Yöntem makalesi

Buz ve Klatrat Hidrat Kristalizasyonunun İncelenmesi için Mikroakışkan Bir Yaklaşım

DOI:

10.3791/64072

⸱

18 Ağustos 2022

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Yeshiva University, 2Department of Physics, Katz School of Science and Health, Yeshiva University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, mikroakışkan cihazlarda mikroskobik buz kristallerinin ve klatrat hidratların kristalleşmesini tanımlamakta ve oluşan kristallerin etrafında sıvı değişimini sağlamaktadır. Bu, inhibitörlerin kristalleşme sürecini ve bağlanma mekanizmalarını incelemek için eşsiz olanaklar sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Su kristalizasyonunun doğru bir mekanik tanımı zordur ve birkaç temel unsur gerektirir: tek mikroskobik kristallerin oluşumuna izin vermek için mükemmel sıcaklık kontrolü ve soğuk aşamaya bağlı uygun bir mikroskopi sistemi. Burada açıklanan yöntem, buz ve klatrat hidrat kristalleri etrafında çözelti alışverişini içeren bir başka önemli özellik daha ekler. Tanımlanan sistem, mikroakışkanlar, yüksek çözünürlüklü soğuk aşamalar ve floresan mikroskobu dahil olmak üzere benzersiz ve ev yapımı aletlerin bir kombinasyonunu içerir. Soğuk aşama mikroakışkan cihazlar için tasarlanmıştır ve mikroakışkan kanallar içinde mikron boyutunda buz/hidrat kristallerinin oluşumuna ve bunların etrafındaki çözeltilerin değişimine izin verir. Soğuk aşamanın sıcaklık çözünürlüğü ve stabilitesi, bu küçük kristallerin büyümesini kontrol etmek için çok önemli olan bir milikelvindir. Bu farklı sistem, buz ve hidrat kristalizasyonunun farklı süreçlerini ve bu kristallerin büyümesinin engellendiği mekanizmayı incelemek için kullanılır. Protokol, mikroakışkan cihazların nasıl hazırlanacağını, mikroakışkan kanallardaki mikroskobik kristallerin nasıl yetiştirileceğini ve kontrol edileceğini ve buz / hidrat kristallerinin etrafındaki sıvı akışının kullanılmasının suyun kristalleşmesine nasıl yeni bilgiler sağladığını açıklar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antifriz proteinleri (AFP'ler) ve antifriz glikoproteinleri (AFGP'ler) soğuğa adapte olmuş çeşitli organizmaları don hasarlarından korur1. AFP'ler ve AFGP'ler (AF (G) Ps olarak genelleştirilmiştir), yüzeylerine geri dönüşümsüz olarak bağlanarak ve Gibbs-Thomson etkisi 2,3,4,5 nedeniyle daha fazla büyümeyi inhibe ederek buz kristallerinin büyümesini inhibe eder. Büyük ölçüde değişmemiş olan erime sıcaklığı ile yeni depresif donma sıcaklığı arasında oluşan boşluğa termal histerezis (TH) denir ve AFP aktivitesine karşılık gelen ölçülebilir bir parametreyi temsil eder6. Buz büyümesini engellemek için AFP'lerin kullanılması, kriyoprezervasyon, dondurulmuş gıda kalitesi ve soğuğa maruz kalan mahsullerin korunması dahil olmak üzere çeşitli alanlarda potansiyel iyileştirme sunan geniş kapsamlı ve çeşitli uygulamalara sahiptir.

Küçük organik moleküllerin varlığında suyun düşük sıcaklıklarda ve yüksek basınçlarda kristalleşmesi, en bol hidratın metan hidrat7 olduğu klatrat hidratların (veya gaz hidratlarının) oluşumuna neden olur. Metan hidratların gaz/yağ akış hatlarında kristalleşmesi, gaz ateşlemesi nedeniyle patlamalara neden olabilecek tıkaçlara neden olabilir 8,9,10. Akış hatlarında hidrat kristalleşmesini önlemeye yönelik mevcut çabalar, termodinamik (alkoller ve glikoller) ve kinetik (esas olarak polimerler) inhibitörlerinkullanılmasını içerir 11,12,13,14. AFP'lerin ayrıca hidrat kristallerini klatratmak ve büyümelerini engellemek için bağlandığı bulunmuştur, bu da AFP'lerin tıkaç oluşumunu engellemek için potansiyel kullanımına işaret eder ve böylece daha yeşil bir çözüm sağlar15.

