Method Article

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

DOI:

10.3791/64023

⸱

November 18th, 2022

1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görsel biyokimya, toplu faz çalışmalarında gerçekleşen ortalamada gizlenen tek enzimlerin veya enzim komplekslerinin stokastik özelliklerini gözlemlemek için güçlü bir tekniktir. Görselleştirmeyi başarmak için, bir tuzağın sabit, diğerinin hareketli olduğu çift optik cımbız, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirilmiş çok akışlı bir mikroakışkan odanın bir kanalına odaklanır. Optik cımbızlar, floresan olarak etiketlenmiş DNA'nın tek moleküllerini yakalar ve odadan ve sıkışmış boncuklardan geçen sıvı akışı, DNA'yı B formuna (minimum kuvvet altında, yani 0 pN) uzatır ve nükleik asit siyah bir arka plana karşı beyaz bir ip olarak gözlenir. DNA molekülleri, reaksiyonların kontrollü bir şekilde başlatılmasını sağlamak için aşamayı akışa dik olarak çevirerek bir akıştan diğerine taşınır. Başarıya ulaşmak için, optik olarak berrak kanallara sahip mikroakışkan cihazlar, bir şırınga pompasında yerinde tutulan cam şırıngalarla eşleştirilir. Optimum sonuçlar, akış hücresine kalıcı olarak bağlanmış konektörler, mekanik olarak sert ve kimyasal olarak dayanıklı olan ve laminer akışı yasaklayan kabarcıkları ortadan kaldıran anahtarlama valflerine bağlı borular kullanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-DNA etkileşimlerini tek molekül düzeyinde ve gerçek zamanlı olarak görselleştirme yeteneği, genom stabilitesi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır 1,2. DNA'nın tek molekülleriyle birer birer çalışmaya ek olarak, yakındaki tek tek moleküller arasındaki işlemleri görüntüleme yeteneği ek içgörü sağlar 3,4,5. Ek DNA moleküllerinin manipülasyonu hem ek optik tuzaklar hem de yüksek kaliteli, çok kanallı, mikroakışkan akış hücreleri gerektirir6.

Birden fazla optik tuzak oluşturmak için kullanılabilecek birkaç yöntem vardır. Bunlar arasında galvanometre tarama aynaları, akustik optik modülatörler ve holografik optik cımbız 4,7,8,9 üreten kırınımsal optikler bulunur. Çoğu zaman, tarama aynaları ve akustik optik modülatörler devre mülk tuzakları üretir. Burada açıklanan kurulumda, tek bir Nd: YAG lazerin ışını polarizasyon üzerine bölünür ve daha sonra galvanometre lazer tarama aynaları mobil tuzak olarak adlandırılan şeyin konumunu kontrol eder (Şekil 1)4. Tuzak ışını mikroskop hedefinin arka açıklığına yönlendirmek için aynaların ve filtrelerin konumlandırılmasını kolaylaştırmak için bir HeNe lazer kullanılır. Bu, HeNe ışını çıplak gözle görülebildiği için genel hizalamayı kolaylaştırırken, kızılötesi ışınlar görünmez. HeNe ışını, aynaların ve diğer bileşenlerin konumlandırılmasını daha az stresli hale getirmek için çalışmak için daha güvenlidir. Başlangıçta, bu lazerin ışın yolu 1064 nm ışından ayrıdır, ancak aynı ışın yoluna ve daha sonra mikroskop hedefine sokulur. Fiziksel hizalama sağlandıktan sonra, 1064 nm ışının HeNe ışınının üzerine konumlandırılması yapılır ve bu, ışın konumunu ve kalitesini görselleştirmek için bir kızılötesi görüntüleyici ve çeşitli ışın görüntüleme araçlarının kullanılmasıyla kolaylaştırılır. Daha sonra, ışın genişletici tanıtılır ve elde edilen genişletilmiş kızılötesi ışın, hedefin arka açıklığına hizalanır. Son olarak, hedef kaldırılır ve her polarize ışındaki güç ölçülür ve λ/2 dalga plakaları kullanılarak eşit olacak şekilde ayarlanır (Şekil 1C). Güç ölçümleri, hedefe geri dönüldüğünde de yapılır ve tipik olarak% 53'lük bir güç kaybı olur. Bununla birlikte, odak düzleminde kararlı sabit ve hareketli optik tuzaklar oluşturmak için yeterli güç vardır (Şekil 1D).

