Yöntem makalesi

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

DOI:

10.3791/63990

⸱

17 Ekim 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dolaşımdaki ve dokuda yerleşik hücre dışı veziküller (EV'ler) yeni teranostik biyobelirteçler olarak umut verici hedefleri temsil eder ve organizma homeostazının korunmasında ve geniş bir hastalık spektrumunun ilerlemesinde önemli oyuncular olarak ortaya çıkarlar. Mevcut araştırma, endozomal kökenli endojen eksozomların karakterizasyonuna odaklanırken, plazma zarından dökülen mikro-parçacıklar, ana hücrelerin zar imzasını özetleyen yüzey moleküllerinin bolluğu ile öne çıkan sağlık ve hastalıkta artan bir dikkat kazanmıştır. Burada, EV'leri plazmadan ve kemik gibi katı dokulardan çıkarmak ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan tekrarlanabilir bir prosedür sunulmaktadır. Protokol ayrıca, yüzey antijenlerinin ve EV'lerin protein yüklerinin daha sonraki profillemelerini açıklamaktadır, bu nedenle türevleri için izlenebilir ve potansiyel fonksiyonla ilgili bileşenlerle tanımlanmıştır. Bu yöntem, biyolojik, fizyolojik ve patolojik çalışmalarda EV'lerin korelasyonlu, fonksiyonel ve mekanik analizi için yararlı olacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküllerin (EV'ler), çeşitli fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli rol oynayan hücre dışı yapılarıtanımlamak için hücre dışı veziküller (EV'ler) önerilmiştir2. Sağlıklı hücreler tarafından salınan EV'ler genel olarak iki ana kategoriye ayrılabilir: hücre içi endositik trafik yolu3 yoluyla oluşan eksozomlar (veya küçük EV'ler) ve hücre4'ün plazma zarının dışa doğru tomurcuklanmasıyla gelişen mikro-parçacıklar (veya büyük EV'ler). Birçok çalışma, in vitro5 kültürlü hücrelerden toplanan EV'lerin işlevine odaklanırken, dolaşımdan veya dokulardan türetilen EV'ler, organizmanın gerçek durumunu in vivo6'da yansıtma avantajına sahip olan daha karmaşık ve heterojendir. Ayrıca, hemen hemen her türlü doku in vivo EV'ler üretebilir ve bu EV'ler doku içinde haberci olarak hareket edebilir veya sistemik iletişimi kolaylaştırmak için çeşitli vücut sıvıları, özellikle periferik kan tarafından aktarılabilir7. Dolaşımdaki EV'ler ve dokular da hastalık tanı ve tedavisi için hedeflerdir8.

Eksozomlar son yıllarda yoğun bir şekilde çalışılırken, mikro-parçacıklar ayrıca ultrasantrifüjleme olmadan kolayca ekstrakte edilebilen önemli biyolojik fonksiyonlara sahiptir, böylece temel ve klinik araştırmaları teşvik eder9. Özellikle, dolaşımdan ve dokulardan izole edilen EV'lerle ilgili kritik bir konu, farklı hücre tiplerinden türetilmiş olmalarıdır10. Mikro-parçacıklar plazma zarından kesildiğinden ve bol miktarda hücre yüzey molekülü9 ile öne çıktığından, bu EV'lerin hücresel kökenini tanımlamak için ana hücre zarı belirteçlerinin kullanılması mümkündür. Spesifik olarak, membran belirteçlerini tespit etmek için akış sitometrisi (FC) tekniği uygulanabilir. Dahası, araştırmacılar EV'leri izole edebilir ve fonksiyonel kargolara dayanarak daha fazla analiz yapabilirler.

