Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

2.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64003

⸱

8 Haziran 2022

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

Bu makalede

Özet

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Nekrotizan enterokolit (NEC), preterm bebekleri etkileyen, intestinal inflamasyon ve nekroz ile karakterize yıkıcı bir hastalıktır. Enteroidler son zamanlarda gastrointestinal patolojileri modellemek için umut verici bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, enteroid manipülasyon için şu anda kullanılan yöntemler ya epitelin apikal yüzeyine (üç boyutlu [3D]) erişimden yoksundur ya da zaman alıcı ve kaynak yoğundur (iki boyutlu [2D] tek katmanlılar). Bu yöntemler genellikle modelin fizyolojik olarak çevrilebilir hale gelmesi için mikroenjeksiyon gibi ek adımlar gerektirir. Burada, enteroid polariteyi tersine çevirerek in vitro NEC'yi incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve ucuz bir protokol tarif ediyoruz, bu da apikal yüzeyin dışa bakmasıyla sonuçlanıyor (apikal-dışarı). Norkoksi veya hipoksik koşullar altında tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) veya lipopolisakkarite (LPS) maruziyetini takiben enteroid bariyer bütünlüğünü ve bileşke protein ekspresyonunu incelemek için bir immünofloresan boyama protokolü de sağlanmaktadır. Normoksik veya hipoksik LPS veya TNF-α maruz kalan 3D apikal-out enteroidlerin 24 saat boyunca yaşayabilirliği de değerlendirilmektedir. LPS veya TNF-α maruz kalan enteroidler, hipoksi ile kombinasyon halinde, epitel mimarisinin bozulması, aderans birleşim proteini ekspresyonunun kaybı ve hücre canlılığında bir azalma sergiledi. Bu protokol, NEC tedavileri için potansiyel epitel hedeflerini belirlemek ve terapötiklere erken bağırsak yanıtını incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve uygun maliyetli bir platform sunan yeni bir apikal-out-out-NEC-in-a-dish modelini tanımlamaktadır.

Giriş

Preterm bebeklerin %10'una varan oranda ince bağırsağın ciddi inflamatuar bir hastalığı olan nekrotizan enterokolit (NEK), genellikle yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir 1,2. Cerrahi müdahale gerektiren çok düşük doğum ağırlıklı (<1500 g) bebeklerde %50'ye yaklaşan mortalite oranları nadir değildir3. NEC'nin kesin etiyolojisi şu anda anlaşılamamış olsa da, formül besleme gibi risk faktörlerinin, hastalığın gelişiminde dysbiosis, olgunlaşmamış bir bağırsak epiteli ve işlevsiz bir bağırsak bariyeri gibi fizyolojik anomalilerle birleştiği düşünülmektedir 2,4. Önemli çabalara rağmen, son on yılda NEC'nin önlenmesi veya tedavisinde çok az ilerleme kaydedilmiştir5. NEC ve ilişkili intestinal epitel bariyer disfonksiyonunu incelemek için yeni bir in vitro yöntem, hastalığın patogenezinin anlaşılmasını ilerletmek için gereklidir, çünkü hayvan modellerinden elde edilen bulgular şimdiye kadar yatak başına kötü bir şekilde çevrilmiştir6.

NEC sırasında oyundaki mekanizmaları araştırmak için bir dizi in vitro model kullanılmıştır. İnsan bağırsak epitel hücre hattı Caco-2, NEC 7,8'in in vitro modellerinde en yaygın kullanılanlar arasındadır. Kako-2 hücreleri, ince bağırsağın fırça sınırındaki morfolojik özelliklerini taklit eder, ancak bir hücre hattı olarak, yüksek oranda çevrilebilir bir model için gerekli olan mukus üreten kadeh hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli in vivo hücre tiplerine farklılaşmaz. HT-29-MTX, insan kolon adenokarsinom hücreleri, karışık bir enterosit ve kadeh hücresi fenotipi içerir, ancak yine de bağırsak epiteli9'un kript bazlı hücre tiplerinden yoksundur. IEC-6 ve IEC-18, olgunlaşmamış ileal kript benzeri bir morfolojiye sahip transforme edilmemiş hücre çizgileridir, ancak insan dokusundan türetilmezler ve translasyonel kapasitelerini sınırlarlar. FH'lar 74-Int ve H4 bağırsak hücre hatları insan fetal dokusundan türetilir ve sıkı kavşaklar veya polarize tek katmanlı10,11 oluşturmaz ve bu nedenle NEC'ye duyarlı en prematüre bebeklerle karşılaştırıldığında bile olgunlaşmamıştır. Tipik olarak, NEC in vitro modeller, NEC12'de bağırsak iltihabını başlatan majör bir reseptör olan toll-like reseptör 4'ü (TLR4) indüklemek için lipopolisakkarit (LPS) tedavilerini kullanır. Reaktif oksijen türleri (ROS) tedavisi yoluyla, tipik olarak hidrojen peroksit yoluyla aracılık edilen hasar, genellikle NEC benzeri oksidatif hasarı ve apoptozu indüklemek için kullanılır13,14. İntestinal inflamasyonun ana itici gücü olarak, inflamatuar TLR4 sinyallemesinin bir aşağı akış bileşeni olan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), in vivo patogenezi taklit etmek için bu in vitro modellerde yaygın olarak kullanılmaktadır15.