DNA işlemlerini görüntülemek için, mikroakışkan akış hücreleri, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip tek molekül düzeyinde kontrollü ölçümlere izin verdikleri için önemli bir rol oynamaktadır (Şekil 2). Mikroakışkan terimi, 5-500 μm10,11 arasında değişen boyutlarda bir veya daha fazla kanaldaki sıvıları manipüle etme yeteneğini ifade eder. Akış terimi, bir kanal içindeki gerçek sıvıyı ifade eder ve kanal, bir akışkan akışının veya akışlarının hareket ettiği fiziksel kanalı ifade eder. Tek kanallı akış hücresi tasarımı, reaksiyonların gözlemlendiği ve tipik olarak sadece bir sıvı akışının mevcut olduğu ortak, fiziksel bir kanala sahiptir. Bu nedenle, bu tasarımlar tek akışlı akış hücreleri olarak bilinir. Buna karşılık, çok akışlı akış hücreleri, iki veya daha fazla giriş kanalının tek, ortak, fiziksel bir kanalda birleştiği mikroakışkan bir cihaz olarak tanımlanır (Şekil 2A). Ortak kanal içinde, bireysel kanallardan kaynaklanan sıvı akışları birbirine paralel olarak akar ve difüzyon nedeniyle aralarında sadece minimum karışım meydana gelerek ayrı kalır (Şekil 2B). Deney kurulumlarının çoğunda, tek bir pompa sıvıları her kanala aynı hızda iter. Buna karşılık, sınır yönlendirmesi kullanıldığında, üç veya daha fazla, bağımsız olarak kontrol edilen pompa, sıvıları kanallardan iter. Bununla birlikte, her pompa farklı bir hızda çalışır, ancak ortak kanaldaki net akış hızı sabit12'dir. Bu, sadece pompa hızını değiştirerek ana kanal bileşenlerinin hızlı bir şekilde değiştirilmesini sağlar.

Laminer akışa ek olarak, bir diğer kritik faktör, laminer sıvı akışı içindeki parabolik hız profilidir. En yüksek akış hızı derenin ortasında, en yavaş ise yüzeylerin yanında meydana gelir (Şekil 2C)13. Bu profilin, floresan DNA'nın hassas bir şekilde görselleştirilmesi ve doğru tek moleküllü analizler için akışta tutulan bir boncuğa bağlı bir DNA molekülünü tamamen gerdiği düşünülmelidir. Burada, DNA B formuna gerilir ve 0 pN kuvvet altında yerinde tutulur. Bunu başarmak için, optik tuzak konumunun odaklanması alt kapak kayma yüzeyinden 10-20 μm yükseklikte olmalıdır (Şekil 2D). DNA molekülünün B formunun ötesine gerilmemesine dikkat edilmelidir, çünkü bu enzim reaksiyonlarını inhibe edebilir. Tipik tampon koşullar altında, 1 μm = 3.000 bp DNA14. Ayrıca, kapak kaymasından 10-20 μm uzakta tutularak, DNA kompleksi yüzeyden uzağa yerleştirilir ve böylece yüzey etkileşimleri en aza indirilir.

Mikroakışkan cihaz kanalları oluşturmak için birçok yöntem kullanılmıştır ve bunlar laboratuvarda yapılabilir veya akış hücreleri ticari kaynaklardan satın alınabilir 6,15,16,17. Akış hücrelerini oluşturmak için kullanılan en uygun malzemeler mekanik olarak sert, düşük floresanlı optik olarak şeffaf ve organik çözücülere karşı geçirimsiz olmalıdır6. Sıklıkla, borosilikat float cam veya kaynaşmış silika, optik yakalama, görselleştirme ve kuvvet algılama için uygun olan uzun bir süre boyunca istikrarlı bir akış ortamı sağlamak için kullanılır. Bu malzemeler ayrıca yüzey ıslatmasını ve hava kabarcıklarının giderilmesini basitleştirmek için susuz çözücülerin (örneğin, spektrofotometrik sınıf metanol) ve akış hücresini temizlemek için denatürantların (örneğin, 6M guanidinyum hidroklorür) veya deterjanların kullanılmasına izin verir. Son olarak, akışkanları akış hücrelerine sokmak için kullanılan yöntemler, karmaşık vakum pompası sistemlerinden tek şırıngalı pompalara kadar değişir 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Burada açıklanan yaklaşımda, 10 şırıngaya kadar barındırabilen bir şırınga pompası kullanılmıştır (Şekil 3A). Bu, tek kanallı akış hücrelerini veya birden çok giriş kanalına sahip akış hücrelerini kullanma esnekliği sağlar. Burada, üç kanallı bir akış hücresi kullanılır ve poli-eter-eter-keton (PEEK) borusu kullanılarak şırınga pompasında yerinde tutulan şırıngalarla eşleştirilir (Şekil 3A-C). Akışkanların akışı dört yönlü anahtarlama valfleri tarafından kontrol edilir ve böylece kabarcıkların akış hücresine girmesini en aza indirmeye yarar (Şekil 3A, D). Ek olarak, sert cam duvarlara ve politetrafloroetilen (PTFE) kaplı pistonlara sahip Hamilton gaz geçirmez şırıngalar,pürüzsüz bir akış elde etmek için gerekli olan olağanüstü pürüzsüz piston hareketi sağladıkları için tavsiye edilirler 14,27.

