İzole sıçan miyositlerinde kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümü ile birlikte sarkomer uzunluğu tespiti yoluyla kontraktil fonksiyonun ölçümünü tanımlayan bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşımın kalp yetmezliğinin hayvan modellerindeki çalışmalar için uygulanması da dahil edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Kontraktil disfonksiyon ve Ca2+ geçicileri genellikle kardiyak kaynaklı yaralanma ve / veya yeniden modellemenin kapsamlı bir değerlendirmesinin bir parçası olarak hücresel düzeyde analiz edilir. Bu fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için bir yaklaşım, primer erişkin kardiyak miyositlerde yüksüz kısaltma ve Ca2+ geçici analizleri kullanır. Bu yaklaşım için, yetişkin miyositler kollajenaz sindirimi ile izole edilir, Ca2 + toleranslı hale getirilir ve daha sonra laminin kaplı kapaklara yapıştırılır, ardından serumsuz ortamlarda elektriksel pacing yapılır. Genel protokol yetişkin sıçan kardiyak miyositlerini kullanır, ancak diğer türlerden birincil miyositler için kolayca ayarlanabilir. Yaralı kalplerden kaynaklanan miyositlerdeki fonksiyonel değişiklikler, sahte miyositler ve / veya in vitro terapötik tedavilerle karşılaştırılabilir. Metodoloji, hücre odası ve platform bileşenleri ile birlikte miyosit pacing için gerekli temel unsurları içerir. Bu yaklaşım için ayrıntılı protokol, sarkomer uzunluğu tespiti ile yüksüz kısalmayı ölçme adımlarını ve oranmetrik gösterge Fura-2 ile ölçülen hücresel Ca2 + geçicileri ve ham veri analizini içerir.
Giriş
Kardiyak pompa fonksiyonunun analizi, özellikle kalp yetmezliğinin (HF) hayvan modelleri için yeterli içgörü elde etmek için genellikle bir dizi yaklaşım gerektirir. Ekokardiyografi veya hemodinamik ölçümler in vivo kardiyak disfonksiyon1 hakkında fikir verirken, in vitro yaklaşımlar genellikle disfonksiyonun miyofilament ve / veya uyarma eşleşmesinden sorumlu Ca2 + geçici veya kontraktil fonksiyonlu aksiyon potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için kullanılır (örneğin, uyarma-kasılma [E-C] bağlantısı). İn vitro yaklaşımlar ayrıca, pahalı ve / veya zahmetli in vivo<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Kemirgenler üzerinde yapılan çalışmalar, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmet Politikası'nı izlemiş ve Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için, miyositler 3-34 aylık Sprague-Dawley ve ≥ 200 g5 ağırlığındaki F344BN sıçanlarından izole edildi. Hem erkek hem de kadın oranları kullanıldı.
1. Kasılma fonksiyonu çalışmaları için miyosit pacing
- Her bir izole miyosit seti için taze M199 bazlı ortamlar yapın (Malzeme Tablosu). Tempodan 1 gün önce, plaka 2 x 104
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kontraktil fonksiyon çalışmaları, sıçan miyositleri üzerinde izolasyondan sonraki günden (2. gün) başlayarak izolasyondan 4 gün sonrasına kadar yapılır. Miyositler izolasyondan sonraki gün (yani 2. gün) kaydedilebilse de, gen transferinden veya kasılma fonksiyonunu değiştirmek için tedavilerden sonra genellikle daha uzun kültür sürelerigereklidir 8. İzolasyondan sonra 18 saatten fazla kültürlenen miyositler için, bölüm 1'de açıklanan pacing protokolü, t-tübüllerinin ve tutarlı kısaltma ve yeniden .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Adım 1'de özetlenen kronik pacing protokolü, izole miyositleri incelemek ve daha uzun tedavilerin etkisini değerlendirmek için yararlı süreyi uzatır. Laboratuvarımızda kronik tempolu miyositlerde sarkomer uzunluğu kullanılarak kontraktil fonksiyon ölçülürken izolasyondan 4 gün sonrasına kadar tutarlı sonuçlar elde edilmiştir. Bununla birlikte, miyositleri hızlandırmak için 1 haftadan daha eski medya kullanıldığında miyosit kontraktil fonksiyonu hızla bozulur.
