3D Hacim Görünümü Görüntüleri Kullanarak Tünelleme Nanotüplerinin Tespiti ve Niceliği

Summary

Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) öncelikle komşu hücreleri birbirine bağlayan ve hücreler arası iletişimi kolaylaştıran açık uçlu F-aktin membran nanotüpleridir. TNT'leri diğer hücre çıkıntılarından ayıran göze çarpan özellik, nanotüplerin hücreler arasında gezinen doğasıdır. Burada, TNT'leri konfokal z-yığın görüntülerinin 3B hacim görünümünü oluşturarak karakterize ediyoruz.

Abstract

Son keşifler, hücrelerin nano ölçekli, aktin-membran kanalları, yani "tünelleme nanotüpleri" (TNT'ler) yoluyla doğrudan, uzun menzilli, hücreler arası transfer gerçekleştirdiğini ortaya koymuştur. TNT'ler, 50 nm ile 1 μm arasında değişen çaplardaki komşu hücreler arasında sürekliliğe aracılık eden açık uçlu, lipid çift katmanlı kuşatılmış membran uzantıları olarak tanımlanmaktadır. TNT'ler başlangıçta nöronal hücrelerde gösterilmiştir, ancak birbirini izleyen çalışmalar, nörodejeneratif hastalıklar, viral enfeksiyonlar ve kanser gibi çeşitli hücre tiplerinde ve hastalıklarında TNT'lerin varlığını ortaya koymuştur. Birçok çalışma, komşu hücreler arasındaki yakın uçlu, elektriksel olarak bağlanmış membran nanoyapılarına TNT'ler veya TNT benzeri yapılar olarak atıfta bulunmuştur.

Ultrayapının uç noktadaki membran sürekliliği açısından aydınlatılması teknik olarak zordur. Ayrıca hücre-hücre iletişimi üzerine yapılan çalışmalar, spesifik belirteçlerin bulunmaması nedeniyle TNT'lerin konvansiyonel yöntemler kullanılarak karakterizasyonu açısından zordur. TNT'ler öncelikle F-aktin bazlı, açık uçlu membran çıkıntıları olarak tanımlanır. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, F-aktin'in her türlü çıkıntıda mevcut olmasıdır ve TNT'leri diğer çıkıntılardan ayırt etmeyi zorlaştırır. F-aktin bazlı TNT'lerin göze çarpan özelliklerinden biri, bu yapıların substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinmesidir. Bu nedenle, farklı F-aktin boyalı TNT'ler, hücreler arasında gezinmelerine bağlı olarak filopodia ve nöritler gibi diğer çıkıntılardan, kolayca ayırt edilebilir.

Son zamanlarda, oligomerik amiloid β 1-42'nin (oAβ) aktin bağımlı endositoz yoluyla içselleştirilmesinin, SH-SY5Y nöronal hücreleri arasında fosfo-PAK1 ile birlikte eksprese edilen F-aktin içeren TNT'lerin oluşumuna aracılık eden aktif p21-aktive_kinaz-1'i (PAK1) uyardığını gösterdik. Bu protokol, oAβ ile tedavi edilen nöronal hücrelerde F-aktin ve fosfo-PAK1-immünoboyalı membran çıkıntılarının yakalanan z-yığın görüntülerinden TNT'leri tanımlamak ve karakterize etmek için bir 3D hacim analizi yöntemini özetlemektedir. Ayrıca, TNT'ler, F-aktin ve β-III tübülin-immünoboyalı membran kanallarına dayanan nöritler ve nöronal çıkıntılar geliştirmekten ayırt edilir.

Introduction

Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) F-aktin bazlı, öncelikle açık uçlu membran kanallarıdır ve kargo ve organellerin hücreler arası transferinde hayati bir rol oynarlar¹. TNT'lerin benzersiz özelliği, komşu hücreleri substratla herhangi bir temas olmadan bağlamalarıdır; uzunlukları 10-300 μm'nin üzerindedir ve çapları 50 nm ila 1 μm ^2,3 arasında değişmektedir. TNT'ler geçici yapılardır ve ömürleri birkaç dakika ila birkaç saat arasında sürer. TNT'ler ilk olarak PC12 nöronal hücrelerinde^{gösterilmiştir 1}; Daha sonra, çok sayıda çalışma, in vitro ve in vivo....

Protocol

NOT: DMEM/F-12 ortamında kültürlenen SH-SY5Y hücreleri 7 gün boyunca 10 μM retinoik asit ile farklılaştırıldı ve 37 °C'de (% 5 CO_{2) 2} saat boyunca 1 μM oAβ oligomerleri ile muamele edildi. Tedaviden sonra, hücreler Karnovsky'nin fiksatif çözeltisi ile sabitlendi ve fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antikoru ve F-aktin bağlayıcı faloidin ile çift immüno-boyandı. Daha sonra, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak konfokal z-stack görüntüleri alındı. TNT'ler manuel sayımla ölçüldü ve 3D hacim görünümü görüntüleri oluşturarak ve yapıları substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinme özelliklerinden tanımlayarak diğer nöritlerden / hücre çıkıntıları....