Açıklanan deneysel sistemde, iki ila beş giriş kanalına sahip akış hücreleri kullanılmıştır. Giriş kanallarının sayısı, yapılan deney tarafından belirlenir. RecBCD ve Hop2-Mnd1 çalışmaları için iki akış kanalı yeterli14,28 idi. Helikaz için, enzim DNA'nın serbest ucuna bağlandı ve translokasyon ve çözülmeyi başlatmak için magnezyum ve ATP içeren bir akışa çevrildi. Hop2-Mnd1 için, optik olarak hapsedilmiş DNA, proteinler ve tampon ± iki değerli metal iyonları içeren bitişik sıvı akışına çevrildi. Üç kanallı akış hücrelerinin kullanımı, DNA'nın akış 1'de yakalanmasını, protein bağlanmasının gerçekleşmesine izin vermek için DNA'yı akış 2'ye çevirmesini ve daha sonra ATP'nin mevcut olduğu 3. akışa, örneğin reaksiyonları başlatmasını sağlar. Yukarıdakilerin bir varyasyonu, kanal 2'de floresan etiketli protein kullanmaktır, bu da sıvı akışının tamamen beyaz olmasına neden olur ve DNA'nın görselleştirilmesini engeller. Bu molekül akış 3'e çevrildiğinde, reaksiyonlar başlatıldığında hem proteinler hem de DNA artık görülebilir.

Sıvı akışını kontrol etmek için dört yönlü anahtarlama valflerinin kullanılması, akış hücrelerindeki kabarcıkları ortadan kaldırmak için sistemin kritik bir bileşenidir. Kabarcıklar, öngörülemeyen şekillerde büzüldükleri ve genişledikleri için kararlı sıvı akışına zararlıdır, bu da akış hızında hızlı değişikliklere ve türbülansın ortaya çıkmasına neden olur. Vanalar şırıngalar ve giriş boruları arasına yerleştirildiğinde, şırıngalar değiştirildiğinde valf konumu değiştirilerek akış yolunun bağlantısı kesilir. Yeni şırınga yerleştirildiğinde, piston manuel olarak bastırılabilir, böylece >6 μL dışarı atılır (valfin ölü hacmi) ve bu da kabarcıkları neredeyse tamamen ortadan kaldırır.

Bağlayıcıların akış hücrelerine bağlanması, akış hücresi kullanımında genellikle hız sınırlayıcı adımdır. İki tip konektörün kullanımını tanımlıyoruz: prese sığdırma ve kalıcı olanlar (nanoport montajları) olarak bilinen çıkarılabilir. Çıkarılabilir konektörlerin bir akış hücresine yapıştırılması kolaydır ve önerilen PTFE'ye ek olarak farklı esnek boru tipleri bu konektörlerle test edilebilir. Bu, daha pahalı cam akış hücrelerinden ödün vermeden boru ve konektörleri test etmenin hızlı ve uygun maliyetli bir yoludur. Buna karşılık, nanoport tertibatları kalıcı olarak bağlanır, 1.000 psi'ye kadar basınçlara dayanır ve elimizde kullanımları farklı çaplardaki PEEK boruları ile sınırlıdır. PEEK boruları tercihen kullanıldığından bu bir dezavantaj değildir. Kalıcı montajlara sahip tek bir cam akış hücresi, dikkatli kullanımla 1 yıldan fazla bir süre boyunca tekrar kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lazer tuzak hizalama ve polistiren boncuklarla test

NOT: Kurulum için Şekil 1A,B'ye bakın.