İndüklenebilir pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) üretilen organoidler, kompleks in vivo mimarisini ve türetildikleri dokunun hücre tipi kompozisyonunu özetleme yetenekleri nedeniyle bağırsağın in vitro bir modeli olarak popülerlik kazanmıştır16,17. İlgili bir in vitro sistem olan enteroidler, iPSC türevi organoidlerden daha kolay kurulan ve bakımı yapılan rezeke edilmiş bağırsak kriptlerinden türetilen organoidlerdir. Enteroidler tipik olarak bazolateral hücre yüzeyi ile sınırlı deneysel erişime sahip üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste (ECM) yetiştirilir. Apikal yüzeye olan bu engelin üstesinden gelmek için mikroenjeksiyon18,19 gibi yöntemler geliştirilmiştir, ancak lümen içinde dökülmüş hücresel enkaz ve mukus birikmesi, mikroenjeksiyonu hem teknik olarak zor hem de tutarsız hale getirmektedir. Özel robotik mikroenjeksiyon platformlarına yaygın olarak erişilemediğinden20, teknik yetenek ve genel teknikteki laboratuvardan laboratuvara değişkenlik, mikroenjeksiyon protokolleri ile üstesinden gelinmesi gereken önemli değişkenler haline gelmektedir. Ayrışmış 3D enteroidlerden türetilen ve hala bağırsak epitelinin tüm ana hücre tiplerini içeren iki boyutlu (2D) monokatmanlar, apikal yüzeye erişime izin verir, ancak geleneksel olarak mezenkimal miyofibroblastların besleyici tabakası olmadan sürdürülmesi zor olmuştur21. Hücre kültürü geçirgen destekleri, altta yatan miyofibroblastlar kullanılmadan enteroid monokatmanların hem apikal hem de bazolateral taraflarına erişmek için kullanılabilirken, bu ekler konfokal mikroskopi gibi modalitelerle kullanılmadan önce eksizyon ve membranın monte edilmesini gerektirir, bu da geleneksel mikroskopi yöntemlerini kullanırken daha teknik olarak zorlu ve zor bir işlemle sonuçlanır22. NEC, geleneksel 3D enteroidler 23,24,25 ve geçirgen destekler 26,27 kullanılarak in vitro olarak modellenmiştir ve bağırsak iltihabı son zamanlarda çip üzerinde bağırsak modelleri28,29 ile çoğaltılmıştır. Mikroakışkanları içeren çip üzerinde bağırsak modelleri, şimdiye kadar, en gelişmiş ve çevrilebilir modeller olsa da, bu teknoloji pahalı, karmaşık ve çoğu araştırmacı için erişilemez30.

Apikal-out enteroid tekniklerindeki son gelişmeler, in vitro epitel31,32,33'ün yapısal bütünlüğüne zarar verme riski olmadan 3D enteroidlerin apikal yüzeyine daha kolay erişim sağlamıştır. Apikal-out enteroidler, in vivo bağırsak epitelinin hücre tipi kompozisyonunu ve bariyer fonksiyonunu paylaşır, ancak tipik 3D enteroidlerin aksine, bu hücrelerin apikal yüzeyleri kültür ortamına bakar ve besin emilimi, mikrobiyal enfeksiyon ve luminal sekresyon hakkında fizyolojik olarak daha ilgili çalışmalara izin verir31. Apikal-dışarı enteroidlerin ek bir avantajı, deneysel ajanları enteroidlere homojen olarak dağıtma yeteneğidir. Mikroenjeksiyonda olduğu gibi enteroid boyutuna göre değişen tedavi hacimleri gerekli değildir ve bu enteroidleri süspansiyon kültüründe tutma yeteneği, deneysel ajan difüzyonu32 üzerindeki herhangi bir ECM girişimini ortadan kaldırır.