Mevcut protokol, EV'leri in vivo örneklerden çıkarmak ve karakterize etmek için kapsamlı bir prosedür sunmaktadır. EV'ler diferansiyel santrifüjleme yoluyla izole edilir ve EV'lerin karakterizasyonu, nanopartikül izleme analizi (NTA) ve iletim elektron mikroskobu (TEM) yoluyla morfolojik tanımlamayı, FC yoluyla orijin analizini ve batı lekesi yoluyla protein kargo analizini içerir. Farelerin kan plazması ve maksiller kemiği temsilci olarak kullanılır. Araştırmacılar, diğer kaynaklardan EV'ler için bu protokole başvurabilir ve ilgili değişiklikleri yapabilirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Kılavuzları ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 8 haftalık C57Bl / 6 fareleri (dişi veya erkek tercihi olmadan) kullanılmıştır. Plazma ve doku EV'lerinin izole edilmesinde yer alan adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Plazma, vücut sıvılarından EV izolasyon prosedürünü tanımlamak için bir temsilci olarak alınır. Maksiller kemik, katı dokulardan EV izolasyon prosedürünü açıklamak için bir temsilci olarak alınır.

1. Plazma ve maksiller kemik örneklerinin hazırlanması

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek plazma numunelerini hazırlayın.
    1. Standart bir laboratuvar terazisi kullanarak farenin vücut ağırlığını belirleyin.
    2. 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 20 μL, 2 mg/mL heparin ekleyin ve heparinin tüpün duvarına yapışmasını sağlamak için karıştırıcı cihazı kullanın ( bkz.
      NOT: Antikoagülasyon tüpleri doğrudan kan toplamak için de kullanılabilir.
    3. 50 mg/kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile fareyi uyuşturun (bkz. Farenin boynunu başparmak ve işaret parmağınızla tutun, ardından kuyruğu ve sol arka bacağı küçük parmağınızla sabitleyin ve göbeği açığa çıkardıktan sonra pentobarbital sodyumu 1 mL'lik bir enjeksiyon şırıngasıyla enjekte edin.
    4. Ayak yastığı sıkıştığında kornea refleksinin yokluğuna ve uzuv reaksiyonuna bağlı olarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğunu onaylayın.
    5. Yüzdeki saçları ve gözlerin kirpiklerini kavisli makasla tıraş edin.
    6. Farenin boyun derisini tutun ve göz küresinin çıkıntı yapması için gözlerin etrafındaki cildi boynun arkasına bastırın. Göz küresini hızlı bir şekilde sıkıştırmak için oftalmik cımbız kullanın ve adım 1.1.2'de hazırlanan 1.5 mL santrifüj tüpleri ile kan çıkışını toplayın. Servikal omurları yerinden oynatarak fareyi feda edin.
      DİKKAT: Tüylere ve kirpiklere dikkat edin, çünkü hemolize neden olabilirler.
    7. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için tüpü birkaç kez yavaşça baş aşağı çevirin.
      DİKKAT: Tüpü mümkün olan en kısa sürede baş aşağı çevirin.
    8. Kan örneğini 4 ° C'de 1.200 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
    9. Süpernatantı yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve plazma numunesini hemen kullanın veya birkaç saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
    10. Süpernatantı eşit miktarda 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin ve iyice karıştırın.
      NOT: Plazmayı toplamak için yukarıda verilen protokol ölümcüldür. Kan, fareyi feda etmeden subklaviyen ven delinmesi11 yoluyla da toplanabilir.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek maksiller kemik örneklerini hazırlayın.
    1. Maksiller kemiği oftalmik cımbız ve makasla izole edin ve cımbızla yumuşak dokulardan kurtulmak için PBS ile yıkayın.
    2. Maksiller kemiği 1,5 mL santrifüj tüplerine koyun ve kemiği makasla küçük parçalara ayırın (boyut çapı 1 mm'den az olmalıdır). Dokuyu örtmek için belirli miktarda Liberaz (5 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin (8 haftalık bir fareden alınan kemik örnekleri için genellikle 1 mL) ve ardından 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Numuneyi 800 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.
    4. Süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.