DİKKAT: Deneyci, lazer ışını hizalaması sırasında uygun koruyucu gözlük veya lazer güvenlik gözlüğü takmalıdır. Burada açıklanan optik cımbız sistemi hem HeNe hem de IR ışınlarını kullandığından, iki ayrı lazer güvenlik cam eşyası seti gereklidir.

  1. HeNe Kiriş hizalaması
    1. Tüm optik bileşenleri breadboard üzerine yerleştirin. Breadboard'u, mikroskopa göre mümkün olduğunca 90° açıya yakın olacak şekilde hizalayın.
    2. Objektif ve telan lensi içeren çiftleşme tüpünü mikroskopa takın (Şekil 1A-11,12).
      NOT: Telan lens, görüntüyü göz merceklerindeki ara görüntü düzlemine odaklamak için kullanılan bir lens sistemidir.
    3. HeNe lazeri açın ve deklanşörü açın (Şekil 1A-18). Işın, ışığın %50'sini ayna 5'e yansıtan 54 mm yükseklikte filtreye (Şekil 1A-3) çarpmalıdır (Şekil 1A-5). Kirişin geri kalan %50'si ayna 4'e (Şekil 1A-4) ayna 3 ile aynı yükseklikte çarpar.
    4. Ayna 4'ü (Şekil 1A-4), ışın ayna 6'ya (Şekil 1A-6) 51 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın.
    5. Ayna 6'yı (Şekil 1A-6), kiriş alt galvanik aynaya 51 mm yükseklikte yönlendirilecek şekilde ayarlayın. Üst Galvanik aynadan çıkan kiriş 57,5 mm'de olacaktır.
    6. Ayna 3'ü (Şekil 1A-3), bu ışın ayna 5'e (Şekil 1A-5) 57,5 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın. Ayna 5'ten yansıdıktan sonra, ışın ayna 9'a (Şekil 1A-9) aynı yükseklikte çarpmalıdır. Işın ayna 9'da etkili bir şekilde yeniden birleştirilir, hedeften geçer ve telan lens sistemi ayna 21'e (Şekil 1A-21) yansır ve bu da onu hedefe yansıtır.
    7. Mikroskop sahnesine temiz bir mikroskop slaytı yerleştirin. Kamerayı açın ve sabit ve tarama ışınlarının ışınlarını ekranda ayrı ayrı görüntüleyin. Ayna 3, ardından 5 ve 9, son olarak 21 ile başlayarak, sabit kirişi ekranın ortasına yerleştirmek için küçük ayarlamalar yapın.
    8. Ayna 21'den çıkan ışının açısının 90° olduğundan emin olmak için, mikroskobun Z-yüksekliğini değiştirin ve görüntülenen kirişi kızağın üst ve alt yüzeylerine yerleştirin. Aynı olduklarında, kiriş sahneye dik olan doğru konumdadır. Bu ışını deklanşör 19'u kullanarak kapatın (Şekil 1A-19).
    9. Ayna 4 ve 6'dan başlayarak, sabit kirişi ekranın ortasına yerleştirmek için küçük ayarlamalar yapın. Bu ışını kapatın.
  2. Kızılötesi (IR) Işın hizalaması
    DİKKAT: Güvenlik nedenleriyle tüm adımları düşük lazer gücünde gerçekleştirin.
    1. Işın ayırıcı 2'de bölünen iletilen ve yansıyan ışınların oranını ayarlamak için dalga plakası 14'ü (Şekil 1A-14) ayarlayın (Şekil 1A-2). Işın ayırıcı 2, lazer ışınının s-bileşenini yansıtır ve p-bileşenini iletir.
    2. 2'den geçen ışın, kirişi alt galvanik aynaya saptıran ayna 7'ye (Şekil 1A-7) çarpar. HeNe ışınının ayna 21'e giden yolunu izlemelidir. Bu konumlandırmayı elde etmek için ayna 7'nin küçük hareketlerini gerçekleştirin.
    3. Ayna 2'yi, ayna 2 tarafından yansıtılan kiriş, ayna 10'a (Şekil 1A-10) 57,5 mm yükseklikte çarpacak şekilde ayarlayın.
    4. Işın, ayna 10'dan ayna 8'e (Şekil 1A-8) 57,5 mm yükseklikte yansıtılır. Sonraki ışın ayna 9'a aynı yükseklikte çarpmalıdır. Değilse, aynalar 10 ve 8'de gerektiği gibi küçük ayarlamalar yapın.
    5. Hedefi çıkarın ve güç ölçerin kafasını hedef taretindeki bağlantı noktasının üzerine yerleştirin.
    6. Her lazer ışınının gücünü Şekil 1C'de gösterildiği gibi eşit olacak şekilde ayarlamak için plaka 14, 15 ve 16'yı (Şekil 1A-14,15,16) kullanın.
    7. Kiriş genişletici 1'i (Şekil 1A-1) yerine yerleştirin. Genişletilmiş lazer ışınını herhangi bir koma veya astigmatizm olmadan dairesel olacak şekilde ayarlayın.
    8. Optik tuzakları test etmek için, suya asılı 1 μm polistiren boncuklardan oluşan bir çözelti yapın. Daha sonra, bu çözeltinin 10 μL'sini bir mikroskop slaydına yerleştirin, üstüne bir kapak kayması yerleştirin ve oje ile kapatın. Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve bu 1 μm boncukları yakalayarak optik tuzakları test edin. Boncukların tuzaklara emildiğinden ve sahne hareket ettirildiğinde sabit bir şekilde tutulduğundan emin olun. Tuzaklama, tuzağın her tarafından eşit derecede verimli bir şekilde gerçekleşmelidir.

