile yıkayarak, reaksiyon karışımının atmosferdeki oksijene maruz kalmasını en aza indiririz, bu da radikal polimerizasyon reaksiyonunu inhibe edebilir.
  8. N, N, N', N'-tetrametiletilendiamin (1.5 μL, 0.010 mmol) ekleyin ve reaksiyon karışımınınN2 gazı altında 3 dakika boyunca oksijensizleşmesine izin verin.
  9. Amonyum persülfatı (1 mg, 0.004 mmol) 1 mL oksijeni giderilmiş deiyonize suda çözün ve reaksiyon karışımına ekleyin. N2 gazının reaksiyon karışımından 10 dakika boyunca köpürdüğünden emin olun.
    NOT:N2 ekleme adımı atlanırsa, reaksiyon şişesinde beyaz partiküllerin oluşması muhtemeldir. Bunlar daha büyük boyutlu parçacıklar ve/veya agregalardır ve daha fazla karakterizasyonu karıştırabilir.
  10. Şişeyi N2 atmosferi altında kapatın ve oda sıcaklığında 3 saat 30 dakika karıştırmaya bırakın.
  11. Reaksiyonu sonlandırmak için, contayı şişeden çıkarın ve reaksiyon karışımının en az 10 dakika karışmasına izin verin. Bu, reaksiyon karışımını atmosferikO2 gazı seviyelerine maruz bırakacak ve bu da reaksiyon karışımında kalan radikalleri söndürecektir. Reaksiyon, karışım berrak mavi yanardöner bir görünüm aldığında sona erer.
  12. Nanojelleri saflaştırmak için, reaksiyon karışımını 15 mL'lik bir santrifüj filtre ünitesine (100 kDa MWCO) ekleyin ve santrifüj ünitesini doldurmak için deiyonize su ekleyin. Reaksiyon karışımını 1000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Bu, 100 kDa'dan daha küçük olan reaksiyona girmemiş kimyasalları (veya kapsüllenmemiş yükü) ortadan kaldıracak ve nanojel numunesini konsantre edecektir.
  13. Santrifüj ünitesindeki su seviyesi düştüğünde, nanojel numunesini seyreltmek için 2 mL deiyonize su ekleyin ve ürünü konsantre etmek için santrifüjleyin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
  14. Kapsüllenmiş proteinin bozulmasını önlemek için numuneyi 2-8 °C'de saklayın.
  15. Polimerizasyonu doğrulamak için FT-IR ve 1H NMR (döteryumlu dimetil sülfoksit (DMSO-d 6)) analizi yapın39,41. Numuneyi hazırlamak için, 1,5 mL'lik bir şişede 1 mL nanojel solüsyonunu dondurarak kurutun. Dondurarak kurutma işlemi, numunenin dondurulmasını ve ardından donmuş çözücünün süblimasyon yoluyla uzaklaştırılması için bir vakum uygulanmasını ve geride toz haline getirilmiş bir kalıntı bırakılmasını içerir. Dondurarak kurutmadan sonra, numuneyi ilgili NMR çözücüsü içinde yeniden çözün, bir NMR tüpüne aktarın ve sıkıca kapatın. Numuneyi daha önce açıklandığı gibi NMR makinesine yükleyin39. FT-IR analizi için, spektrumları elde etmek için cihaza 1 mg kuru toz yüklenmelidir.

4. Nanojel morfolojik karakterizasyonu

  1. Dinamik ışık saçılımı (DLS)
    NOT: Hidrodinamik çap (nm), polidispersite indeksi (PI) ve zeta potansiyeli, bir DLS makinesi kullanılarak 25 °C, 632.8 nm lazer dalga boyunda ve 173° sinyal dedektöründe ölçülmüştür. Her çalıştırma 25 alt tarama döngüsü ölçtü.
    1. Hidrodinamik boyut (nm) ölçümü
      1. Filtrelenmiş deiyonize su ile temizleyerek bir küvet veya tek kullanımlık katlanmış bir kılcal hücre hazırlayın. Büyük toz parçacıklarından arınmış olduğundan emin olmak için küvete basınçlı hava üfleyin (hem DLS hem de zeta potansiyeli ölçümleri için uygundur).
      2. Küveti en az 50-100 μL numune ile doldurun ve 750-1000 μL filtrelenmiş deiyonize su ile seyreltin. Zeta potansiyel bir küvet kullanırken, küvetin ölçümleri bozabilecek kabarcık oluşumu olmadan numune ile doldurulduğundan emin olun.