2. EV'lerin çıkarılması

  1. Büyük hücre kalıntılarını ve kalan trombositleri çıkarmak için numuneleri (adım 1.1.10 ve adım 1.2.4'te hazırlanan) 2.500 x g'de (4 ° C) 15 dakika boyunca santrifüj edin.
  2. Süpernatantları yeni ve temiz 1,5 mL santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüj yapın.
    NOT: EV'leri çıkarmak için santrifüjleme hızı 10.000 x g'nin üzerine ayarlanabilir12. Santrifüjün hızı ne kadar yüksek olursa, o kadar fazla sayıda EV elde edilebilir. Kullandığımız santrifüjün hız sınırı 16.800 x g olduğu için ( Malzeme Tablosuna bakınız), bu protokolünde bu hızı seçtik.
  3. Süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri 1 mL PBS ile yeniden askıya alın. 16.800 x g'de (4 °C) 30 dakika boyunca santrifüj.
  4. Süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri 50 μL PBS ile yeniden askıya alın. Bu numuneleri 4 °C'de sadece 24 saatten daha kısa bir süre için saklayın veya tercihen aşağıdaki analizler için hemen kullanın (adım 3-5).
    DİKKAT: -80 ° C'de depolama kabul edilemez, çünkü bu, EV'lerin konsantrasyonunu azaltacak ve EV'lerin13'ünün partikül boyutlarını artıracak, böylece EV'lerin aşağıdaki analizini etkileyecektir.

3. EV'lerin morfolojik olarak tanımlanması

  1. NTA analizi gerçekleştirin.
    1. EV'lerin miktarına göre (kabaca peletlerin boyutuna göre değerlendirilir, 50 μL plazma parçacıkları minimumdur), 5-50 μL resuspension aktarın (adım 2.4), 10 mL tampon çözeltisinde seyreltin (PBS 0.22 μm filtre ile filtrelenmiştir) ve 1 mL mikro pipetleyici uçlarıyla yeterince karıştırın. Partikül ölçümü için bu son süspansiyonu kullanın.
    2. Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı beşten az olana kadar orta ve sabit bir hızda en az 5 mL damıtılmış su enjekte etmek için steril bir 1 mL şırınga kullanın.
      NOT: Tüm kanaldan 1 mL damıtılmış su enjekte edildikten sonra, partikül sayısı doğrudan algılama arayüzünde gösterilir. Sayı hala beşin üzerindeyse, kriterler karşılanana kadar 1 mL damıtılmış su enjekte etmeye devam edin.
    3. Birincil çözelti oluşturmak için 1 mL damıtılmış suda 1 μL kalibrasyon çözeltisini yeniden oluşturun ve daha sonra standart bir stok çözeltisi hazırlamak için birincil çözeltinin 100 μL'sini 25 mL damıtılmış suya alın (1:250.000). Bu çalışan reaktifi 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.
    4. NTA cihazını standart stok çözeltisi ile kalibre edin (adım 3.1.3). Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı 50-400 arasında (tercihen 300 civarında) olana kadar makine kanalını yıkamak için 1-5 mL steril şırınga ile 1-5 mL çalışma kalibrasyon çözeltisi enjekte edin. Kalibrasyon programını çalıştırın.
    5. Her numune ölçümünden önce makine kanalını yıkamak için adım 3.1.2'yi tekrarlayın.
    6. Algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı 10'dan az olana kadar makine kanalını sabit bir hızda yıkamak üzere en az 2 mL tampon çözeltisi enjekte etmek için steril bir 1 mL şırınga kullanın.