2. Mikroakışkan oda hazırlığı

  1. Akış hücresi, bir kapak kapağı üzerinde polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılmış ticari olarak inşa edilmiş bir cihazsa, adım 3'e geçin. Konektörleri takılı bir cam cihazsa, adım 4'e geçin.
  2. Akış hücresinde konektörler takılı değilse, önce bunları mikroskop slaytındaki giriş deliklerine bağlayın. Bağlayıcı takma adımları için adım 3'e bakın.

3. PDMS akış hücresi kullanarak akış hücresi bağlantıları

NOT: Kurulum için Şekil 2B'ye bakın.

  1. Akış hücresini temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin. PTFE borusunu forseps ile serbest uçtan 3 mm tutun. Boruyu önceden oluşturulmuş porta itin (port 2 bar hat basıncını destekleyebilir).
  2. Kalan bağlantı noktalarının her biri için bu yordamı yineleyin. Giriş portlarını şırınga pompasına ve çıkışı bir atık şişesine bağlayın (Şekil 4A,B).
  3. Her cam şırıngayı 1 mL spektrofotometrik sınıf metanol ile doldurun. Her şırıngayı bir anahtarlama vanasına takın. Valfin çıkışın atığa yönlendirildiğinden emin olun ve her hattı 50 μL metanol ile temizleyin (Şekil 4C, kapalı konum).
  4. Çıkış konumunu akış hücresine geçirin (Şekil 4C, açık konum). Yüzeyleri ıslatmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için akış hücresinden 100 μL/s akış hızında 800 μL metanol pompalayın.
  5. Ertesi gün, 800 μL ultra saf su kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Akış hücresi artık kullanıma hazırdır.

4. Prese uygun boru konektörlerinin takılması

NOT: Kurulum için Şekil 2F'ye bakın.

  1. Prese takılan boru konektörleri kullanılacaksa, yapışkan bandı konektörün bir tarafından dikkatlice çıkarın ve mikroskop slaytındaki deliğin üzerine yerleştirin. Birkaç saniye boyunca aşağı basın. Kalan konektörler için işlemi tekrarlayın.
  2. Akış hücresini temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin. PTFE borusunu forseps ile serbest uçtan 3 mm tutun. Boruyu porttaki önceden oluşturulmuş deliğe itin ve kalan portların her biri için bu prosedürü tekrarlayın.
  3. Boruları girişlerden anahtarlama valflerine takın. 7. adıma geçin.

5. Kalıcı montajların takılması

NOT: Kurulum için Şekil 2A-C'ye bakın.

  1. Yapıştırma işlemi sırasında akış hücresini ve konektörleri yerinde tutmak için ataşmanı temiz, düz bir yüzeyde veya özel yapım bir manifoldda gerçekleştirin.
  2. Akış hücresini temiz düz bir yüzeye veya manifoldun girintili bölümüne yerleştirin (Şekil 2B). Montajın altına az miktarda cam yapıştırıcı yerleştirin ve contayı yerleştirin.
  3. Nanoportu mikroskop slaytındaki giriş deliklerinden birinin üzerine yerleştirin. Yanal hareket olmadan yavaşça aşağı doğru itin ve yerinde tutun. Kalan bağlantı noktaları için işlemi yineleyin.
  4. Manifoldda kurumaya veya kelepçelenmeye bırakın. Akış hücresini manifolddan yavaşça çıkarın ve montajların akış hücresindeki giriş portlarıyla iyi hizalandığından emin olun. Hazır olduğunuzda adım 7'ye geçin.