      3. Küveti DLS cihazının içine yerleştirin ve doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Bunu yapmak için, s'yi açınampDLS cihazının bölme kapağı. Optik pencerelerde parmak izi kalmaması için küveti üst kenarlarından tutun. Küvetin küvet tutucusuna düzgün şekilde oturduğundan emin olun, düz olduğundan ve cihazın optik yolu ile hizalandığından emin olun. Ortam ışığı girişimini önlemek için numune bölmesini kapatın.
        NOT: Seyreltme ortamı, 0.45 μm gözenek boyutlu şırınga filtresi kullanılarak filtrelenir.
      4. İlgili DLS makine yazılımında partikül boyutu ölçümünü başlatmak için tıklayın.
      5. Z-ortalaması (ortalama parçacık boyutu), ortalama PI, saniyedeki kilo sayısı (kcps), zeta potansiyeli ve ilgili grafikleri elde etmek için numuneye karşılık gelen sonuçları seçin. Korelasyon fonksiyonunun düzgün bir sigmoidal eğri sergilediğinden emin olun, çünkü bu tek tip bir örnek önerir.
      6. Analiz tamamlandıktan sonra küveti DLS'den çıkarın.
  2. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
    1. Karbon kaplı bakır ızgaralara 10 μL nanopartikül çözeltisi (0.077 mg / mL) yerleştirerek numuneler hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 saat havayla kurutun.
    2. Izgaraları filtrelenmiş deiyonize su ile yıkayın ve 5 μL filtrelenmiş %1 uranil asetat ile 2 dakika suda boyayın.
    3. Fazla boyama maddesini filtre kağıdı ile ıslattıktan sonra, ızgaraları gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Ertesi gün parlak bir alan kamerası kullanarak 45.000x büyütmede TEM görüntüleri yakalayın.
    4. Görüntü işleme için sağlanan yazılımı kullanın (çözünürlük: 2048 x 2048 piksel).

5. Bir mikro-bikinkoninik asit (BCA) testi kullanılarak nanojeller içinde kapsüllenmiş proteinin (BSA) miktar tayini

  1. MicroBCA tahlil protokolüne göre (üreticinin web sitesinde verilmiştir), önceden tanımlanmış bir protein konsantrasyonuna dayalı standart bir eğri oluşturun42.
  2. Sentezlerini takiben, protein kapsülleyici nanojelleri, adım 3.12-3.14'te açıklandığı gibi 100 kDa MWCO (1000 x g, 10 dk) ile 15 mL santrifüj filtre üniteleri kullanarak saflaştırın.
  3. Süzüntüyü toplayın ve microBCA testini (üreticinin web sitesinde bulunan protokol) kullanarak analiz edin. Bir plaka okuyucu kullanarak absorbansı 562 nm'de ölçün. Bu ölçüm, kapsüllenmemiş protein konsantrasyonu ile ilişkili olduğundan, kapsüllenmiş proteinin kütlesini belirleyin. Kapsülleme verimliliğini (EE) % hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
    figure-protocol-1

6. Glutatyon varlığında nanojellerden protein salınımının miktarının belirlenmesi

  1. 200 μL 5 mg / mL Cy7BSA yüklü nanojelleri 0.5 mL santrifüj filtre ünitelerinde (100 kDa MWCO) 200 μL 10 mM glutatyon (GSH) ile inkübe edin. Sıcaklığı 37 °C'de tutmak için filtre ünitelerini bir su banyosuna yerleştirin.
  2. 1000 x g'da 3 dakika, her 10 dakikada bir, en az 1 saat - daha sonra her 2-8 saatte bir santrifüjleyin.
  3. Süzüntüyü toplayın ve daha fazla analiz için kullanın. Daha fazla deiyonize su veya PBS ekleyerek santrifüj filtre üniteleri içindeki süzüntü hacmini 500 μL'de tutun.
  4. Floresan proteinin absorbansının 750 nm'de bir nanodrop aleti kullanılarak ölçüldüğü Cy7BSA yüklü nanojeller için standart bir eğriye başvurarak filtratlardaki protein miktarını ölçün.