Mikroakışkanlar, bir mikrokanal ağı üzerinden akan küçük numune hacimlerinde (fL'ye kadar) sıvıların özelliklerini incelemek için kullanılan yaygın bir yöntemdir16. Mikrokanallar, litografi17 kullanılarak bir silikon gofret (kalıp) üzerinde oluşturulan bir deseni takip eder. Mikroakışkan cihazları üretmek için yaygın olarak kullanılan bir malzeme, araştırma laboratuvarlarında çalışmak için ucuz ve nispeten basit olan polidimetilsiloksan (PDMS) 'dir. Özelliklerin (kanalların) tasarımı, cihazın özel amacına göre oluşturulur; Böylece, DNA algılama18, tıbbi tanı19 ve kristalleşme süreçleri 3,20,21 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Mevcut protokol, AFP'ler ve AFGP'ler de dahil olmak üzere çeşitli inhibitörlerle mikron boyutunda buz ve hidrat kristalleri yetiştirmek için benzersiz bir mikroakışkan yöntemi tanımlamaktadır. Bu deneyler için, basınç ve sıcaklık kontrolü için özel ekipman gerektiren metan gazı hidratları22'nin özelliklerini taklit etmek için Tetrahidrofuran (THF) hidratları kullanılmıştır23. Floresan etiketli AF (G) P'ler, proteinlerin kristal yüzeye adsorpsiyonunu görselleştirmek ve analiz etmek için kullanıldı ve floresan görüntüleme ile birleştiğinde, mikroakışkan yaklaşım, bu moleküllerin kristal yüzeylere bağlanma sürecinin temel özelliklerinin elde edilmesine izin verdi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikroakışkan cihaz imalatı

  1. Bir Petri kabının iç yüzeyini alüminyum folyo ile örtün ve önceden hazırlanmış kalıbı Petri kabına yerleştirin.
    1. Referanslarda açıklanan litografi tekniklerini kullanarak kalıpları imal edin. Bu çalışmada kullanılan iki cihaz tasarımı Şekil 1'de gösterilmiştir.
  2. Kürleme maddesi ve elastomerin 1:10 (ağırlıkça) karışımını tartarak (bkz. Malzeme Tablosu) 30-40 mL PDMS karışımını hazırlayın ve karışım beyaz ve neredeyse opak görünene kadar yaklaşık 5 dakika boyunca sürekli karıştırın.
    NOT: Tartım terazisine plastik bir bardak yerleştirin, elastomeri kabın içine dökün ve ardından 1:10 ağırlık oranına ulaşmak için kürleme maddesini ekleyin.
  3. PDMS karışımını kalıpla birlikte Petri kabına dökün ve kabarcık kalmayana kadar (yaklaşık 30 dakika) bir kurutucuda gazı boşaltın.
  4. Kalıbı sıvı PDMS ile bir fırında veya sıcak plakada kauçuk benzeri bir kıvam elde edilene kadar 70 ° C'de pişirin. Bu işlem yaklaşık bir saat sürer.
  5. Bir neşterle özelliklerin etrafında izleyerek cihazı kesin, kalıp kırılgan olduğu için neşterle aşağı yerine ileriye doğru itmeye özen gösterin. Kesilmiş PDMS cihazını çıkarın ve yeni bir Petri kabına baş aşağı yerleştirin. Bir parça yapışkan bant takıp çıkararak alt yüzeydeki toz ve kir parçacıklarını temizleyin (bkz.