Results

Burada, SH-SY5Y nöronal hücrelerinde oAβ kaynaklı TNT'leri, konfokal z-yığın görüntülerinden 3D hacim görünümleri oluşturarak tanımlamakta ve karakterize ediyoruz (Şekil 1). Hücreler F-aktin ve fosfo-PAK1 ile çift immün boyandı. İmmünoboyalı hücrelerin konfokal z-stack görüntüleri TNT'leri tanımlamak için analiz edildi (Şekil 2). Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 boyalı TNT yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntüleri an.......

Discussion

Son 2 yılda birçok araştırmacı TNT'lerin yapısını anlamaya ve karakterize etmeye çalışıyor¹⁸. Spesifik belirteçlerin eksikliği ilerlemeyi engeller ve TNT'leri tanımlamak, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılabilecek uygun, standartlaştırılmış bir yönteme olan talep artmaktadır. TNT'ler, iki hücre arasında gezinen F-aktin bazlı membran kanalları olarak tanımlanır. Çalışmalar, β-tübülin-pozitif, yakın uçlu, gelişmekte olan nöritlerin iki uzak hücre arasında gezindiğini ve TNT benzeri yapılara b.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellvis	D35-14-1.5-N'den	yapılmış 14 mm kuyu boyutuna sahip 35 mm'lik	çanak Boyama deneyleri için hücreleri tohumlamak için kullanılan görüntüleme kabı
A ve beta; (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Hücreleri tedavi etmek için amiloid beta oligomerleri
Alexa unu 488 Keçi Anti-tavşan IgG (H + L)	Invitrogen	A11070	Fosfo-PAK1
için ikincil antikorBiyolojik Güvenlik Kabini	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Hücre kültürü
CO2 İnkübatörü	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	Vücut sıcaklığında veya buna yakın büyüyen hücreler için
Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Süper çözünürlükte büyük numunenin üç boyutlu görüntülerini oluşturabilme
DABCO [1,4-Diazobisiklo-(2,2,2) oktan]	Merck	8034560100	Ağartma önleyici reaktif
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear boyayıcı
DMEM ortamı	Gibco	11965092	100uM A & beta'nın hazırlanması için kullanılır; (1-42)
DMEM/F12 (1:1 DMEM ve Jambon karışımı' s F12)	Gibco	12500062	SH-SY5Y DMSO
(Dimetil sülfür) için kültür ortamı Hücre kültürü sınıfı	Cryopur	CP-100	için çözme maddesi olarak kullanılan hücre kültürü sınıfı
Moleküler sınıf	Himedia	MB058	Liyofilize A ve beta için çözündürücü ajanlardan biri olarak kullanılır; (1-42)
Fetal Sığır Serumu	Gibco	16000044	Kültür ortamı için ana takviye (ABD menşeli)
Formalin Fiksatif (Nötr tamponlu %10)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Karnovsky'nin fiksatif çözeltisindeki
Gluteraldehit (Derece I, H2O'da %25)	Sigma	G5882	Karnovsky'nin fiksatif çözeltisindeki bileşen
HFIP (1,1,1,3,3,3-heksafloro-2-propanol) çözeltisi	TCI	H024	A ve beta'yı çözmek için kullanılır; (1-42) 1 mg
Görüntü İşleme / Analiz Yazılımı: FIJI (ImageJ)	Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH)	"Volume viewer" adlı eklentisini kullanarak görüntüleri işlemek / analiz etmek ve TNT'leri nöritlerden ayırt etmek için kullanılır.
Liyofilizatör	Mesih, Alfa	2.4 LDplus	0.05 mg A ve beta alikotları; (1-42) -20 & derece arasında saklanabilir; C liyofilizasyondan sonra sadece
Penisilin-Streptomisin-Neomisin Karışımı	Thermo fisher Scientific	15640055	Antibiyotik karışımı
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-aktin bağlayıcı boya
Fosfo-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Tavşan]	CST	#2601	Birincil antikor
Tubulin Beta 3'e karşı Poliklonal Antikor (TUBb3)	Bulut klonu	PAE711Hu01	Birincil antikor
Retinoik asit	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Farklılaşan reaktif
Saponin	Merck	8047-15-2	İmmün boyamada İnkübasyon tamponunda kullanılan deterjan
Su banyosu sonikatörü (Quart, Tahliye vanası Isıtıcısı)	Ultrasonik Temizleyici	3.0 L / 3.2	A ve beta'yı çözmek için kullanılan sonikatör; (1-42) stok, DMSO'dan sonra 100 & mikro'nun hazırlanması sırasında buna eklendikten sonra; M A ve beta; (1-42)
ZEN Mikroskopi yazılımı	ZEISS (Carl Zeiss)		Akıllı otomasyon ile konfokal mikroskopi görüntüleri elde etmek için görüntüleme yazılımı