    7. Adım 3.1.1'de hazırlanan EV numunesinin 1 mL'sini orta ve sabit bir hızla enjekte edin (önerilen hız 0,5-1 mL / s'dir).
      NOT: Optimum partikül konsantrasyonu, algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısını 50-400 arasında, tercihen 300 civarında yapmaktır. Partikül sayısı çok yüksekse, kanal duvarında partikül tutulmasını önlemek için makine kanalını hemen yıkamak için adım 3.1.2'yi tekrarlayın ve adım 3.1.1 ile EV numunesinin konsantrasyonunu ayarlayın, ardından adım 3.1.5'ten itibaren tekrarlayın.
    8. Partikül analizini yapın ve analiz raporlarını üreticinin talimatlarına göre oluşturun (bakınız Malzeme Tablosu).
    9. Numune değerliyse, EV numunesini 1 mL şırınga ile geri pompalayın ve bunları 1,5 mL santrifüj tüplerinde toplayın. EV'leri çıkarmak için adım 2.2'yi tekrarlayın.
    10. Tüm numuneleri tespit ettikten sonra, makine kanalına en az 2 mL tampon çözeltisi enjekte edin ve ardından algılama arayüzünde görüntülenen partikül sayısı beşten az olana kadar en az 5 mL damıtılmış su enjekte edin.
    11. Kanaldaki suyu çıkarmak için sabit bir hızda (önerilen hız 1 mL / s'dir) en az 10 mL hava enjekte etmek için steril bir 5 mL şırınga kullanın.
  2. TEM analizi yapın.
    NOT: Yeni EV süspansiyonlarıyla aşağıdaki adımları uygulayın. Formvar-karbon kaplı elektron mikroskobu ızgarasının iki tarafı vardır, çalışma tarafı merkez ızgaralarda aydınlıktır. Aşağıdaki prosedür için EV'leri çıkarmak için minimum plazma hacmi 50 μL'dir.
    1. EV numunesini (adım 2.4) eşit hacimde% 4 paraformaldehit (PFA) ile karıştırın. EV'lerin 4 μL'sini bir ızgaraya koyun ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Bir polietilen film tabakasına dört damla PBS (bir damla 50 μL'ye eşittir) koyun (bkz. Izgaraları temiz mikroskobik cımbızla aktarın ve ızgaranın çalışma tarafını PBS'de bir damladan diğerine yıkayın.
    3. Izgaralarda kalan fazladan PBS'yi kaldırmak için filtre kağıtları kullanın.
    4. Izgaranın çalışma tarafını 2 dakika boyunca% 1 fosfotungstik aside ( Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin ve ardından adım 3.2.2'yi tekrarlayın.
      DİKKAT: Fosfotungstik asit zehirli olduğundan, bu prosedürün duman davlumbazında çalıştırılması gerekir ve gereksiz fosfotungstik asidin doğrudan atılmak yerine özel olarak geri dönüştürülmesi gerekir.
    5. Izgaraları yüzü yukarı bakacak şekilde filtre kağıtlarıyla kaplı 10 cm'lik bir kaba koyun. Şebekeler RT'de birkaç yıl saklanabilir.
    6. Üreticinin talimatlarını izleyerek elektron mikroskobu altında ızgaraları gözlemleyin (bkz.
      NOT: Tek parçacıkların gözlemlenmesini sağlamak için, EV'lerin konsantrasyonu ayarlanmalı ve süspansiyonun belirgin bulanıklık olmadan net olması gerekir. Düşürmeden önce, numune iyice karıştırılmalıdır. Temsili TEM ve NTA analizleri Şekil 2'de gösterilmiştir.