  6. Gerekirse mikroskop kullanarak, baskılı desene göre cihazdaki delikleri delmek için künt bir şırınga iğnesi (20 G) kullanın. Deliğin cihazın diğer tarafına nüfuz ettiğinden emin olun ve delinmiş parçaları çıkarmak için cımbız kullanın.
  7. Bir kapak kaymasını (18 x 18 mm, 0,14 mm kalınlığında) su ve sabunla ve ardından izopropanol ile iyice yıkayın. Temizlenmiş kapak kapağını kurutmak için hava basıncı kullanın.
  8. Temizlenmiş PDMS'yi ve kapak kapağını plazma temizleyiciye yerleştirin, vanaları kapatın ve gücü, vakumu ve pompayı açın. Plazma temizleyicinin yaklaşık bir dakika çalışmasına izin verin, RF'yi HI olarak ayarlayın ve ince valfi kullanarak plazma temizleyiciye bir miktar havanın girmesine izin verin.
    1. Görüntüleme penceresinin rengi mordan pembeye değiştiğinde, plazma temizleyicinin 50 sn çalışmasına izin verin ve RF'yi kapatın. Pompayı bir dakika boyunca açık tutun ve kapattıktan sonra, havanın plazma temizleyiciye girmesine izin vermek için ana valfi yavaş yavaş açın.
      NOT: Karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için alternatif bir yöntem ısı bağıdır. Bu yöntem için, kalıbı kapak kapağının üzerine yerleştirin ve yaklaşık 60 dakika boyunca 70-80 ° C'ye ayarlanmış bir sıcak plakaya yerleştirin.
  9. PDMS yüzeyini temizlenmiş kapak kapağının üzerine bastırın ve kapak kayması üzerinde hafifçe yukarı çekerken ayrılma gözlenmeden yapıştırıldıklarını onaylayın.
  10. 90° künt iğnenin (18 G) iğnesini bir çift pense ile sabitleyin ve çıkarmak için plastik şırınga konektörünü çıkarın. İğnenin bir ucunu bir Tygon tüpüne (0,020" ID, 0,060" OD, Malzeme Tablosuna bakınız) ve diğer ucunu cihazın delinmiş deliklerinden birine yerleştirin. İşlemi diğer delikler için tekrarlayın.
  11. Hava kabarcıklarını gidermek için, kanallara bir cam şırınga ile su / tampon enjekte edin (bir pompa isteğe bağlıdır, ancak burada pompa kullanılmamıştır). Tüm sıvıları cihaza enjekte etmeden önce 0,22 μm filtre ile filtreleyin.
  12. Floresan etiketli AFP'lerin PDMS duvarlarına bağlanmasını önlemek için% 1 BSA çözeltisi gibi bir bloke edici madde kullanın. Bloke edici maddeyi giriş kanalına enjekte edin ve 20 dakika boyunca mikro kanallarda kalmasına izin verin. Ardından, BSA çözeltisini temizlemek için tampon çözeltisini giriş kanalına enjekte edin.
    NOT: Elde edilen PDMS cihazı, alt yüzeyi boyunca bir kapak kaymasına tutturulur, giriş ve çıkış deliklerindeki boruya bağlanır ve kanallarında bir bloke edici madde ile kaplanır.