6. Akış hücresi bağlantıları ve hazırlanması

NOT: Kurulum için Şekil 4A,B'ye bakın.

  1. Mikroskop aşamasına bir akış hücresi yerleştirin. Parmağınızı sıkıca tutturan konektörleri kullanarak boruyu takın.
  2. Her cam şırıngayı 1 mL spektrofotometrik sınıf metanol ile doldurun. Her şırıngayı bir anahtarlama vanasına takın. Valfin çıkışın atığa yönlendirildiğinden emin olun ve her hattı 50 μL metanol ile temizleyin (Şekil 4C, kapalı konum).
  3. Çıkış konumunu akış hücresine geçirin (Şekil 4C, açık konum). Yüzeyleri ıslatmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için akış hücresinden 100 μL/s akış hızında 800 μL metanol pompalayın.
  4. Ertesi gün, 800 μL ultra saf su kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Akış hücresi artık kullanıma hazırdır.

7. Sıvı akışının kontrolü

  1. Anahtarlama valflerini kapalı konuma getirin (Şekil 4C). Şırıngaları çıkarın, artık suyu atın ve şırıngaları deneysel çözeltilerle, örneğin DNA boncuklarıyla doldurun; enzim; ve ATP. Şırıngaları pompaya geri döndürün ve anahtarlama valflerine bağlayın.
  2. Bu pozisyonda, herhangi bir kabarcığı çıkarmak için pistonları manuel olarak 5-10 μL aşağı doğru zorlayın. Anahtarlama valfi konumunu Açık olarak değiştirin.
  3. Tablo 1'de özetlendiği gibi yakalama ve görselleştirme için en uygun akışkan akış hızını elde etmek üzere akış hızı şemasını kullanın. Optik yakalama için en uygun sıvı akışı, boncukların kararlı bir şekilde yakalanmasını sağlamalı ve DNA gerildikten sonra, B formunda (~ 3.000 bp / μm) olmalıdır.

8. Polistiren boncukların tek DNA molekülleri bağlı olarak yakalanması

  1. 10x büyütmede, kanal giriş noktalarına yakın sıvı akışları arasındaki sınırı bulun. 100x hedefine yağ ekleyin ve daha yüksek büyütmeye geçin.
  2. Optik tuzaklar için deklanşörleri açın (her ikisi birden veya birer tane). Odaklanmış lazer ışınları boncukları yakalamalı ve DNA hemen uzanmalıdır.
  3. Bir kompleks tuzağa düşürüldükten sonra, sahneyi akışa dik olarak çevirin (Şekil 3A, C, giriş). Bu, sıkışmış kompleksi DNA boncuk çözeltisinden akış 2'ye taşıyacaktır. Daha fazla çeviri, kompleksi akış 3'e taşıyacaktır.

9. Akış hücresi temizliği

NOT: Bunu günlük olarak gerçekleştirin.