Nekrotizan enterokolit, çoklu intestinal epitel hücre tiplerini ve çeşitli çevresel ve patofizyolojik faktörleri içeren multifaktöriyel bir hastalıktır34. Bağırsak enteroidlerinin çeşitli hücre bileşimi, NEC gibi karmaşık bir hastalığın modellenmesinde monokültürlere göre açık bir gelişmedir. İlginç bir şekilde, in vitro monokültürlerde hasarı indüklemek için tek bir enflamatuar maruziyet genellikle yeterli olsa da, enteroidler, fare modelleri23'te olduğu gibi, NEC benzeri hasarı indüklemek için en az iki enflamatuar bileşen gerektirmektedir6. Burada, hipoksi (NEC6'nın önemli bir klinik özelliği) ve LPS veya TNF-α ile kombinasyon halinde apikal-out enteroidleri kullanarak, NEC benzeri inflamasyona epitel yanıtlarını incelemek ve potansiyel olarak terapötik hedefleri tanımlamak için geliştirilmiş ve fizyolojik olarak daha alakalı bir in vitro model olarak apikal-out NEC-in-a-dish modelini sunuyoruz. İnce bağırsak 3D enteroidlerinin polaritesini tersine çevirmek için bir protokolün yanı sıra epitel bariyeri bozulmasını ve bileşke protein ekspresyon değişikliklerini tanımlamak için bir immünofloresan boyama protokolü tanımladık. Son olarak, çift vuruşlu, apikal çıkışlı NEC-in-a-dish modelimizin etkisini belirlemek için basit bir enteroid canlılık testi daha da gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ayrı bir çalışma için ötenaziyi takiben preterm insan olmayan primattan (NHP,% 90 gebelik, zeytin babunu, Papio anubis) ince bağırsak kolaylık örnekleri elde edildi (Protokol # 101523-16-039-I).