Kasılma fonksiyonu çalışmaları içi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların rakip finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe R01 HL144777 (MVW) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MEDIA | |||
| Sığır serum albümini | Sigma (Roche) | 3117057001 | Son konsantrasyon =% 0.2 (a / h) |
| Glutatyon | Sigma | G-6529 | Son konsantrasyon = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Nihai konsantrasyon = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 şişe 1 L yapar; pH 7.45 |
| NaHCO3< / sub> | Sigma | S-8875 | Nihai konsantrasyon = 4 mM |
| Penisilin / streptomisin | Fisher | 15140122 | Son konsantrasyon = 100 U / mL penisilin, 100 & mu; g / mL streptomisin |
| ÖZELLIKLE CA < sup> 2 + < / sup> GÖRÜNTÜLEME IÇIN REAKTİFLER< / güçlü > | |||
| Dimetilsülfoksit (DMSO) | Sigma ve nbsp; | D2650 | |
| Fura-2AM | İnvitrojen (Moleküler Problar) | F1221 | 50 & mu; g/şişe; DMSO'da 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid stok çözeltisi hazırlayın; Ortamdaki son Fura2-konsantrasyonu 5 μ M |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | 1 mM Fura-2AM stoğuna 7.2 mg probenicid (0.5 M) ekleyin; Ortamdaki nihai konsantrasyon 2,5 mM'dir |
| SIÇAN MIYOSİT PACING İÇİN MALZEMELER< / güçlü> | |||
| # 1 22 & nbsp; mm 2< / sup> cam lameller | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inç muz jaklı kablolar | Pomona Electronics | B-36-2 | Ek Şekil 1, panel C |
| 37oC İnkübatör % 95 O < alt> 2< / alt>:% 5 CO2< / alt> | Forma | 3110 | Ek Şekil 1, panel E. Birden fazla model uygundur |
| Sınıf II A/B3 UV lambalı biyogüvenlik kabini | Forma | 1286 | Birden fazla model uygundur |
| Forseps - Dumont #5 5/45 | Güzel Bilim Araçları | 11251-35 | |
| Sıcak boncuk sterilizatörü | Güzel Bilim Araçları | 1800-45 | |
| Düşük büyütmeli ters mikroskop | Leica | DM-IL | Bu mikroskobu inkübatöre bitişik olarak konumlandırın, böylece tempolu miyositleri pacing başlangıcında ve ortam değişikliklerinden sonra kasılma açısından izleyin; 4X ve 10X hedefleri önerilir |
| Pacing odası | Özel | Ek Şekil 1, panel A. Ionoptix C-pace sistemi ticari olarak temin edilebilen bir alternatiftir veya bakınız 22 | |
| Stimülatör | Ionoptix | Myopacer | Ek Şekil 1, panel D. |
| MALZEMELER ve/veya Ca2+ GÖRÜNTÜLEME ANALİZİ | ID Ek Şekil 2 & Alternatifler/Önerilen Seçenekler | ||
| Ca2+ görüntüleme analizi için ek bileşenler | Ionoptix | Essential sistem bileşenleri: -- Foton sayma sistemi -- Çift uyarma ışık kaynağı ile Xenon güç kaynağı -- Floresan arayüzü | - Foton sayma sistemi bir fotoçoğaltıcı (PMT) tüpü ve dikroik ayna içerir ve CCD kameranın yanına monte edilir (panel A #4). - Ksenon ampul ışık kaynağı için güç kaynağı (bkz. panel A #5 ve panel C, solda), panel A #6'da gösterilen çift uyarma arayüzü (340/380 nm uyarma ve 510 nm emisyon) ile entegre edilmiştir. - Bilgisayar arasındaki floresan arayüzü ve ışık kaynağı panel B, #12'de gösterilmiştir. |
| Görüntü toplama donanım ve yazılıma sahip CCD kamera (240 kare/sn) | Ionoptix | CCD denetleyicili Myocam | Myocam ve CCD denetleyicisi Ek Şekil 2, panel A #4 ve panel A #5 & panel C #5'te (sağda) sırasıyla gösterilmiştir. Kontrolör bir PC bilgisayar sistemi ile entegre edilmiştir (panel B #14). |