  1. Deney tamamlandığında pompayı kapatın. Anahtarlama valflerini kapalı konuma getirin (Şekil 4C).
  2. Şırıngaları çıkarın ve boşaltın. Filtrelenmiş damıtılmış su ile üç kez durulayın.
  3. Şırıngaları temizleme solüsyonu ile doldurun. Şırıngaları pompaya yerleştirin ve anahtarlama vanalarına bağlayın.
  4. Anahtarlama valflerini boşaltın ve konumu açmak için değiştirin. Tipik olarak gece boyunca 100 μL/s akış hızında 800 μL temizleme çözeltisi pompalayın.
  5. Ertesi gün, anahtarlama valflerini kapatın ve ardından şırıngaları suyla çıkarın ve durulayın. Akış hücresini ve hatlarını 400-800 μL su ile 400-800 μL / s akış hızında durulayın. Akış hücrelerinin daha yorucu bir şekilde temizlenmesi gerekiyorsa, temizleme çözeltisini 6 M guanidium hidroklorür ile değiştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tuzak hizalamasının ve mukavemetinin ilk testi 1 μm, floresan olmayan polistiren boncuklarla yapılır. Laboratuvarda yapılan araştırmaların çoğu floresan kullandığından, 1 μm, Dragon yeşil polistiren boncuklar kullanarak tuzak mukavemetini daha da test ediyoruz (Şekil 1D, E). Bundan sonra çalışma, DNA'nın bis-intercalating boya YOYO-114,29 ile boyandığı DNA-boncuk komplekslerinin optik yakalamasına dönüşür. Bu komplek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış sisteminin dikkatli bir şekilde monte edilmesi, deneylerin başarılı bir şekilde sonuçlanması için kritik öneme sahiptir 4,6. Protokolün en zorlu yönlerinden biri, konektörlerin cam yüzeye tutturulmasıdır. Bunun için aşağıdaki iki yaklaşımı kullanıyoruz: prese uygun boru konektörleri ve nanoport montajları. Prese takılan konektörler cama kolayca yapışır ve ardından PTFE borularının forseps kullanılarak önceden oluşturulmuş deliklere itilmesiyle takip edilir. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bianco laboratuvarındaki araştırmalar, NIH hibeleri GM100156 ve GM144414 tarafından P.R.B.'ye desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100x objektifLeica506318 veya 506038Yağa daldırma lensleri; Yalnızca görüntüleme ve optik yakalama; Floresan görüntüleme için optimize edilmiş APO hedeflerini planlayın
10X ObjektifLeica506263Hizalama sırasında lazer ışını noktalarını bulmak için kullanılır; akış hücresinde odak ve XY konumunu bulmak için
1 mm floresan boncuklarBangs LabsFSDG004Musluk performansı, odak konumu belirleme için kullanılır
1 mm polistiren boncuklarBangs LabsCPO1004Tuzak performans değerlendirmesi ve biyotinile moleküllere bağlanma için kullanılır
63x objektifLeica506081Hizalama sırasında lazer ışını noktalarını bulmak ve akış hücresinde odak ve XY konumunu bulmak için kullanılır; 100X ile aynı arka açıklık çapına sahip olduğu için optik yakalama için kullanılabilir; yağa daldırma lensi
Hizalama lazeriLumentum1100 serisiOptik konumlandırmak için kullanılan çıplak gözle görülebilen 10mW HeNe lazer
Işın hizalama kamerasıAmscopeMU303Işın konumunun görüntülenmesi için basit, ucuz ve yazılım kontrollü bir kamera
Kamera kontrolü ve Görüntü yakalama yazılımıHamamatsuHCImageHızlı dalga boyu geçişini kolaylaştırmak için Lambda DG4'ün faaliyetlerini kamera ile koordine
Kamera; Orca flash 4Hamamatsuc13440-20cuTek moleküllü deneylerin görüntülenmesi için CCD kamera
hizalama kamerası için C-mountNokta görüntüleme çözümleriDE50CMTHizalama sırasında lazer ışınlarının görüntülenmesi için kameranın optimum şekilde konumlandırılmasını sağlar
Orca Flash 4 kameraiçin C-mountIR engelleme filtresini yerinde tutmak için bir tutma halkasına sahiptir. Bu, optik tuzaklardan yansıyan IR ışınını ortadan kaldırır ve sıkışan nesnelerin daha net görüntülenmesini kolaylaştırır.
Cy5  floresan filtre küpüSemrockcy5-404a-lsc-zeroYalnızca Cy5'i görüntülemek için Lambda DG4 ile birlikte kullanılır
Fitc-Txred  floresan filtre küpüSemrockfitc/txred-2x-b-000FITC ve TXRed Fluidics borularını görüntülemek için Lambda DG4 ile birlikte kullanılır
Grace Bio46004PEEK'e alternatif olarak PTFE boru; Bazı akış hücrelerinde iyi çalışır. Grace Bio fit boru konektörleri kullanıldığında PDMS akış hücreleri veya cam akış hücreleri ile kullanılabilir
GFP floresan filtre küpüSemrockgfp-3035b-lsc-zeroYalnızca GFP'yi görüntülemek için Lambda DG4 ile birlikte kullanılır