2. Mikroakışkan cihazın kurulması

  1. Bakır soğuk aşamasının yüzeyine az miktarda daldırma yağı uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ince bir yağ tabakası oluşturmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanarak yayın. Ardından, oluşturulan yağ tabakasına temiz bir safir disk yerleştirin (bkz. Safir diskin ortasına bir damla daldırma yağı uygulayın ve PDMS cihazını, cihazın özellikleri soğuk sahnenin görüş deliği üzerinde hizalanmış olacak şekilde damlanın üzerine yerleştirin.
  2. Cihazı yerinde tutun ve boruyu, yapışkan bant kullanarak soğuk sahneyi barındıran alüminyum kutunun dış duvarlarına sabitleyin. Her bir özel tüpün yerleşimini not edin.
  3. Giriş kanalına 4-5 μL AF(G)P çözeltisi enjekte etmek için bir cam şırınga kullanın (bkz. Soğuk sahnenin kapağını kapatın.
    NOT: AFP çözeltilerinin konsantrasyonu, floresan yoğunluklarına göre değiştirilebilir ve kararlaştırılabilir. Mevcut protokolde, konsantrasyon aralığı 5-40 μL idi.

3. Mikroakışkan kanallarda tek kristallerin oluşumu

  1. İçinde yoğuşma oluşmasını önlemek için soğuk etabı kuru hava/azotla temizleyin. Suyu soğuk aşamada dolaştırmak ve bir soğutucu görevi görmek için dolaşımdaki bir soğutma banyosunu etkinleştirin.
  2. Sıcaklık kontrol programını başlatın ve sıcaklığı -25 ° C'ye ayarlayın.
    NOT: Numune ~-20 °C sıcaklığa ulaştığında donma meydana gelecektir, bu da numunenin ani koyulaşması ve pürüzlenmesi olarak gözlemlenebilir. Bu noktada herhangi bir hedef, tercihen kullanıcının mikroakışkan kanalların tamamını gözlemlemesini sağlayan 4x hedefi kullanılabilir.
  3. Yavaşça, sıcaklığı yaklaşık 1 ° C / 5 s artırarak, AF (G) P çözeltisinde kullanılan tampona bağlı olarak -1 ila -0,2 °C arasında değişebilen numunenin erime noktasına yaklaşın. Sıcaklık erime noktasına yaklaştıkça, birkaç tek kristal izole edilene kadar bekleyin.
    NOT: Gerekirse, istenmeyen buz, mikroskop üzerine sabitlenmiş bir IR lazer (980 nm) kullanılarak yerel olarak eritilebilir (bkz. Lazer, açık olduğu sürece yakındaki buz kristallerini erir.
  4. Bu noktada, tek kristalleri daha iyi gözlemlemek için 10x veya 20x hedeflerine geçmeniz önerilir. İstenilen yerde tek bir kristal elde ettikten sonra, kristalin kenarları kanal duvarlarıyla buluşana kadar sıcaklığı hafifçe azaltarak (~ 0.01 ° C) kristali büyütün.
  5. 50x hedefine geçin, AF (G) P çözeltisini kanallara enjekte edin ve protein çözeltisinin kanallara başarıyla enjekte edildiğini gösteren floresan yoğunluğu artışını gözlemleyin. Çözeltilerin değişimi sırasında buz kristalinin erimesini önlemek için bu adımı dikkatlice uygulayın. Çözelti değişim işlemi sırasında hem akış hızını (cam şırıngaya daha fazla/daha az basınç uygulayarak) hem de sıcaklığı yakından izleyin ve ayarlayın.
  6. Proteinlerin birikmesi ve kristal yüzeye bağlanması için yeterli zamana izin verin.
    NOT: Bu, AF(G)P5,25'in birikme ve adsorpsiyon oranlarına bağlı olarak değişir. Tipik bir deneyde, AFP birikimi için 5-10 dakikaya izin verilir.

4. Termal Histerezis (TH) aktivite ölçümü

NOT: Bu adım isteğe bağlıdır.

  1. Sıcaklığı 0.002 ° C'lik küçük adımlarla ayarlayarak ve küçük bir kristalin erimeden maruz kalabileceği en yüksek sıcaklığı gözlemleyerek kristalin erime noktasını belirleyin.
  2. Sıcaklık kontrol cihazının RAMP fonksiyonunda, soğutma hızını -0,05 ila -0,01 °C / 4 s olarak ayarlayın ve RAMP'ı etkinleştirin. Ani kristal büyümesinin gerçekleştiği tam sıcaklığa dikkat edin.
    NOT: Bu değere patlama sıcaklığı denir ve donma sıcaklığına karşılık gelir. Erime ve donma sıcaklıkları arasındaki fark, TH aktivitesi25'tir.

5. Tek kristaller etrafında çözelti değişimi

  1. Deney sırasında kristalin erimesini veya büyümesini önlemek için numune sıcaklığının TH boşluğunda olduğundan emin olun.
  2. Daha sonra floresan veri analizi için NIS Elements görüntüleme programını kullanarak çözelti değişim sürecini kaydedin (bkz. Tampon çözeltisini mikroakışkan cihazın ikinci girişine yavaşça enjekte edin ve şırıngaya uygulanan basınca bağlı olarak floresan sinyalinde bir azalma gözlemleyin.
    1. Kristalin erimesine neden olmamak için uygulanan basıncın çok yüksek olmadığından emin olmak için bu görsel temsili kullanın. Çözüm değişim işlemini gösteren bir dizi görüntü için Şekil 2'ye bakın.
  3. Görüntüleme programını kullanarak mikroakışkan kanaldaki floresan yoğunluğunu ölçün.
    NOT: Sinyal, AFP bağlanmasını gösteren kristalin yüzeyine yakın bölgede zirveye ulaşmalı ve tamponla yıkanmış olan çevreleyen çözeltide nispeten düşük olmalıdır.
  4. 4. adımı izleyerek çözüm değişiminden sonra TH etkinliğini ölçün.
  5. Yeni bir kristali izole ederek deneyi tekrarlayın (adım 3.3-3.5). AFP çözeltisini bir cam şırınga ile enjekte edin ve çözelti değişimini tekrarlayın (adım 5.1-5.3). Yeni bir tek kristal elde edin (adım 3.3-3.5) ve cam şırıngayı kullanarak AFP çözeltisini kanallara aktarın.