4. EV'lerin menşe analizi

NOT: EV'lerin hücresel kökeninin tanımlanması, tipik hücre zarı belirteçleri için antikorların uygulanmasını gerektirir. Aşağıdaki prosedür için EV'leri çıkarmak için minimum plazma hacmi 300 μL'dir. EV'lerin lipit çift katmanlı yapılarına dayanarak, bunları işaretlemek için membran boyası kullanılabilir. Kan plazması örnekleri için, lenfositler14 için CD18 temsil için seçilir. Maksiller kemik örnekleri için, osteoklastlar15 için osteoklastla ilişkili reseptör (OSCAR) örnek olarak seçilmiştir. FC'den önce, akış sitometresinin EVs16'nın ölçümüne uyarlandığından emin olun, çünkü alt boyut sınırı farklı akış sitometreleri arasında büyük ölçüde farklıdır.

  1. Numuneleri 500 μL PBS ile yeniden askıya alın (adım 2.4) ve 50 μL'yi boş bir kontrol (tüp A) olarak yeni ve temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne ve başka bir 50 μL'yi FITC için basit bir boyama tüpü olarak yeni ve temiz bir 1,5 mL santrifüj tüpüne (tüp B) aktarın. Membran boyama için birincil tüpe 0,5 μL membran boyası ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Birincil tüpü 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve topakları 200 μL PBS ile yeniden askıya alın.
  3. Her 50 μL numuneyi, PE (tüp C), yüzey işaretleyici boyama (tüp D) ve yalnızca ikincil antikor kontrolleri (tüp E) için basit boyama tüpleri için dört adet 1,5 mL santrifüj tüpüne bölün.
  4. Kemik EV örneklerinde OSCAR'ın birincil antikorunu ve plazma EV örneklerinde CD18 antikorunu (bakınız Malzeme Tablosu) tüp B'ye (adım 4.1) ve tüp D'ye (adım 4.3) ayrı ayrı (1:100'de seyreltilmiş) ekleyin. 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  5. Tüpleri 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın, topakları 500 μL PBS ile yeniden askıya alın ve daha sonra ekstra birincil antikorları çıkarmak için 16.800 x g'de (4 ° C) 30 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.
  6. Süpernatantı atın ve peletleri 50 μL PBS ile yeniden askıya alın, ardından sırasıyla FITC-konjuge ikincil antikorlar ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) (1:200'de seyreltilmiş) (tüp E). Aynı ikincil antikorları tüp B'ye (adım 4.1) ve tüp D'ye (adım 4.3) ekleyin. Tüm tüpleri karanlıkta 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: Doğrudan floresan konjuge etiketleme antikorları, FC tespitini uygun izotip kontrolleri ile işlemek için de kullanılabilir.
  7. Sırasıyla 0,2, 0,5 ve 1 μm boyutunda boncuk süspansiyonunun bir damlasını ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL PBS'ye seyreltin ve EV'ler için seçilen kapıdan emin olmak için önce her boyuttaki boncukları çalıştırın. Uygun bir ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) kullanarak boncukları ve EV popülasyonunu aramak için akış sitometresinin eşiğini ayarlayın.
    1. Terminal koşulunu 100.000 membran boyalı parçacık hesaplamak olarak ayarlayın. Numuneyi, üreticinin talimatları altında bir akış sitometresi ile analiz edin (bkz. Temsili sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir.
      NOT: Floresan kanallı NTA ekipmanı da menşe analizi için kullanılabilir ve numune hazırlama işlemi FC ile aynıdır.

5. EV'lerin protein içeriği analizi

NOT: EV'ler içindeki protein içeriğinin analizi, batı lekesi yoluyla gerçekleştirilir. Örneğin, plazma ve kemik EV'leri, metabolik durum için 6-fosfoglukonat dehidrogenaz (PGD) ve piruvat kinaz M2'yi (PKM2) analiz etmek için seçildi. Golgin84 (Golgi organeli) negatif kontrol olarak kullanıldı ve Flotillin (membran proteini), Caveolin (caveolae'nin integral proteini) ve β-aktin (hücre iskeleti)17 , hücre örneklerine kıyasla EV'lerde pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Mitofilin ve α-Actinin-4 büyük EV belirteçleri olarak seçilirken, CD9 ve CD81, EV alt popülasyonlarını göstermek için küçük EV belirteçleri olarak seçildi18. Apoa1, plazma lipoppartikül belirteci19 olarak seçildi. İlgili reaktif detayları için Malzeme Tablosu'na bakınız.