1. Apikal-out enteroid NEC-in-a-dish modelinin kurulması

  1. Medya ve enteroid tedavilerin hazırlanması
    NOT: Standart aseptik tekniğe uygun olarak hazırlandıktan sonra, ortam 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
    1. 50 mL insan organoid büyüme ortamını 50 mL organoid takviyesi ile karıştırarak antibiyotiksiz ortam (AFM) hazırlayın (bkz. 9.900 μL PBS'ye 100 μL 0,5 M EDTA ekleyerek 5 mM etilendiamintetraasetik asit/1x fosfat tamponlu salin (EDTA/PBS) hazırlayın.
    2. Chill Dulbecco'nun modifiye kartalın orta / besin jambonunun karışımı F12 + 15 mM HEPES Tamponu (DMEM / F12) 2-8 ° C'de.
    3. 1 mL 1x PBS'de 100 μg TNF-α tozunu askıya alarak TNF α stok çözeltisi hazırlayın. TNF-α stokunu çözücü olarak AFM kullanarak 20 ng / mL ve 50 ng / mL konsantrasyonlarına kadar seyreltin. 1 mL 1x PBS'de 2 mg LPS'yi askıya alarak LPS stok çözeltisi hazırlayın. Çözücü olarak AFM kullanarak stok LPS'yi 100 μg / mL ve 200 μg / mL'ye kadar seyreltin.
  2. 3D enteroidlerin polaritesini tersine çevirme
    NOT: Aşağıdaki prosedür, tek bir 24 delikli düz tabanlı doku kültürü plakasının iki adet 24 delikli ultra düşük ataşman doku kültürü plakasına çevrilmesi için tasarlanmıştır. Doku kültürü plakaları kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtılmalıdır. Bazolateral çıkışlı 3D enteroidlerin türetilmesi, daha önce birçok grup35,36 tarafından tanımlandığı gibi, ortam için hafif değişikliklerle (yukarıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır) elde edilmiştir. Genel enteroid türetme prosedürü insanlarınkinden farklı değildir. Kısacası, eksize edilen doku yıkanır, küçük parçalar halinde kesilir ve hücre bozulma tamponunda inkübe edilir. Hücre çözeltisi daha sonra 70 μM'lik bir hücre süzgecinden geçirilir ve bu da yüksek yoğunlukta kaplanmış kriptlerle sonuçlanır.
    1. Ortamları, 24 delikli bir 3D bazolateral-çıkış enteroidi plakasının her bir kuyucuğundan aspire edin.
    2. 24 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 500 μL 5 mM buz gibi soğuk EDTA/PBS ekleyin ve minimum 5x-6x p200 pipetle yukarı ve aşağı pipet yaparak bazal membran ekstraktını/ECM kubbesini nazikçe mekanik olarak bozun.
    3. Dört kuyucuğun içeriğini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve konik tüpe 8 mL buz gibi soğuk EDTA / PBS ekleyin. Kalan 20 kuyuyu da aynı şekilde aktarın.
    4. 15 mL konik tüpleri dönen bir platformda 1 saat boyunca 4 °C'de veya 330 rpm'de çalkalayıcıda inkübe edin. 1 saatlik inkübasyondan sonra, konik tüpleri 300 x g'de 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı her tüpten çıkarın ve atın.
    5. Hücre peletlerini 5 mL DMEM / F12 ile birleştirin ve yıkayın ve hücre süspansiyonunu iki 15 mL konik tüpe dağıtın.
    6. 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yaparak hücreleri pelet edin. Süpernatantı çıkarın ve her tüpe 12 mL AFM ekleyerek hücre peletlerinin yeniden askıya alınmasını sağlayın.
    7. İki adet 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna enteroid süspansiyonun 500 μL'lik pipeti.
    8. Plakaları 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 2-5 gün boyunca veya enteroidler polariteyi tersine çevirene kadar inkübe edin.
    9. Enteroid reversal'ı kontrol etmek için, önce doğrulayıcı immünofloresan boyamayı ve ortalama tersine çevirme süresini (~ 3 gün) belirleyin, ardından temel bir ışık mikroskobu görselleştirmesi kullanarak polarite tersine çevirmesini onaylayın. Apikal-out enteroidleri görünüşte çok hücreseldir, bazolateral çıkış enteroidleri ise genellikle büyük bir merkezi lümen veya tomurcuklanma varlığı ile baskındır (bakınız Ek Şekil 1).
      NOT: Prosedür standartlaştırıldıktan sonra, apikal-out'a dönüşüm oranı tipik olarak% 95'i aşıyor. Apikal-çıkış enteroidlerinin kullanımı bir terminal deneyi olarak tasarlanmıştır, ancak apikal çıkış enteroidlerini az sayıda bazolateral çıkış enteroidine geçirmek teorik olarak mümkündür.
  3. Apikal-out NEC-in-a-dish
    NOT: Enteroidler polariteyi tersine çevirdikten sonra, kültürleri sonraki deneylerde hızlı bir şekilde kullanın, çünkü apikal konformasyondaki uzun ömürleri 3-4 günden fazla doğrulanmamıştır. Aşağıdaki NEC-in-a-dish modeli için, enteroidler 24 saat boyunca tedavi edildi, daha sonra hemen sonra toplandı ve aşağı akış deneyleri için korundu.
    1. Enteroidler en az% 95 verimlilikle polariteyi görsel olarak tersine çevirdikten sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve 24 kuyucuklu bir plakanın sekiz kuyuğunu 15 mL konik bir tüpe toplayın. Apikal çıkış enteroidleri süspansiyonda olduğundan, enteroid/ortam çözeltisini pipetlemeniz yeterlidir. 15 mL tüpü 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    2. Hücreler peletlendikten sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini, 1x PBS'nin (kontrol) istenen hacmiyle (eklenen en yüksek işlem hacmine uymak için burada 10 μL) karıştırılmış 4 mL AFM'de yeniden askıya alın.
    3. Pipet, 500 μL enteroid/PBS/AFM süspansiyonunu 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasının sekiz deliğine yerleştirir ve plakayı 24 saat boyunca 37 °C'de ve %5 CO2'de inkübe eder.
    4. 1.3.1.-1.3.3 adımlarını yineleyin. normokside TNF-α (20 ng/mL ve 50 ng/mL) ve LPS (100 μg/mL ve 200 μg/mL) tedavileri için. Tüm hipoksi tedavileri için, Adım 1.3.1.-1.3.3.'ü tekrarlayın, ancak plakayı 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 ve% 1O2'de ayrı bir inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Adım 1.3.4. Adım 1.3.1.-1.3.3 ile aynı anda yapılabilir, ancak netlik için, yukarıdaki prosedür karmaşıklığı azaltmak için tedavi ile ayrılmıştır.

2. İmmünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi

  1. Boyama çözeltilerinin hazırlanması
    1. 7 μL Triton X-100'ü 1x PBS'de 7 mL'lik son hacme karıştırarak %0,1 Triton X-100 hazırlayın. 30 mL'lik son hacme 30 μL Tween-20 ila 1x PBS ekleyerek PBST'yi (PBS-Ara) hazırlayın.
    2. 6.3 mL PBST'ye 700 μL NDS ekleyerek %10 normal eşek serumu (NDS)/PBST hazırlayın. PBST'ye 7 mL'lik son hacme 70 μL NDS ekleyerek %1 NDS/PBST hazırlayın.
      NOT: Burada eşek serumu sekonder antikor konakçısı ile korelasyon için kullanıldı. Bununla birlikte, bloke edici serum türleri, spesifik olmayan bağlanmayı düzgün bir şekilde bloke etmek için ikincil antikor türleriyle eşleşmelidir.
  2. Boyama (1. Gün)
    1. 24 delikli bir plakanın dört kuyucuğunun içeriğini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İstenilen tüm kuyucuklar / tedaviler için, her tedavi ayrı bir tüpte olacak şekilde tekrarlayın. Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Enteroidler peletlendikten sonra, süpernatanı çıkarın.
    2. Hücre peletlerini oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 300 μL% 4 formaldehit fiksatif olarak yeniden askıya alın. 30 dakika sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve peleti 500 μL steril, RT 1x PBS ile yıkayın.
    3. Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve% 0.1 Triton X-100'ün 500 μL'sini ekleyin ve RT'de 1 saat bekletin.
    4. 1 saat sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 500 μL 1x PBS ile yıkayın ve tüpleri 2-8 ° C'de 15 dakika boyunca 200 rpm'de bir rotatör veya çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bunu toplam 4 kat tekrarlayın.
    5. Tüpleri 300 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 500 μL %10 NDS/PBST ekleyin ve RT'de 45 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, 24 delikli bir plakanın sekiz kuyucuğu için 20 μL rekombinant anti-villin antikoru, 10 μL E-kadherin antikoru ve 1970 μL % 1 NDS / PBST'yi birleştirerek birincil antikor çözeltileri hazırlayın.
    6. 45 dakikalık inkübasyondan sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı çıkarın ve 250 μL birincil antikor çözeltisi ile değiştirin. Tüpleri gece boyunca 2-8 ° C'de inkübe edin.
  3. Boyama (2. Gün)
    1. Tüpleri 300 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Peletin boyutuna bağlı olarak her tüpe 250-500 μL PBST ekleyin ve 2-8 ° C'de 1 saat boyunca 200 rpm'de rotatör veya çalkalayıcıya yerleştirin. PBST yıkamasını 4x tekrarlayın.
    2. % 50 gliserol için 52 μL Cy3 eşek anti-tavşan IgG (H + L) ve 5142.8 μL% 1 NDS / PBST'ye 5.2 μL eşek anti-fare floresan yeşil 488 sekonder antikor ekleyerek ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
    3. Son PBST yıkama ve santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı tüplerden çıkarın. Her tüpe 200 μL ikincil antikor çözeltisi dağıtın ve gece boyunca karanlıkta 2-8 ° C'de inkübe edin.
  4. Lekeli apikal-out enteroidlerinin montajı (Gün 1)
    1. Mavi nükleer boya içeren gliserol bazlı mountantı 1 saat boyunca RT'ye getirin.
    2. Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantın 100 μL'sini çıkarın ve kalan ~ 100 μL süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 0,5 mL tüplere aktarın.
    3. Hücreleri peletlemek için tüpleri 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 100 μL uzak kırmızı nükleik asit boyasında yeniden askıya alın. RT'deki tüpleri 10 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Hücreleri peletlemek için tüpleri 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın. İkinci bir yıkama için tekrarlayın.
    5. Tüpleri, hücreleri peletlemek ve süpernatanın 70 μL'sini çıkarmak için 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. PBS'nin kalan hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın ve içeriği etiketli bir kapak kapağına (24 mm x 60 mm) aktarın.
    6. 75 μL montaj maddesini doğrudan numunenin üzerine uygulayın ve pipet ucu olan kabarcıkları çıkarın. Kapakların karanlıkta RT'de gece boyunca (18-24 saat) iyileşmesine izin verin.
  5. Lekeli apikal-out enteroidlerinin montajı (Gün 2)
    1. Gece boyunca kürlendikten sonra, kapak kapaklarına ince bir gliserol tabakası (~ 15 μL) uygulayın. Kapak kaymasını cam kızağa monte edin ve yavaşça yerine bastırın. Kapak kapağı ile slayt arasındaki kabarcıkları kaldırmak için dokunun.
    2. Konfokal mikroskopla 20x büyütmede görüntülemeden önce, kapak kaymasının karanlıkta en az 2 saat boyunca RT'ye ayarlanmasına izin verin. Çeşitli konfokal edinim yöntemleri kullanılarak enteroidlerin mikroskobik olarak görselleştirilmesi için, Lallemant ve ark.37'ye bakınız.
  6. İmmünofloresan nicelleştirme
    NOT: Bu yöntem, ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanarak arka plan sinyalini kaldırarak düzeltilmiş toplam floresansı belirler.
    1. ImageJ'de konfokal görüntüleri açın ve ilgilenilen bölge (ROI) aracıyla istediğiniz alanı ana hatlarıyla belirtin.
    2. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya giderek kullanıcı tanımlı parametreleri ayarlayın. Ayarlar sekmesinin altında Alan > Entegre Yoğunluk > Ortalama Gri Değer'i seçin.
    3. Analiz > Ölçü'ye gidin. Ölçümleri içeren bir açılır pencere görünecektir. Bu ölçümleri kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın.
    4. Arka plan sinyalini çıkarmak için, görüntünün floresan olmayan küçük bir alanını seçin. Bu bölge için > Ölçüyü Analiz Et'e gidin. Ölçümleri içeren bir açılır pencere görünecektir. Çıktıyı kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın.
    5. Seçilen hücrenin alanını, arka plan okumalarının ortalama floresansı ile çarpın ve düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) hesaplamak için toplamı entegre yoğunluktan çıkarın. Bir elektronik tablodaki veya istatistiksel yazılım paketindeki kayıtları tutarken ilgilendiğiniz tüm resimler için yukarıdaki adımları tekrarlayın (bkz.