6. Klatrat hidratlarla yapılan deneyler

  1. THF hidratları elde etmek için, 1:3.326 hacim oranı olan 1:15 molar oranına sahip bir THF / su çözeltisi hazırlayın. AF (G) Ps veya diğer inhibitörleri içerenler de dahil olmak üzere aşağıdaki deneylerde kullanılan tüm çözeltilerde bu oranı koruyun.
  2. Mikroakışkan cihazı hazırlamak ve soğuk aşamaya yerleştirmek için 1. ve 2. adımları izleyin. Sıcaklığı -25 °C'ye ayarlayın; numune, adım 3.2'de açıklandığı gibi ~-20 ° C'de donacaktır.
  3. THF çözeltisi dondurulduktan sonra, tüm buzlar eriyene kadar sıcaklığı yavaşça artırın.
    NOT: Buzun erime noktası THF tarafından hafifçe bastırılır.
  4. Tüm buz kristallerinin hidratların hariç tutulmasıyla eridiğinden emin olmak için, sıcaklığı 3 dakika boyunca 1 ° C'de tutun.
  5. Sıcaklığı -2 ° C'ye ayarlayın ve inhibitörlerin yokluğunda mikroakışkan kanallarda görünen hidratların bolluğunu gözlemleyin.
    NOT: THF hidratları oktahedron şeklindedir (Şekil 2) ve bazı durumlarda kristaller çok incedir; bu nedenle, net gözlem zor olabilir. Bu durumlarda, yeni kristaller elde etmek için 6.4-6.5 arasındaki adımları tekrarlamanız önerilir.
  6. Elde edilen kristallerin erimemesini / büyümemesini sağlamak için sıcaklığı ayarlarken cam şırıngayı kullanarak AF (G) P / inhibitörünü mikroakışkan kanala enjekte edin. İnhibitör moleküllerin kristal yüzeye adsorbe olması için birkaç dakika bekleyin.
  7. Gerekirse, adım 4'ü izleyerek TH etkinliğini ölçün.
  8. Çözeltiyi kristallerin etrafında 5.2-5.3 adımlarında açıklandığı gibi değiştirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Buz kristalleri ile çözelti değişimi
Bir buz kristali etrafında başarılı bir çözelti değişimi Şekil 3'te sunulmuştur. Her anlık görüntüdeki zaman damgası, çözüm değişiminin nispeten hızlı olduğunu gösterir; ancak, daha yavaş bir değişim mümkündür. Buz adsorbe edilmiş AFGP moleküllerinden gelen floresan yoğunluğu, değişim tamamlandıktan sonra açıkça gözlenir (Şekil 3, sağda). Buz yüzeyindeki AFP konsantrasyonunun nicel bir analizi, belirlenmiş bir ilgi alanı (ROI) aracı kullanılarak izlenir (Şekil 4). Bu deneyde4, 50 mM Tris-HCl (pH 7.8) ve 100 mM NaCl ile seyreltilmiş AFP tip III (QAE izoformu) kullanılmıştır. Çözelti, bipiramidal şekilli bir kristal etrafında değiştirilir ve çözeltideki ve buz üzerindeki floresan yoğunluğu izlenir. Çözeltideki floresan sinyalini gösteren kırmızı grafik, çözelti değişimi sırasında 100 kat azalırken, buz yüzeyinde hesaplanan sinyal (yeşil grafik) sabit kalır. Buz adsorbe edilen moleküllerin hesaplanan sinyali, çözeltiden gelen sinyalin (mikroakışkan kanalın kalınlığı ile ilgili bir sabit ile çarpılır) buzdan gelen sinyaldençıkarılmasıyla elde edildi 4.