    NOT: Bu standart eğri, 0 mg / mL ila 2 mg / mL aralığında Cy7BSA'nın seri dilüsyonları hazırlanarak hesaplanabilir. Nanodrop'tan elde edilen değerler, kapsülleme verimliliğini belirlemek için bu kalibrasyon eğrisine karşı enterpolasyonlu hale getirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poli (etilen glikol) (PEG) disülfür diakrilat çapraz bağlayıcının sentezi ve karakterizasyonu Redoksa duyarlı çapraz bağlayıcı, bir N-hidroksisüksinamid (NHS) esterin, bir amid bağının oluşumu yoluyla 2-aminoetil metakrilat ile nükleofilik ikame edilmesiyle sentezlendi (Şekil 1). Gerekli ürünün sentezi, esas olarak, ürün numunesinin döteryumlu DMSO'da çözülmesiyle gerçekleştirilen 1H NMR (Ek Şekil 1) ile doğrulandı, burada δ3.48-3.53'te P...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyofarmasötik endüstrisinde hedefe özgü biyolojik maddelere yönelik artan talep, in vivo farmakolojik profillerini iyileştirebilen, aynı zamanda hızlı fizyolojik bozulmalarını önleyebilen ve istenmeyen yan etkileri dengeleyebilen teknolojilere olan ihtiyacı artırmıştır. Bunu akılda tutarak, protein yüklü nanojellerin sentezi için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Protokolde belirtildiği gibi, redoksa duyarlı çapraz bağlayıcının nanojel sentezinden önce sentezlenmesi gerekir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Beyan edilecek herhangi bir finansal detay yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imperial College London Kimya Bölümü'ne ve Tıbbi Araştırma Konseyi Yaşam Bilimleri Enstitüsü'ne destekleri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar< / güçlü >
2- (
akriloyloksi) etil] trimetilamonyum klorür çözeltisi & nbsp;		Sigma Aldrich496146
2-aminoetil metakrilathidroklorür ve nbsp;Sigma Aldrich516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,
44,47,50,53-Hekzadekaoksa-28,29-ditiaheksapentacontanedioik asit di-N-süksinimidil ester 		Sigma Aldrich671630
AkrilamidSigma Aldrich23701
Amonyum persülfatSigma Aldrich248614
Sığır serum albüminiSigma AldrichB6917
Cy7 etiketli sığır serum albüminiNanocsBS1-S7-1
Döteryumlanmış dimetil sülfoksitSigma Aldrich547239
DiklorometanSigma Aldrich270997 (susuz) ve D65100
GlutatyonSigma AldrichG4251
MetanolSigma Aldrich34860
N, N, N', N'-tetrametiletilendiamin Sigma Aldrich411019
Fosfat tamponlu tuzlu su ThermoFisher10010023
Sodyum dodesil sülfatSigma Aldrich436143
TrietilaminSigma Aldrich471283
UranilAsetat Agar Scientific AGR1260A
Nanojel sentezi ve karakterizasyonu için gerekli ekipmanlar
Amicon Ultra-15 Santrifüj filtre üniteleri (100kDa MWCO) Merck MilliporeC7715
Fotoğraf MakinesiOlympus Veleta
Karbon Kaplı Bakır IzgaralarAgar Scientific AGS160
Diyaliz tüpü (100kDa MWCO)Dinamik
laboratuvarları Malvern Zetasizer Nano Ultra
Dondurarak KurutucuLabconcoWZ-03336-01
Kızılötesi spektroskopiAgilent Cary 630 FTIR
iTEM yazılımıOlympus 
Kütle spektrometresiSularMikrokütle MALDI microMX MALDI Q-ToF 
MF-MilliporeTM membran filtre (0.45/0.2μ m gözenek boyutu)Merck Millipore, UKHAWP04700, GSWP04700 
Mikro BCA Protein TestKiti ThermoFisher23235
Plaka okuyucuBeckmanCoulter-PARADIGM
Proton ve Karbon-13 nükleer manyetik rezonans verileriBruker400MHz AV-400 NMR spektrometresi
Döner buharlaştırıcı ve nbsp;Buçi R-114 Döner Vap Sistemi
Tek kullanımlık iğneler Sterican4665643
Suba-Seal  septaSigma AldrichZ124575
Transmisyon elektron mikroskobuPhillips CM 100 TEM 
UV-vis spektrofotometresiNanodropNanodrop One/One C mikrovolume 
Işık Saçılımı 11405949 spektrum

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X., Malhotra, S., Molina, M., Haag, R. Micro- and nanogels with labile crosslinks - from synthesis to biomedical applications. Chem Soc Rev. 44 (7), 1948-1973 (2015).
