Method Article

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Olgun osteoklastlar, asit ve enzimlerin salgılanması yoluyla kemiği parçalayabilen çok çekirdekli hücrelerdir. Çeşitli hastalıklarda (örneğin, osteoporoz ve kemik kanseri) çok önemli bir rol oynarlar ve bu nedenle önemli araştırma nesneleridirler. In vitro, aktiviteleri rezorpsiyon çukurlarının oluşumu ile analiz edilebilir. Bu protokolde, kolayca görselleştirilebilen ve nicelleştirilebilen kalsiyum fosfat (CaP) kaplı hücre kültürü plakalarını kullanan basit bir çukur testi yöntemi tanımlamaktayız. İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) türetilen osteoklast öncülleri, osteoklastojenik uyaranların varlığında kaplanmış plakalar üzerinde kültüre alındı. 9 günlük inkübasyondan sonra, osteoklastlar floresan görüntüleme için sabitlendi ve boyanırken, CaP kaplaması kalsein ile karşı boyandı. Emilen alanı ölçmek için, plakalar üzerindeki CaP kaplama% 5AgNO3 ile boyandı ve parlak alan görüntüleme ile görselleştirildi. Rezorpsiyon çukuru alanı ImageJ kullanılarak ölçüldü.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoklastlar (OC'ler), hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) türetilen ve osteoblastlarla birlikte kemik yeniden şekillenmesinde önemli bir rol oynayan dokuya özgü makrofajlardır1. Kemiği sistemik veya lokal olarak tahrip eden cinsiyet hormonuna bağlı, immünolojik ve malign kemik bozuklukları, menopoza bağlı osteoporoz2, romatoid artrit3, periodontal hastalık4, miyelom kemik hastalığı5 ve osteolitik kemik metastazı6 dahil olmak üzere aşırı osteoklastik aktiviteye bağlıdır. Buna karşılık, OC oluşumu ve fonksiyonundaki kusurla....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol yerel etik kurul tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (onay numarası 287/2020B02).

1. Kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakalarının hazırlanması

  1. Kalsiyum stok çözeltisinin hazırlanması (Tris tamponunda 25 mM CaCl 2·2H 2 O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O)
    1. 1,0 M Tris tamponu hazırlayın ve 1 M HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın.
    2. Manyetik karıştırıcı üzerine bir cam kab yerleştirin ve 100 mL 1,0 M Tris tamponu ekleyin.
    3. 0.368 g CaCl 2 ·2H 2 O, 8.0 g NaCl ve 0.305 g MgCl2 · 6H2O ağırlığında ol....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre kültürü plakalarının altındaki kalsiyum fosfat kaplama, 3 günlük ön kalsifikasyon ve 1 günlük kalsifikasyon adımından oluşan iki kaplama adımında gerçekleştirildi. Şekil 1'de gösterildiği gibi, 96 kuyucuklu plakaların dibinde eşit olarak dağılmış kalsiyum fosfat elde edilmiştir. Yapılan yıkama adımlarından sonra kaplama tabana çok iyi yapışmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, PBMC'lerden in vitro olarak türetilen ve genişletilen OC'leri kullanarak osteoklastik rezorpsiyon testi için basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Kullanılan CaP kaplamalı hücre kültürü plakaları, laboratuvarda bulunan malzemeler kullanılarak kolayca hazırlanabilir ve görselleştirilebilir. Bu protokolde benimsenen sıralanmamış PBMC'lere ek olarak, murin monositik hücreler21 ve kemik iliği makrofaj hücreleri17'den üretilen OC'ler de çukur testi için.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Çin Burs Konseyi [CSC No. 201808440394] tarafından finanse edilmiştir. W.C. CSC tarafından finanse edildi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110Gümüş nitrat
a-MEMGibco32561-029MEM alfa, GlutaMAX, nükleosit yok
amfoterisin BBiochrom03-028-1BAmfoterisin B Çözeltisi
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50GKalsiyum klorür Dihidrat
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524fetal sığır serumu
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
Fiksasyon tamponuBiolegend420801Paraformaldehit
HClMerk1.09057.1000Hidroklorik asit
Hoechst 33342PromotinPK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25Rekombinant İnsan M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6Magnezyum klorür
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- Sodyum hidrojen fosfat susuz
NaClMerkS7653-250GSodyum klorür
NaHCO3MerkK15322429Bikarbonat Soda
PBSLonza17-512FDulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (1X), Kalsiyum ve Magnezyum İçermeyen DBPS
Kalem-StrepLonzaDE17-602EPenisilin-Streptomisin Karışımı
Phalloidin-Alexa Fluor 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01Rekombinant İnsan sRANK Ligandı (E.coli türevi)
TrisSigma-Aldrich93362Tris (hidroksimetil) aminometan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Alkil Fenil Polietilen
Glikol TripLE ExpressGibco12605010Rekombinant hücre ayrışma enzimleri

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

Related Articles