Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Dolaşımdaki ve dokuda yerleşik hücre dışı veziküller (EV'ler) yeni teranostik biyobelirteçler olarak umut verici hedefleri temsil eder ve organizma homeostazının korunmasında ve geniş bir hastalık spektrumunun ilerlemesinde önemli oyuncular olarak ortaya çıkarlar. Mevcut araştırma, endozomal kökenli endojen eksozomların karakterizasyonuna odaklanırken, plazma zarından dökülen mikro-parçacıklar, ana hücrelerin zar imzasını özetleyen yüzey moleküllerinin bolluğu ile öne çıkan sağlık ve hastalıkta artan bir dikkat kazanmıştır. Burada, EV'leri plazmadan ve kemik gibi katı dokulardan çıkarmak ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan tekrarlanabilir bir prosedür sunulmaktadır. Protokol ayrıca, yüzey antijenlerinin ve EV'lerin protein yüklerinin daha sonraki profillemelerini açıklamaktadır, bu nedenle türevleri için izlenebilir ve potansiyel fonksiyonla ilgili bileşenlerle tanımlanmıştır. Bu yöntem, biyolojik, fizyolojik ve patolojik çalışmalarda EV'lerin korelasyonlu, fonksiyonel ve mekanik analizi için yararlı olacaktır.
Giriş
Hücre dışı veziküllerin (EV'ler), çeşitli fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli rol oynayan hücre dışı yapılarıtanımlamak için hücre dışı veziküller (EV'ler) önerilmiştir2. Sağlıklı hücreler tarafından salınan EV'ler genel olarak iki ana kategoriye ayrılabilir: hücre içi endositik trafik yolu3 yoluyla oluşan eksozomlar (veya küçük EV'ler) ve hücre4'ün plazma zarının dışa doğru tomurcuklanmasıyla gelişen mikro-parçacıklar (veya büyük EV'ler). Birçok çalışma, in vitro5 kültürlü hücrelerden toplanan EV'lerin işlevine odaklanırken, dolaşımdan....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan deneyleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Kılavuzları ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 8 haftalık C57Bl / 6 fareleri (dişi veya erkek tercihi olmadan) kullanılmıştır. Plazma ve doku EV'lerinin izole edilmesinde yer alan adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Plazma, vücut sıvılarından EV izolasyon prosedürünü tanımlamak için bir temsilci olarak alınır. Maksiller kemik, katı dokulardan EV izolasyon prosedürünü açıklamak için bir temsilci olarak alınır.
1. Plazma ve maksiller kemik örneklerinin hazırlanması<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Deneysel iş akışına göre, EV'ler periferik kan ve katı dokulardan çıkarılabilir (Şekil 1). 8 haftalık bir farenin maksiller kemiği yaklaşık 0.1 ± 0.05 g'dır ve fareden yaklaşık 300 μL plazma toplanabilir. Protokol adımlarını takiben, sırasıyla 0.3 mg ve 3 μg EV toplanabilir. TEM ve NTA ile analiz edildiği gibi, EV'lerin tipik morfolojik özellikleri, çapı 50-300 nm arasında değişen yuvarlak fincan şeklindeki membran vezikülleridir (Şekil 2). FC, membran boyası et.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
EV'lerin özelliklerini, kaderini ve işlevini incelerken, EV'leri yüksek verim ve düşük kontaminasyonla izole etmek çok önemlidir. EV'leri çıkarmak için yoğunluk gradyanı santrifüjleme (DGC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve immünoyakalama testleri 4,20 gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Burada en sık kullanılan yöntemlerden biri olan diferansiyel santrifüjleme kullanılmıştır; Bunun avantajları, zaman alıcı olmaması, sınırlı numunelerden kolay izolasyon ile yü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81870796, 82170988 ve 81930025) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi'nin (AMFU) yardımı için minnettarız.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 4 paraformaldehit | Biosharp | 143174 | Transmisyon elektron mikroskobu |
| Alexa fluor 488 anti-keçi ikincil antikoru | Yeason | 34306ES60 | Akış sitometrisi |
| Alexa fluor 488 anti-tavşan ikincil antikoru | Invitrogen | A11008 | Akış sitometrisi |
| Anti-CD18 antikoru | Abcam | ab131044 | Akış sitometrisi |
| Anti-CD81 antikoru | Abcam | ab109201 | Batı lekesi |
| anti-CD9 antikoru | Huabio | ET1601-9 | Batı lekesi |
| Anti-Mitofilin antikoru | Abcam | ab110329 | Batı lekesi |
| APOA1 Tavşan pAb | Abklonu | A14211 | Batı lekesi |
| BCA protein tahlil kiti | TIANGEN | PA115 | Batı |
| lekesi BLUeye Önceden Boyanmış Protein Merdiveni | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Batı lekesi |
| Sığır serumu albümini | MP Biyomedikal | 218072801 | Batı lekesi |
| Caveolin-1 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-53564 | Batı lekesi |
| CellMask Turuncu plazma zarı lekesi | Invitrogen | C10045 | Akış sitometrisi |
| Kemilüminesans | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Kavisli ameliyat makası | JZ Cerrahi Alet | J21040 | EV izolasyonu |
| Elektronik denge | Zhi Ke | ZK-DST | EV izolasyonu |
| Epoch spektrofotometre | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tüpleri | Eppendorf | 3810X | EV izolasyonu |
| Flotillin-1 antikoru | PTM BIO | PTM-5369 | Batı lekesi |
| Jel görüntüleme sistemi | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Izgaraları - Formvar / Karbon Kaplı - Bakır 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmisyon elektron mikroskobu |
| Heparin | Çözeltisi StemCell | 7980 | EV izolasyonu |
| Liberaz Araştırma Sınıfı | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV izolasyonu |
| Mikroskobik cımbız | JZ Cerrahi Alet | JD1020 | EV izolasyonu |
| NovoCyte akış sitometresi | ACEA | N/A | Akış sitometrisi |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Jeller Hepes %4~20, 10 kuyu | Epizyme | LK206 | Batı lekesi |
| OSCAR ( D-19) antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-34235 | Akış sitometrisi |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodyum | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anestezitizasyon |
| Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Fare IgG (H + L) | Jacson | 115-035-003 | Batı lekesi |
| Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) | Jacson | 111-035-003 | Batı lekesi |
| Fosfotungstik asit | RHAWN | 12501-23-4 | Transmisyon elektron mikroskobu |
| PKM2 (d78a4) xp tavşan ve nbsp; mab ve nbsp; | Hücre Sinyalizasyonu | 4053t | Western blot |
| Polietilen (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmisyon elektron mikroskobu |
| Poliviniliden florür membranları ve nbsp; | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Proteaz inhibitörleri | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Rekombinant anti-PGD antikoru | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lizis tamponu | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE yükleme tamponu (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Boyut boncuklar | Invitrogen | F13839 | Akış sitometrisi |
| Masaüstü Yüksek Hızlı Mikro Santrifüjler | Hitachi | CT15E | EV izolasyonu |
| Transmisyon elektron mikroskobu | HITACHI | H-7650 | Transmisyon elektron mikroskobu |
| Tween-20 | MP Biyomedikal | 19472 | Western blot |
| Vorteks Karıştırıcı Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV izolasyonu |
| ZetaView BASIC NTA - Nanopartikül İzleme Video Mikroskobu PMX-120 | Parçacık Metrix | N/A | Nanopartikül izleme analizi |
| &alfa;-Aktinin-4 Tavşan mAbklonu | A3379 | Western blot | |
| β-aktin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
Kaynaklar
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