  2. Chacko, R. T., Ventura, J., Zhuang, J., Thayumanavan, S. Polymer nanogels: A versatile nanoscopic drug delivery platform. Adv Drug Del Rev. 64 (9), 836-851 (2012).
  3. Hajebi, S., et al. Stimulus-responsive polymeric nanogels as smart drug delivery systems. Acta Biomaterialia. 92, 1-18 (2019).
  4. Lee, V. Y., et al. Nanogel star polymer architectures: A nanoparticle platform for modular programmable macromolecular self-assembly, intercellular transport, and dual-mode cargo delivery. Adv Mat. 23 (39), 4509-4515 (2015).
  5. Ekkelenkamp, A., Rachèl Elzes, M., Engbersen, J. F., Paulusse, J. M. Responsive crosslinked polymer nanogels for imaging and therapeutics delivery. J Mat Chem B. 6 (2), 210-235 (2018).
  6. Vinogradov, S. V., Zeman, A. D., Batrakova, E. V., Kabanov, A. V. Polyplex nanogel formulations for drug delivery of cytotoxic nucleoside analogs. J Control Rel. 107 (1), 143-157 (2015).
  7. Akiyoshi, K., Deguchi, S., Moriguchi, N., Yamaguchi, S., Sunamoto, J. Self-aggregates of hydrophobized polysaccharides in water. Formation and characteristics of nanoparticles. Macromol. 26 (12), 3062-3068 (1993).
  8. Lemieux, P., et al. Block and graft copolymers and NanoGel copolymer networks for DNA delivery into cell. J Drug Target. 8 (2), 91-105 (2000).
  9. Preman, N. K., Barki, R. R., Vijayan, A., Sanjeeva, S. G., Johnson, R. P. Recent developments in stimuli-responsive polymer nanogels for drug delivery and diagnostics: A review. Euro J Pharma Biopharmac. 157, 121-153 (2020).
  10. Oh, J. K., Drumright, R., Siegwart, D. J., Matyjaszewski, K. The development of microgels/nanogels for drug delivery applications. Prog Poly Sci. 33 (4), 448-477 (2008).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Deng, C., Suuronen, E. J., Zhong, Z. Click hydrogels, microgels and nanogels: Emerging platforms for drug delivery and tissue engineering. Biomat. 35 (18), 4969-4985 (2014).
  12. Napier, M. E., DeSimone, J. M. Nanoparticle drug delivery platform. Poly Rev. 47 (3), 321-327 (2007).
  13. Malmsten, M. Soft drug delivery systems. Soft Matt. 2 (9), 760-769 (2006).
  14. Kamaly, N., Yameen, B., Wu, J., Farokhzad, O. C. Degradable controlled-release polymers and polymeric nanoparticles: Mechanisms of controlling drug release. Che Rev. 116 (4), 2602-2663 (2016).
  15. Molina, M., et al. Stimuli-responsive nanogel composites and their application in nanomedicine. Chem Soc Rev. 44 (17), 6161-6186 (2015).
  16. Ma, Y., Ge, Y., Li, L. Advancement of multifunctional hybrid nanogel systems: Construction and application in drug co-delivery and imaging technique. Mat Sci Eng: C. 71, 1281-1292 (2017).
  17. Wang, H., Qian, J., Ding, F. Recent advances in engineered chitosan-based nanogels for biomedical applications. J Mat Chem B. 5 (34), 6986-7007 (2017).
  18. Durán-Lobato, M., Niu, Z., Alonso, M. J. Oral delivery of biologics for precision medicine. Adv Mat. 32 (13), 1901935(2020).
  19. de la Torre, B. G., Albericio, F. The pharmaceutical industry in 2022: An analysis of FDA drug approvals from the perspective of molecules. Molecules. 28 (3), 1038(2023).
  20. Škalko-Basnet, N. Biologics: The role of delivery systems in improved therapy. Biologics. 8, 107-114 (2014).
  21. Andrews, L., Ralston, S., Blomme, E., Barnhart, K. A snapshot of biologic drug development: Challenges and opportunities. Human Exp Toxicol. 34 (12), 1279-1285 (2015).
  22. Sathish, J. G., et al. Challenges and approaches for the development of safer immunomodulatory biologics. Nat Rev Drug Disc. 12 (4), 306-324 (2013).
  23. Pfister, D., Morbidelli, M. Process for protein PEGylation. J Control Rel. 180, 134-149 (2014).
  24. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  25. Golombek, S. K., et al. Tumor targeting via EPR: Strategies to enhance patient responses. Adv Drug Del Rev. 130, 17-38 (2018).
