Gastrointestinal sistem, radyoterapötik kanser tedavileri üzerine yaralanmaya karşı en hassas organlardan biridir. Aynı zamanda, bu tür hakaretleri takiben en yüksek rejeneratif kapasitelerden birine sahip bir organ sistemidir. Sunulan protokol, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesini incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Bağırsak epiteli, tek bir hücre katmanından oluşur, ancak bağırsak kriptlerinin dibinde bulunan bağırsak kök hücrelerinin aktif çoğalmasıyla üretilen çok sayıda terminal farklılaşmış hücre türü içerir. Bununla birlikte, akut bağırsak hasarı olayları sırasında, bu aktif bağırsak kök hücreleri hücre ölümüne uğrar. Gama ışınlaması, terapötik olarak etkili olsa da, aktif kök hücre havuzunu tüketmenin yan etkisine sahip olan, yaygın olarak kullanılan bir kolorektal kanser tedavisidir. Gerçekten de, hastalar kısmen aktif kök hücre tükenmesi nedeniyle radyoterapi görürken sıklıkla gastrointestinal radyasyon sendromu yaşarlar. Bağırsak kriptlerindeki aktif bağırsak kök hücrelerinin kaybı, tipik olarak sessiz rezervli bağırsak kök hücrelerinden oluşan bir havuzu aktive eder ve sekretuar ve enterosit öncü hücrelerinin farklılaşmasını indükler. Bu hücreler için olmasaydı, bağırsak epiteli radyoterapi ve diğer büyük doku hakaretlerinden kurtulma yeteneğinden yoksun olurdu. Soy izleme teknolojilerindeki yeni gelişmeler, rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunun, farklılaşmasının ve göçünün izlenmesine izin verir ve bunu bağırsakta incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışma, radyasyon hasarını takiben fare bağırsak epiteli içindeki hücrelerin analizi için bir yöntem göstermeyi amaçlamaktadır.
Giriş
İnsan bağırsak epiteli, tamamen düz1 yerleştirilirse yaklaşık yarım badminton kortunun yüzeyini kaplar. Bunun yerine, insanları bağırsaklarının içeriğinden ayıran bu tek hücre tabakası, bağırsakların yüzey alanını en üst düzeye çıkaran bir dizi parmak benzeri çıkıntı, villus ve girinti, kriptlere sıkıştırılır. Epitelin hücreleri bir kript-villus ekseni boyunca farklılaşır. Villus öncelikle besin emici enterositlerden, mukus salgılayan kadeh hücrelerinden ve hormon üreten enteroendokrin hücrelerden oluşurken, kriptler öncelikle savunma üreten Paneth hücreleri, aktif ve rezerv kök hücreler ve progenitör hücrelerdenoluşur
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm fareler, Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'nde (DLAR) barındırıldı. Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), hayvan denekleri içeren tüm çalışmaları ve prosedürleri onayladı. Hayvan denekleri içeren deneyler kesinlikle onaylanmış hayvan işleme protokolüne (IACUC #245094) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Fare suşları B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-CreER) ve B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) ticari olarak elde edilmiştir (bkz.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Murin genetik soy takibi ile kombinasyon halinde 12 Gy toplam vücut ışınlamasının (TBI) kullanılması, bağırsaktaki radyasyon hasarının sonuçlarının kapsamlı bir analizine izin verir. Başlamak için, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP fareleri, bir Bmi1 + rezerv kök hücre popülasyonunda gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) ekspresyonunu indükleyen tek bir tamoksifen enjeksiyonu aldı. Tamoksifen enjeksiyonundan iki gün sonra, farelere ışınlama veya sahte ışınlama uygulandı. Ötanaziden üç saat .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Yaralanma sonrası 7 gün boyunca bağırsak epitelindeki değişikliklerin hassas analizine izin verir. Önemli olarak, seçilen zaman noktaları yaralanmanın önemli aşamalarını yansıtır ve bağırsakta belirgin değişiklikler (yaralanma, apoptoz, rejenerasyon ve normalleşme aşamaları) ile karakterize edilir60. Bu ışınlama modeli, radyoterapi gören hastaların yaşadığı taklit yaralanmasının uygun bir tezahürünü gösteren