  1. Peletleri (adım 2.4) 50 μL RIPA lizis tamponunda tekrar askıya alın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
  2. 96 delikli mikroplakadaki tüm numunelerin protein konsantrasyonlarını, üreticinin talimatlarını izleyerek BCA protein testi ile ölçün (bkz.
    1. 2 mg/mL sığır serum albüminini (BSA) %0,9 normal salin (NS) ile (%0,9 (w/v) sodyum klorür içeren) 0,5 mg/mL'ye seyreltin. 0.5 mg / mL BSA ve% 0.9 NS'yi, Tablo 1'de gösterildiği gibi, belirli hacimlere sahip üç çoğaltılmış kuyucuğa ekleyin.
    2. Numunelerin 2 μL'sini bırakın (adım 5.1) ve ayrı ayrı çoğaltılmış üç kuyucuğa 18 μL NS ekleyin.
    3. BCA Reaktif A'yı Reaktif B (50:1 Reaktif A:B) ile karıştırarak bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Her bir oyuğa 200 μL çalışma çözeltisi ekleyin ve 30 s boyunca hafifçe çalkalayın.
    4. 96 delikli mikroplakayı 37 ° C'de 20-25 dakika inkübe edin.
    5. OD'yi spektrofotometre ile 596 nm'de ölçün (bkz.
    6. Verileri dışa aktarın.
    7. Standart bir eğri çizin ve numunelerin protein konsantrasyonunu hesaplayın.
  3. Sonuçlara göre, numuneleri %0,9 NS ve 5x SDS-PAGE yükleme tamponu (250 mM Tris· HCl, pH 6.8, %10 SDS, %30 (v/v) Gliserol, 10 mM DTT, %0.05 (w/v) Bromofenol mavisi, bakınız Malzeme Tablosu). Tüpleri filmle sıkıca kapatın ve 100 ° C'de 5 dakika ısıtın.
  4. Numuneleri ve protein merdivenini% 4 -% 20 Hepes-Tris jelinin gradyan konsantrasyonuna yükleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
    NOT: İlgili proteinlerin moleküler ağırlığına göre jel yüzdesini seçin.
  5. Jeli, proteinler bir çizgi oluşturana kadar 80 V'ta çalışan tamponda çalıştırın ve ardından yükleme boyası jelin dibinde olana kadar 1 saat boyunca 120 V'a geçin.
    NOT: Çalışma süresi, kullanılan ekipmana veya jelin türüne ve konsantrasyonuna göre değişebilir.
  6. Jeli, 20 s boyunca metil alkolde önceden inkübe edilmiş poliviniliden florür (PVDF) membranına (bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) aktarın. 200 mA'da 1 saat boyunca aktarmak için ıslak bir transfer sistemi kullanın.
    DİKKAT: Transfer sisteminin içinde kabarcık olmadığından emin olun ve PVDF membranını ıslak tutun.
    NOT: Transfer süresi, hedef proteinin moleküler ağırlığına göre değişebilir; 1 KD genellikle 1 dakikaya ihtiyaç duyar.
  7. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50 mL Tris tamponlu salin-Ara'ya (TBST) (2 L PBS çözeltisine 2 mL Tween eklenmiş) 2,5 g BSA ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek %5 BSA bloke edici tampon hazırlayın. Toz çözülene kadar çalkalayın. Bu tampondaki membranları RT'de 2 saat boyunca ajitasyonla bloke edin.
  8. Membranları, TBST ile seyreltilmiş spesifik primer antikorlarla uygun konsantrasyonda inkübe edin (Mitofilin, 1:1000; α-Aktin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotillin-1, 1:1000; Kaveolin-1, 1:1000; PGT, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-aktin, 1:3000) gece boyunca 4 °C'de.
  9. Membranları yıkama tamponunda (2 L PBS çözeltisine eklenen 2 mL Ara) dört kez (her seferinde 15 dakika) yıkayın ve membranları uygun ikincil antikorlarla 1:4000'de RT'de 1 saat boyunca çalkalama ile inkübe edin.
  10. Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkayın (her seferinde 15 dakika) ve Kemilüminesans Kiti ve bir jel görüntüleme sistemi kullanarak membranları görüntüleyin (bkz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel iş akışına göre, EV'ler periferik kan ve katı dokulardan çıkarılabilir (Şekil 1). 8 haftalık bir farenin maksiller kemiği yaklaşık 0.1 ± 0.05 g'dır ve fareden yaklaşık 300 μL plazma toplanabilir. Protokol adımlarını takiben, sırasıyla 0.3 mg ve 3 μg EV toplanabilir. TEM ve NTA ile analiz edildiği gibi, EV'lerin tipik morfolojik özellikleri, çapı 50-300 nm arasında değişen yuvarlak fincan şeklindeki membran vezikülleridir (Şekil 2). FC, membran boyası et...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV'lerin özelliklerini, kaderini ve işlevini incelerken, EV'leri yüksek verim ve düşük kontaminasyonla izole etmek çok önemlidir. EV'leri çıkarmak için yoğunluk gradyanı santrifüjleme (DGC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve immünoyakalama testleri 4,20 gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Burada en sık kullanılan yöntemlerden biri olan diferansiyel santrifüjleme kullanılmıştır; Bunun avantajları, zaman alıcı olmaması, sınırlı numunelerden kolay izolasyon ile yü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81870796, 82170988 ve 81930025) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi'nin (AMFU) yardımı için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 4 paraformaldehit Biosharp143174Transmisyon elektron mikroskobu