THF hidratları ile çözelti değişimi
THF hidratlarla yapılan mikroakışkan deneyler, buzla yapılan deneylere benzer şekilde gerçekleştirildi. Hidrat kristallerinin inhibitör molekülleri çözeltiden adsorbe etmesine izin verildikten sonra, kanallara inhibitör içermeyen bir çözelti enjekte edildi. Şekil 5, iki tip inhibitör ile çözelti değişiminden sonra THF hidratlarını sunmaktadır: floresein izotiyosiyanat (FITC) ile etiketlenmiş AFGP1-5 (Şekil 5A) ve floresan boya26 olan safranin O (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 5B). Bu, bir klatrat hidratının yüzeyine bağlanan bir AFGP'nin ilk şeytani başlangıcıdır.

figure-results-1
Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan mikroakışkan kanalların şematik bir gösterimi. Her iki tasarım da iki giriş ve bir çıkış içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Sıcaklık ~-2 °C'ye soğutulduktan sonra mikroakışkan kanalda oluşan THF hidratları. Sunulan tüm kristallerin morfolojisi bir tetrahedrondur; Bununla birlikte, bazı kristaller farklı şekilde yönlendirilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Mikroakışkan bir kanalda tek bir buz kristali etrafında çözelti değişimi sergileyen temsili bir deney. Başlangıçta, çözelti FITC ile etiketlenmiş AFGP1-5 içeriyordu ve buzla adsorbe edilmiş AFGP'ler gözlenmedi. Çözelti AFGP'siz bir çözelti ile değiştirildikten sonra, daha önce buz yüzeyine adsorbe edilmiş proteinler açıkça tespit edildi (sağdaki görüntü). Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Buz yüzeyindeki AFP konsantrasyonunun nicel ve kalitatif bir analizi . (A) Yüksek AFP çözelti konsantrasyonunda (çözelti değişiminden önce) bir buz kristali. (B) AFP çözeltisinden sonra aynı kristal, AFP'siz bir tampon çözeltisi ile değiştirildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C) Bir çözelti değişimi sırasında buz yüzeyindeki (siyah) ve çözeltideki (kırmızı) floresan yoğunluğunun nicel analizi. Yeşil eğri, buz yüzeyinde hesaplanan yoğunluğu temsil eder. Şekil, referans4'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Mikroakışkan kanallardaki tek THF hidrat kristalleri, etraflarındaki çözelti (A, AFGP1-5) veya (B,Safranin  O) ile değiştirildikten sonra değiştirildi. (B) içindeki görüntü referans26'dan çoğaltılmıştır. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, kristal büyümesi ve inhibisyonu hakkında yeni anlayışlar ortaya çıkarmak için mikroakışkan akışın mikroskobik kristallerle kombinasyonunu kullanmak üzere tasarlanmıştır. Milikelvin çözünürlüklü sıcaklık kontrollü soğuk aşama27, mikroakışkan kanalların içinde bulunan tek mikroskobik kristallerin kontrolünü sağlar, böylece etraflarındaki çözeltilerin değişimine izin verir. Mikroakışkan cihazların imalatı standart ve yaygın uygulamalara benzer olsa da17,18, cihazın içindeki kristallerin büyümesi ve erimesi üzerindeki kontrol benzersiz ve yenidir. Bu sistemdeki en kritik bileşen, Peltier termoelektrik soğutucular, numuneye yakın bir yerde bulunan bir termistörden gelen geri bildirim ve geri besleme döngüsünü yöneten yüksek çözünürlüklü bir sıcaklık kontrolörü kullanılarak elde edilen üstün sıcaklık kontrolüdür.

Bir diğer kritik adım, bu işlem sırasında kristaller eriyebileceği veya büyüyebileceği için çözelti değişiminin kendisidir; Bu nedenle, büyümeyi/erimeyi önlemek için çözelti değişimi sırasında sıcaklık ayarlanmalıdır. Mikroakışkan kanallarda kristallerin oluşumu sıvı akışına müdahale eder ve bu sistemin ana zorluğunu oluşturur; Bu nedenle, bu kristallerin büyümesi kontrol edilmelidir. Burada, ters çevrilmiş mikroskop üzerine bir IR lazer (980 nm) monte edildi ve istenmeyen buz / hidrat kristallerini yerel olarak eritmek için kullanıldı28. Böyle bir lazer kullanılamıyorsa, mikroakışkan cihazın metalik konektörleri, cihazın girişindeki / çıkışındaki buzu eritecek ek bir Peltier termoelektrik soğutucu ile ısıtılabilir.

Burada açıklanan yöntem, evde geliştirilen aletleri (soğuk aşama) içerir ve yukarıda belirtilen adımların bazıları zorlu olduğu için eğitim gerektirir. Kristalleri çevreleyen çözeltinin konsantrasyonu, akış amaçlanmadığında bile değişebileceğinden, basit bir kalibrasyon adımı5 , floresan sinyaline dayanarak konsantrasyonun güvenilir bir tahminini sağlayabilir. İstenmeyen akışa (örneğin TH ölçümleri sırasında) bir başka olası çözüm, referans4'te açıklanan mikroakışkan valflerdir.