  26. Basak, S., et al. Simultaneous cross-linking and cross-polymerization of enzyme responsive polyethylene glycol nanogels in confined aqueous droplets for reduction of low-density lipoprotein oxidation. Biomacromol. 22 (2), 386-398 (2021).
  27. Morgulchik, N., Kamaly, N. Meta-analysis of in vitro drug-release parameters reveals predictable and robust kinetics for redox-responsive drug-conjugated therapeutic nanogels. ACS Appl Nano Mat. 4 (5), 4256-4268 (2021).
  28. Ghorbani, M., Hamishehkar, H. Redox-responsive smart nanogels for intracellular targeting of therapeutic agents: Applications and recent advances. J Drug Target. 27 (4), 408-422 (2019).
  29. Bajic, V. P., et al. Glutathione "redox homeostasis" and its relation to cardiovascular disease. Oxi Med Cell Long. 2019, e5028181(2019).
  30. Forman, H. J., Zhang, H., Rinna, A. Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis. Mol Asp Med. 30 (1-2), 1-12 (2009).
  31. Wang, Y. C., et al. Core-shell-corona micelle stabilized by reversible cross-linkage for intracellular drug delivery. Macromol Rapid Comm. 31 (13), 1201-1206 (2010).
  32. Elkassih, S. A., Kos, P., Xiong, H., Siegwart, D. J. Degradable redox-responsive disulfide-based nanogel drug carriers via dithiol oxidation polymerization. Biomat Sci. 7 (2), 607-617 (2019).
  33. Hu, X., et al. Stimuli-responsive polymersomes for biomedical applications. Biomacromol. 18 (3), 649-673 (2017).
  34. Navath, R. S., Wang, B., Kannan, S., Romero, R., Kannan, R. M. Stimuli-responsive star poly(ethylene glycol) drug conjugates for improved intracellular delivery of the drug in neuroinflammation. J Control Release. 142 (3), 447-456 (2010).
  35. Ling, X., et al. Glutathione-responsive prodrug nanoparticles for effective drug delivery and cancer therapy. ACS Nano. 13 (1), 357-370 (2019).
  36. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. J Org Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
  37. JoVE. JoVE science education database - Organic chemistry. Rotary evaporation to remove solvent. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  38. JoVE. JoVE science education database - Organic chemistry II. Infrared spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  39. JoVE. science education database - Organic chemistry. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2023).
  40. Kim, J. Sample preparation for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Mass Spec Lett. 6, 27-30 (2015).
  41. Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure. Polymers. 11 (2), 353(2019).
  42. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  43. Yu, M., Wu, J., Shi, J., Farokhzad, O. C. Nanotechnology for protein delivery: Overview and perspectives. J Control Release. 240, 24-37 (2016).
  44. Zhang, Y., Zhang, D., Wang, J. T., Zhang, X., Yang, Y. Fabrication of stimuli-responsive nanogels for protein encapsulation and traceless release without introducing organic solvents, surfactants, or small-molecule cross-linkers. Poly Chem. 12 (4), 554-563 (2021).
  45. Kamaly, N., et al. Targeted interleukin-10 nanotherapeutics developed with a microfluidic chip enhance resolution of inflammation in advanced atherosclerosis. ACS Nano. 10 (5), 5280-5292 (2016).
  46. Lu, R., et al. Probing the secondary structure of bovine serum albumin during heat-induced denaturation using mid-infrared fiberoptic sensors. Analyst. 140 (3), 765-770 (2015).
  47. Abrosimova, K. V., Shulenina, O. V., Paston, S. V. FTIR study of secondary structure of bovine serum albumin and ovalbumin. J Phys: Conf Ser. 769, 012016(2016).
  48. Kabanov, A. V., Vinogradov, S. V. Nanogels as pharmaceutical carriers: Finite networks of infinite capabilities. Ang Chem Int Ed Eng. 48 (30), 5418-5429 (2009).
  49. Li, C., Obireddy, S. R., Lai, W. F. Preparation and use of nanogels as carriers of drugs. Drug Del. 28 (1), 1594-1602 (2021).
  50. Kulkarni, J. A., et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 16 (6), 630-643 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Nanojel SenteziSulu apraz Ba lamaProtein Kaps llemeDinamik I k Sa lmasGe irimli Elektron MikroskobuRedoks Duyarl NanojellerKontroll Sal mKaps lleme Verimlili i

İlgili makaleler