Cam akış hücreleriTranslumeCustomGörüntüleme için net akış kanalları (Şekil 2E)
Cam tutkalıLoctite233841Nanoport düzeneklerini cam akış hücrelerine güvenli ve kolay bir şekilde yapıştırır
Cam/PDMS sandviç akış hücreleriCIDRA Hassas hizmetlerÖzel tasarımSpesifikasyonlarınıza göre oluşturulmuş akış hücreleri; görüntüleme kanalları açık (Şekil 2C)
Hamilton Temizleme solüsyonuHamilton18311Cam akış hücreleri için nazik ama etkili temizleme solüsyonu; dikkatli kullanıldığında kabarcık yapmaz
Aydınlatma sistemiSutter InstrumentLamda DG4Durdurulan bu yüzden Lambda 721'i tavsiye edin
Aydınlatma sistemiSutter InstrumentLamda DG4Üretimi durduruldu bu yüzden Lambda 721'i tavsiye edin
Görüntü analiz yazılımıMedya sibernetikImage Pro PremiereGörüntülerin analizi ve tek molekül takibi
Görüntü analiz yazılımıFiji/NIH Image/Image JSharewareGörüntülerin analizi ve tek molekül takibi
Görüntü ekran kartıMelles Griot06 DLA 001Thorlabs'tan alternatif ürün: VRC5
Daldırma yağıZeiss444960Immersol 518 F floresan içermez
Lazer ışını hizalama araçlarıThor labsFMP05/M; DGO5-1500-H1; BHM1 Kirişlerin yatay ve doğru yükseklikte olmasını sağlamak için kullanılır
Lazer ışını görüntüleyiciKanada Fotonik laboratuvarlarıIR 3150Aynalarda ve  hedeflerde IR ışın lekelerini görüntülemek için kullanılır
Lazer güç ölçerThor laboratuvarlarıLazer çıkışının yanı sıra tuzak gücünün ölçümü
Lazer güvenlik gözlükleri (HeNe)Thor labsLG7 veya 8Blok >3 OD dalga boyundaki ışık birimleri >600 nm
Lazer güvenlik gözlükleri (IR)Thor labsLG11Bloklar >7 OD dalga boylu ışık birimleri ³ 1000 nm
Mcherry  floresan filtre küpüSemrockmcherry-a-lsc-zeroYalnızca mcherry'yi görüntülemek için Lambda DG4 ile birlikte kullanılır
MikroskopLeicaDMIRE2DIC bağlantı noktası, Dikroik yakalama/hizalama aynasını barındırmak için çıkarıldı
Mikroskop kontrol yazılımı UCSF/sharewareuManagerMikroskobu kontrol eder, objektiflerin odak hizalanmasına ve sahne kontrolüne izin verir
Nanoport montajıIDEXN333Akış hücrelerine bağlı konektörler
Optik tabla desteğiThor LabsPA52502Aktif izolasyon masası desteği
Optik ve lenslerSolar TIIÇeşitliSistem için özel olarak tasarlanmış girişim aynaları, teleskoplar ve lensler
PDMS akış hücreleriufluidixÖzelAkış hücreleri, spesifikasyonlarınıza göre üretilmiştir; görüntüleme kanalları açık (Şekil 2B ve D)
PEEK hortumuIDEX1532Akış hücrelerine ve anahtarlama valflerine mükemmel bağlantı sağlar
Pinkel floresan filtre küpüSemrocklf488/543/635-3x-a-000Birden fazla floroforu hızlı bir şekilde görüntülemek için Lambda DG4 ile birlikte kullanılır
Bastırarak takılan boru konektörleriGraceBio46003Cama iyi bağlanan yapışkanlı şeffaf silikon konektör
Tarama aynalarıGSI LumonicsVM500İkinci optik tuzağın kontrolünü sağlamak için kullanılır. GSI Lumonics artık mevcut değil. Benzer aynalar Cambridge Scientific Stage'den satın alınabilir
Leica
Stage mikrometre ElektronMikroskobu Bilimleri68042-08Işının konumlandırılması ve sistem kalibrasyonu için ekran cetveli sağlar
Anahtarlama valfleriIDEXV-101T Sıvıakış yönünü kontrol edin ve kabarcıkların akış hücrelerine girmesini ortadan kaldırın
Şırınga ve valf manifolduMakine atölyesiYokÖzel yapım
Şırınga pompasıHarvard AparatıPHD 2000Akış hücrelerinden sıvı akışını kontrol eder
Şırınga pompası yazılımıHarvard Apparatus70-6000Flow kontrolü, sıvı akışının kesintisiz, programlanabilir kontrolünü sağlar
ŞırıngalarHamilton81320Gaz geçirmez, PTFE Luer Lock, cam variller Teflon kaplı pistonlar,
Masa üstüThor LabsT36H, Optik masa üstü veya devre tahtası
Yakalama lazeri, Newport/Spectra, PhysicsJ serisi; BL106CNd:YAG lazer; 1064 nm; 5W lazer
eder Işın , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491(2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704(2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810(2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069(2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483(2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dual Optical TweezersMicrofluidic DevicesSingle Molecule StudiesVisual BiochemistryFluorescence MicroscopyLaminar FlowFlow Cell PreparationSyringe PumpDNA StretchingOptical Trapping

Related Articles