3. Apikal çıkış NEC-in-a-dish hücre canlılığı

  1. Enteroid tedavileri
    1. Adım 1'de olduğu gibi 24 saat boyunca apikal-out NEC-in-a-dish modelini oluşturun.
    2. Hücre canlılığı testi reaktifini 4 ° C'de gece boyunca çözün. Tahlil gününde, reaktifi kullanımdan 30 dakika önce RT'ye getirin. Karıştırmak için reaktifi ters çevirin.
    3. Testi yapmadan önce, her bir kuyucuktan 100 μL ortam çıkarın ve kalan 400 μL'yi bırakın.
    4. RT'deki bir plaka çalkalayıcıdaki içeriği, hücre lizisini indüklemek için 200 rpm'de 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın. Sallamayı takiben, plakayı RT'de 25 dakika daha inkübe edin.
    5. 25 dakikalık inkübasyondan sonra, pipetleme yoluyla bir kuyucuğun içeriğini karıştırın ve 800 μL'nin 200 μL'sini 96 delikli, opak, polistiren, şeffaf tabanlı bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Kalan 600 μL için tekrarlayın ve kuyu başına dört teknik kopya oluşturun. 24 delikli plakanın her bir kuyucuğunun kalan içeriğini bu şekilde 96 delikli bir plakaya aktarın.
    6. Lüminesans yapabilen bir plaka okuyucu kullanarak, 0,25 ms entegrasyonda değerleri kaydedin ve tedaviler arasındaki göreceli değerleri karşılaştırın. Alternatif olarak, tedavi lüminesansını adenozin trifosfat (ATP) standardıyla karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Nekrotizan enterokolit bağlamında bile, bağırsak iltihabını modellemek için enteroidlerin kullanımı artık yaygındır. Bununla birlikte, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, enteroidlerin apikal yüzeyine erişimden yoksundur, oral terapötikler olarak nihai kullanım için amaçlanan bileşiklerin fizyolojik alaka düzeyini reddeder veya enteroid türevi tek katmanlarda olduğu gibi teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. NEC'nin akım in vitro enteroid modellerinin faydasını arttırmak için, enteroidlerin polaritesini tersine ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İntestinal epitel kriptlerinden türetilen enteroid modellerin son zamanlarda geliştirilmesi, nekrotizan enterokolit patogenezinin inceleneceği fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro dokuya izin vermektedir. Bağırsak epitelinin tüm majör farklılaşmış hücre tiplerini içermesine rağmen, 3D enteroidler hala birkaç önemli sınırlamaya tabidir. Konvansiyonel, bazolateral çıkışlı enteroidler, bileşimi ve yoğunluğu doku kültürü ortamında normal difüzyonu sınırlayabilen 3D ECM hidrojel kubbelerinde askıya alınır