Bu sistem aynızamanda D2O buzunH2O sıvısındaki büyüme davranışını araştırmak için de kullanıldı, bu da mikroskobik, taraklı buz yüzeylerinin yeni bir fenomenini ortaya çıkardı27. Böylece, mikroakışkanlar, sıcaklık değişimlerine iyi yanıt veren çeşitli kristalin sistemlerin incelenmesinde kullanılabilir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırmanın desteklenmesi için Amerikan Kimya Derneği Petrol Araştırma Fonu Bağışçılarına teşekkür edilir (Hibe numarası 60191-UNI5). Yazarlar, antifriz proteinlerini ve buzu incelemek için mikroakışkan cihazların kullanımına öncülük ettiği için Prof. Ido Braslavsky'ye teşekkür eder. Yazarlar, antifriz protein örnekleri sağladıkları için Prof. Arthur DeVries, Prof. Konrad Meister ve Prof. Peter Davies'e teşekkür etmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,22 mikron filtrelerFisher Scientific
90 derece bükülmüş künt iğneler18 Gauge
Antifriz proteinleri ve antifriz glikoproteinleriBir hediyeReferanslara bakın 5 ve 28
Künt iğneler18 Gauge ve 20 Gauge
Sığır Serumu Albümini (BSA)Sigma-Aldrich
Soğuk algınlığı sahneEv yapımı
Kapak fişleriGlobe Scientific18 X 18 mm, 0,14 mm kalınlık
Cam şırınga
Kızılötesi lazer 980 nmOpto Engine LLC
Ters mikroskop, Eclipse Ti - SNikon
Görünmez bantZımba
tüy bırakmayan mendilKimwipes
Newport 3040 sıcaklık kontrol cihazıNewport
NIS-Elements Görüntüleme YazılımıNikon
Yağ vakum pompasıHarrick Plazma
Plazma temizleyiciHarrick PlazmaPDC-32G
Polidimetilsiloksan (Dow Corning Sylgard 184 Silikon Elastomer kiti)Dow Corning Syglard
Safranine OSigma-AldrichS2255-25G
Safir diskTed Pella Inc16005-1010  25,4 mm çap, 0,3 mm kalınlık
sCMOS Kamera, Neo 5.5Andor
Tetrahidrofuran (THF)Sigma-Aldrich401757-100ML
Tygon Mikroakışkan cihaz için Mikro delikli boruCole-Parmer  0,020 inç kimlik, 0,060 inç dış çap, 100 ft/rulo.
Su sirkülasyonu ve nitrojen gazı için Tygon boruCole-Parmer1/8" Kimlik, 3/16" Od

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. Ice-Binding Proteins and Their Function. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).
  2. Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  3. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  4. Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition. Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).
  5. Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice. Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).
  6. Braslavsky, I., Drori, R. LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations. Journal of Visualized Experiments. (72), e4189(2013).
  7. Ruppel, C. D., Kessler, J. D. The interaction of climate change and methane hydrates. Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).
  8. Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems. Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).
  9. Sa, J. H., et al. Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids. Scientific Reports. 6, 31582(2016).
  10. Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates. Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).
  11. Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by α-Helical Antifreeze Proteins. Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).
  12. Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation. Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).
  13. Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein. Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).
  14. Walker, V. K., et al. Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors. Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).
  15. Gordienko, R., et al. Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates. PloS One. 5 (2), 8953(2010).
  16. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  17. Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device. Journal of Visualized Experiments. (106), e53516(2015).
  18. Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview. Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).
  19. Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. Advances in diagnostic microfluidics. Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).
  20. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4 (3), 032202(2017).
  21. Haleva, L., et al. Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins. Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).
  22. Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties. Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).
  23. Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor. Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).
  24. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  25. Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics. Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526(2014).
  26. Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures. ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).
  27. Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v, Ward, M. D. Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).
  28. Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity. Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Microfluidic CrystallizationIce CrystallizationAntifreeze ProteinsSolution ExchangeCold Stage MicroscopyFluorescence MicroscopySingle Crystal GrowthTemperature ControlTHF Hydrates

İlgili makaleler