| Oda stimülatörü | Ionoptix | Miyopak | Panel B, #13; Alternatif: Çim modeli S48 |
| Lamel montajlı perfüzyon haznesi | 22 mm 2 için özel hazne, silikon adaptörlü lamel ve 2-4 Phillips tava başlı #0 vida (ok, panel F) | Panel A #10 & panel F; Oda sıcaklığı, bir TH-10Km probu ve TC2BIP sıcaklık kontrolörü kullanılarak 37oC'ye kalibre edilir (bkz. sıcaklık kontrol cihazı). Ticari alternatifler: Ionoptix FHD veya C-stim hücresi odalar; Cell MicroControls kültür stimülasyon sistemi | |
| Fonksiyon/Ca2+ geçici akımlarının veri toplama ve analizi için özel bilgisayar ve yazılım | Ionwizard | PC kartı ve yazılımı ile Ionoptix PC | Panel B, #14; Kasılma fonksiyonu, IonWizard yazılımının SarcLen (sarkomer uzunluğu) veya SoftEdge (miyosit uzunluğu) edinme modülleri kullanılarak ölçülür. Ionwizard yazılımı ayrıca ratiometric için PMT edinim yazılımını da içerir; Fura<2AM yüklü myoyctes'te Casup>2+ görüntüleme. - Somputer ve hücre stimülatörünü barındırmak için 4 direkli elektronik raf montajlı kabin ve raflar önerilir. Ca2+ görüntüleme için floresan arayüzü de bu kabine yerleştirilmiştir (aşağıya bakın). |
| Forseps - Dumont #5 TI | Güzel Bilim Araçları | 11252-40 | Panel F |
| Medya için yalıtımlı tüp tutucu | Özel | Panel A # 9; Bu tutucu, strafor ve strafor kullanılarak kolayca monte edilir. Ortamı sıcak tutmak için önceden ısıtılmış bir jel paketi | |
| Ters çevrilmiş parlak alan mikroskobu | Nikon | TE-2000S | Ca2+ görüntüleme için epi-floresan için dönen bir taret (Panel A #2) takın. Ca2+ görüntüleme sırasında floresan ağartmayı en aza indirmek için koyu kırmızı (590 nm) bir kondenser filtresi de önerilir. |
| İzolatör Masası | TMC Titreşim Kontrolü | 30 x 36 inç | Panel A, #1; Arzu edilen: yükseltilmiş raflar, Faraday koruması |
| Mikroskop göz mercekleri ve objektif | Nikon | 10X CFI göz mercekleri 40X su CFI Planı Fluor objektif | Panel A #3; 40X objektif: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. Objektifin etrafına bir Cell MicroControls HLS-1 objektif ısıtıcısı monte edilmiştir (aşağıdaki sıcaklık kontrol cihazına bakın). NOT: Suya daldırma sebilleri de artık su bazlı hedefler için mevcuttur. |
| Peristaltik pompa | Gilson | Minipuls 3 | Panel A # 8 ve panel E |
| küçük kantar Fisher | 08-732-112 | ||
| Sıcaklık kontrol cihazı | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. Bu sıcaklık kontrol cihazı, lamel odasını 37 < sup>o< / sup>C. Bu platform için bir ön ısıtıcı ve objektif ısıtıcı önerilir. A Cell MicroControls HPRE2 ön ısıtıcı ve HLS-1 objektif ısıtıcı kontrollüdür Çalışmalarımız için TC2BIP sıcaklık kontrolörü tarafından. |
| Hareket sensörlü dolap altı LED ışık | Sylvania | #72423 LED ışığı | Minimum oda ışığı altında Ca2+ geçici görüntüleme sırasında veri toplama için önerilir. Alternatif: Esnek boyunlu el feneri / kitap ışığı üzerinde bir klips - birden fazla tedarikçi mevcuttur. |
| Sıralı Ehrlenmeyer şişesi ve koruyucu filtreli vakum hattı | Fisher | Tygon hortumu - E363; polipropilen Ehrlenmeyer şişesi - 10-182-50B; Vakum filtresi - 09-703-90 | Panel A #11 |
Kaynaklar
- Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016). <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