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur ve çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. HC, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden P20GM134973 hibesi ile desteklenmektedir. KB, Çocuk Hastanesi Vakfı (CHF) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı (PHF) hibesi ile desteklenmektedir. OUHSC'deki Moleküler Biyoloji ve Sitometri Araştırmaları Laboratuvarı'na, konfokal görüntüleme sağlayan Çekirdek Tesis'in kullanımı için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 M EDTA, pH 8,0Fisher Scientific15575-020
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriFisher Scientific05-408-129
15 mL Konik tüpVWR89039-666
CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılığı TestiPromegaG9681
Corning Costar Ultra Düşük Eklenti 24 Kuyulu MikroplakalarFisher Scientific07-200-602
Kapak Camı 24 mm x 60 mmThermo Scientific102460
Eşek Anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo ScientificA-21202
Eşek Anti-Tavşan IgG Antikoru, Cy3 konjugeSigma-AldrichAP182C
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium/Nutrient Jambon Karışımı F-12 (DMEM-F12) 15 mM HEPES tamponu ileKÖK HÜCRE Teknolojileri36254
E-kaderin antikoru (7H12)Novus BiologicalsNBP2-19051
Formaldehit çözeltisi %4, tamponlu, pH 6.9Milipore Sigma1004960700
GliserolSigma-Aldrich56-81-5
ImageJFijiN/A
IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)STEMCELL Teknolojileri06010
Leica SP8 Konfokal MikroskopLeica Biosystems
Lipopolisakkaritler Escherichia coli O111: B4, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırıldıMillipore SigmaL3012-10MG
Mikroskop SlaytlarıFisher Scientific12-544-7
Normal Eşek SerumuSigma-Aldrich566460
Nunc MicroWell 96-Kuyulu, Nunclon Delta ile İşlenmiş, Düz Tabanlı MikroplakaThermo Scientific136101
PBS (Fosfat Tamponlu Salin), 1x [-] kalsiyum, magnezyum, pH 7.4Corning21-040-CM
Fisher ScientificP36983ile Uzun Cam Antifade Mountant
Rekombinant Anti-Villin antikoru [SP145]Abcamab130751
Rekombinant İnsan TNF-&alfa; protein 100 & mikro; gBio-Techne210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Çok Modlu MikroplakaOkuyucu Moleküler Cihazlar
Thermo Forma Serisi II Su Ceketli Tri-Gaz İnkübatör, 184LFisher Scientific3140
TO-PRO-3 İyodür (642/661)Thermo ScientificT3605
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Tüpler, 0,5 mL, düz kapaklıThermo ScientificAB0350
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5
NucBlue

Kaynaklar

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), Baltimore, Md. 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890(2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359(2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15(2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265(2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750(2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475(2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8(2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483(2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141(2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325(2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372(2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372(2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Apikal D EnteroidlerEnteroid Polarite TersinmesiBa rsak nflamasyonuIn Vitro ModelBariyer B t nlmm nofloresan BoyamaH cre Canl l AnaliziHipoksi UygulamasKonfokal Mikroskopi
İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.