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, doku örneği hazırlama konusunda uzman yardımı için Stony Brook Kanser Merkezi Histoloji Araştırma Çekirdeği'ne ve hayvan bakımı ve kullanımı konusunda yardım için Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'ne teşekkür etmek istemektedir. Bu çalışma, Agnieszka B. Bialkowska'ya verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri DK124342 ve Dr. Vincent W. Yang'a verilen DK052230 hibeleriyle desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL şırınga | BD | ||
| 309659-16G Yeniden Kullanılabilir Küçük Hayvan Besleme İğneleri: Düz | VWR | 20068-630-27G | |
| x 1/2 "iğne | BD | ||
| 305109-28G x 1/2" Monoject 1mL insülin şırıngası | Covidien | ||
| ve prim;-deoksiüridin (EdU) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc284628A | steril DMSO'da 10 mg/mL: su (1:4 v/v), alikot ve -20 ° C'de saklayın; C |
| Azer Bilimsel % 10 Nötr Tamponlu Formalin | Fisher Scientific | 22-026-213-B6.129X1-Gt | |
| (ROSA) 26Sortm1 (EYFP) Cos / J | Jackson Laboratuvarı | Suşu #: 006148 | |
| B6; 129-BMI1tm1 (cre / ERT) Mrc / J | Jackson Laboratuvarı | Suşu #:010531 | |
| Sığır Serumu Albümin Fraksiyonu V, ısı şoku | Millipore-Sigma | 3116956001 | |
| Tavuk anti-GFP | Aves | GFP-1020 | |
| Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 görüntüleme kiti, Invitrogen | Thermo Fisher Scientific | C10638-Mısır | |
| yağı | Millipore-Sigma | C8267-Decloaking | |
| Odası | Biocare Medical | DC2012-Dimetil | |
| sülfoksit (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | ışığa duyarlı |
| DNaz içermeyen proteinaz K | DPBS'de 25 kat seyreltilmiş | Invitrogen | C10618H |
| Donkey anti-tavuk AF647 | Jackson ImmunoResearch | 703-605-155 | |
| DPBS | Fisher Scientific | 21-031-CV-Eosin | |
| Fisher Scientific | S176 | ||
| Floresan Mikroskobu Nikon Eclipse 90i Parlak ve akıcı ışık, objektiflerle: 10X, 20X | Nikon | ||
| Fluoromount Sulu Montaj Ortamı | Millipore-Sigma | F4680-25ML | |
| Gama Hücresi 40 Eksaktör | Best Theratronics Ltd. | - | 0.759 Gy min-1 |
| Keçi anti-tavşan AF488 | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| Hematoksilen Çözeltisi, Solungaç No. 3 | Millipore-Sigma | GHS332 | |
| HM 325 Thermo Scientific | Fisher Scientific | 23-900-668'den | |
| Hoechst 33258, Pentahidrat (bis-Benzimid) | Thermo Fisher Scientific | H3569 | seyreltme 1:1000 |
| Hidrojen Peroksit Çözeltisi, ACS, %29-32, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-603-252-Yerinde | |
| Hücre Ölümü Tespit Kiti, Floresein (Roche) | Millipore-Sigma | 11684795910 | |
| Sıvı Engelleyici Süper PAP KALEMİ, Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Lityum Karbonat (Toz/Sertifikalı ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | L119-500 | 0.5g/1L dH2O |
| Luer-Lok Şırınga steril, tek kullanımlık, 10 mL | VWR | 89215-218-Metanol | |
| VWR | BDH1135-4LP | ||
| Pharmco Ürünleri Etil alkol, 200 KANIT | Fisher Scientific | ||
| NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Asetik Asit ACS Sınıfı | Capitol Scientific | AAP-281000ACSCSLT-Tavşan | |
| anti-Ki67 | BioCare Medical | CRM325 | |
| Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Montaj Ortamı | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| 65 derecede slaytları pişirmek için Scientific Industries Incubator-Genie | Fisher Scientific | 50-728-103 | |
| Sodyum Sitrat Dihidrat | Fisher | Scientific S279-500 | |
| Paslanmaz Çelik Diseksiyon Kiti | VWR | 25640-002 | |
| Superfrost Plus mikro slaytlar [boyut: 25 x 75 x 1 mm] | VWR | ve nbsp; 48311-703 | |
| Tamoksifen | Millipore-Sigma | T5648 | steril mısır yağında 30 mg / mL, tercihen -20 ° C'de taze veya kısa süreli depolama; C, Işığa |
| Duyarlı Tissue-Tek 24 Sürgülü Tutucu Çıkarılabilir Saplı | Sakura | 4465 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Düşük Profilli Bıçaklar | Sakura | 4689 | |
| Tissue-Tek Manuel Slayt Boyama Seti | Sakura | 4451 | |
| Tissue-Tek Boyama Kabı, Yeşil Kapaklı | Sakura | 4456 | |
| Tissue-Tek Boyama Kabı, Beyaz Kapaklı | Sakura | 4457 | |
| Tween 20 | Millipore-Sigma | P7949 | |
| Unisette İşleme Kasetleri | VWR | 87002-292-VWR | |
| Mikro Kapaklı Gözlükler | VWR | 48393-081 | |
| Ksilen | Fisher Bilimsel | X5P-1GAL |
Kaynaklar
- Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
- vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithel....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