Alexa fluor 488 anti-keçi ikincil antikoruYeason34306ES60Akış sitometrisi
Alexa fluor 488 anti-tavşan ikincil antikoruInvitrogenA11008Akış sitometrisi
Anti-CD18 antikoruAbcamab131044Akış sitometrisi
Anti-CD81 antikoruAbcamab109201Batı lekesi
anti-CD9 antikoruHuabioET1601-9Batı lekesi
Anti-Mitofilin antikoruAbcamab110329Batı lekesi
APOA1 Tavşan pAbAbklonuA14211Batı lekesi
BCA protein tahlil kitiTIANGENPA115Batı
lekesi BLUeye Önceden Boyanmış Protein MerdiveniSigma-Aldrich94964-500ULBatı lekesi
Sığır serumu albüminiMP Biyomedikal218072801Batı lekesi
Caveolin-1 antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-53564Batı lekesi
CellMask Turuncu plazma zarı lekesiInvitrogenC10045Akış sitometrisi
KemilüminesansAmersham BiosciencesN/AWestern blot
Kavisli ameliyat makasıJZ Cerrahi AletJ21040EV izolasyonu
Elektronik dengeZhi KeZK-DSTEV izolasyonu
Epoch spektrofotometreBioTekN/AWestern blot
Eppendorf tüpleriEppendorf3810XEV izolasyonu
Flotillin-1 antikoruPTM BIOPTM-5369Batı lekesi
Jel görüntüleme sistemiTanon4600Western blot
Golgin84Novusnbp1-83352Western blot
Izgaraları - Formvar / Karbon Kaplı - Bakır 200 meshPolysciences24915Transmisyon elektron mikroskobu
HeparinÇözeltisi StemCell 7980EV izolasyonu
Liberaz Araştırma SınıfıSigma-Aldrich5401127001EV izolasyonu
Mikroskobik cımbızJZ Cerrahi AletJD1020EV izolasyonu
NovoCyte akış sitometresiACEAN/AAkış sitometrisi
Omni-PAGE Hepes-Tris Jeller Hepes %4~20, 10 kuyuEpizymeLK206Batı lekesi
OSCAR ( D-19) antikoruSanta Cruz BiyoteknolojiSC-34235Akış sitometrisi
PBS (2x)ZHHCPW013Western blot
Pentobarbital sodyumSigma-Aldrich57-33-0Anestezitizasyon
Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Fare IgG (H + L)Jacson115-035-003Batı lekesi
Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)Jacson111-035-003Batı lekesi
Fosfotungstik asitRHAWN12501-23-4Transmisyon elektron mikroskobu
PKM2 (d78a4) xp tavşan ve nbsp; mab ve nbsp;Hücre Sinyalizasyonu4053tWestern blot
Polietilen (PE) filmXiang yi200150055Transmisyon elektron mikroskobu
Poliviniliden florür membranları ve nbsp;Roche3010040001Western blot
Proteaz inhibitörleriRoche4693132001Western blot
Rekombinant anti-PGD antikoruAbcamab129199Western blot
RIPA lizis tamponuBeyotimeP0013Western blot
SDS-PAGE yükleme tamponu (5x)CwbioCW0027SWestern blot
Boyut boncuklarInvitrogenF13839Akış sitometrisi
Masaüstü Yüksek Hızlı Mikro SantrifüjlerHitachiCT15EEV izolasyonu
Transmisyon elektron mikroskobuHITACHIH-7650Transmisyon elektron mikroskobu
Tween-20MP Biyomedikal19472Western blot
Vorteks Karıştırıcı GenieScientific IndustriesSI0425EV izolasyonu
ZetaView BASIC NTA - Nanopartikül İzleme Video Mikroskobu PMX-120Parçacık MetrixN/ANanopartikül izleme analizi
&alfa;-Aktinin-4 Tavşan mAbklonuA3379Western blot
β-aktinCwbioCW0096MWestern blot

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63(2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043(2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820(2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556(2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59(2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685(2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526(2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677(2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582(2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238(2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478(2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EV zolasyonuDiferansiyel Santrif jlemePlazma EV leriDoku EV leriY zey Antijen ProfillemeAk SitometrisiProtein Kargo AnaliziWestern BlotNanopartik l zleme

İlgili makaleler