Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Tarihsel olarak, aktin ve mikrotübüller, her biri kendi düzenleyici proteinleri, dinamik davranışları ve farklı hücresel konumları olan ayrı varlıklar olarak görülmüştür. Bol miktarda kanıt, aktin ve mikrotübül polimerlerinin, göç, mitotik iğ konumlandırma, hücre içi taşıma ve hücre morfolojisi 1,2,3,4 dahil olmak üzere çok sayıda hücre işlemini yürütmek için gerekli olan fonksiyonel çapraz konuşma mekanizmalarına girdiğini göstermektedir. Bu örneklerin altında yatan çeşitli koordineli davranışlar, bağlantı faktörlerinin, sinyallerin ve fiziksel özelliklerin karmaşık bir dengesine bağlıdır. Bununla birlikte, bu mekanizmaları destekleyen moleküler detaylar hala büyük ölçüde bilinmemektedir, çünkü çoğu çalışma ^1,2,5 seferde tek bir sitoiskelet polimerine odaklanmaktadır.

Aktin ve mikrotübüller ^6,7,8 ile doğrudan etkileşime girmez. Hücrelerde görülen aktin ve mikrotübüllerin koordineli dinamiklerine ek faktörler aracılık eder. Aktin-mikrotübül çapraz hareketini düzenlediği düşünülen birçok protein tanımlanmıştır ve^{aktiviteleri tek başına} sitoiskelet polimeri ^1,2 ile ilgili olarak iyi karakterize edilmiştir. Artan kanıtlar, bu tek polimer yaklaşımının, aktin-mikrotübül eşleşme olaylarını 7,8,9,10,11,12,13 sağlayan bazı proteinlerin / komplekslerin ikili işlevlerini gizlediğini göstermektedir. Her iki polimerin de mevcut olduğu deneyler nadirdir ve genellikle tek bir dinamik polimer ve diğer 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18'in statik stabilize edilmiş versiyonuna sahip mekanizmaları tanımlar. . Bu nedenle, aktin-mikrotübül koordine proteinlerinin ortaya çıkan özelliklerini araştırmak için yöntemlere ihtiyaç vardır, bu da sadece her iki dinamik polimeri kullanan deneysel sistemlerde tam olarak anlaşılabilir.

Doğrudan protein etiketleme yaklaşımları, genetik olarak kodlanmış afinite etiketleri ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kombinasyonu, biyomimetik sulandırma sistemlerinde büyük bir başarı ile uygulanmıştır ^{19,20,21,22,23}. Birçok aşağıdan yukarıya şema, hücrelerdeki proteinleri düzenleyen tüm faktörleri içermez. Bununla birlikte, "kapak camı üzerinde biyokimya" teknolojisi, polimer montajı veya sökülmesi için gerekli bileşenler ve motor protein hareketi 5,12,23,24,25,26,27 dahil olmak üzere yüksek mekansal ve zamansal ölçeklerde birçok aktin ve mikrotübül dinamiği mekanizmasını rafine etmiştir. . Burada in vitro aktin-mikrotübül kuplajını araştırmak için minimal bileşenli tek filament yaklaşımı açıklanmaktadır. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen veya yüksek oranda saf saflaştırılmış proteinler, floresan olarak etiketlenmiş proteinler, perfüzyon odaları ile kullanılabilir ve hücre ekstraktları veya sentetik sistemler içeren daha karmaşık şemalara genişletilebilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen Tau proteini, bir aktin-mikrotübül eşleşme proteininin varlığında sitoiskelet dinamiklerinin nasıl değiştiğini göstermek için kullanılır, ancak diğer varsayılan aktin-mikrotübül koordinasyon faktörlerinin yerine geçebilir. Bu sistemin diğer yaklaşımlara göre en büyük avantajı, bir reaksiyonda çoklu sitoiskelet polimerlerinin dinamiklerini aynı anda izleme yeteneğidir. Bu protokol ayrıca kullanıcılara sitoiskelet polimerlerindeki değişiklikleri ölçmek için örnekler ve basit araçlar sunar. Böylece, protokol kullanıcıları, çeşitli düzenleyici proteinlerin aktin-mikrotübül dinamiklerini nasıl koordine ettiğinin altında yatan mekanizmaları tanımlamak için güvenilir, kantitatif, tek filament çözünürlüklü veriler üretecektir.

1. Kapak kapaklarının yıkanması

NOT: Smith ve ark., 2013^28'e göre kapak kapaklarını yıkayın (24 mm x 60 mm, #1.5).

1. Kapak fişlerini plastik bir slayt posta kabına yerleştirin.
2. Kapakları aşağıdaki çözeltilerde sırayla daldırır ve 30-60 dakika boyunca sonikat yapar, her çözelti arasında ddH 2 O 10kez durulayın: ddH₂O bir damla bulaşık sabunu ile; 0,1 M KOH. Kapakları 6 aya kadar 0 etanol içinde saklayın.
   NOT: Cam yüzeylere sevilmeyen parmaklarla dokunmayın. Bunun yerine forseps kullanın.

2. Kaplama temizlenmiş (24 mm x 60 mm, #1,5) kapaklar mPEG- ve biotin-PEG-silan ile

NOT: Bu protokol, aktin ve mikrotübülleri TIRF görüntüleme düzlemi içinde konumlandırmak için özel olarak bir biyotin-streptavidin sistemi kullanır. Diğer kaplamalar ve sistemler kullanılabilir (örneğin, antikorlar, poli-L-lizin, NEM miyosin, vb.).

1. PEG-silan ve biotin-PEG-silan tozlarının alikotlarını çözün.
2. 
   
   
4. 
   
5. 
   

Yukarıda açıklanan koşullarla (Şekil 1), aktin ve mikrotübül polimerleri görüntü elde edildikten sonraki 2 dakika içinde görünür (ve dinamik) olmalıdır (Şekil 2). Herhangi bir biyokimya tabanlı protokolde olduğu gibi, farklı düzenleyici proteinler veya protein partileri için optimizasyon gerekebilir. Bu nedenlerden dolayı, TIRF açısı ve görüntü pozlamaları, her bir polimeri içeren reaksiyonlarla ilk önce ayarlanır. Bu, depolanan proteinlerin işlevsel olduğunu ve tespit için yeterli etiketli proteinin mevcut olduğunu doğrular. Her zaman gerekli olmasa da (ve burada gerçekleştirilmese de), filmlerin son işlenmesi (yani, arka plan çıkarma, ortalama veya Fourier dönüşümleri) görüntü kontrastını (özellikle mikrotübüllerin) artırmak için kullanılabilir5,25,33. Bu tahlil tarafından sağlanan tek aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerin doğrudan görselleştirilmesi, polimerizasyon parametreleri (yani, çekirdeklenme veya uzama hızı), sökme parametreleri (yani, büzülme oranları veya felaket olayları) ve polimer birlikte hizalama / örtüşme (Şekil 3) dahil olmak üzere, tek başına veya birlikte sitoiskelet bileşeni için çeşitli dinamik önlemlerin nicel olarak belirlenmesini destekler (Şekil 3 ). Ayrıca, bu önlemler Tau gibi düzenleyici ligandların bağlayıcılığını veya etkisini deşifre etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir (Şekil 3). Tek aktin filamentlerin veya mikrotübüllerin birçok ölçümü bir TIRF filminden yapılabilir. Bununla birlikte, kapak kayması kaplaması, pipetleme ve diğer faktörlerdeki farklılıklar nedeniyle, güvenilir ölçümler birden fazla teknik çoğaltma reaksiyonu / filmi de içermelidir.

Mikrotübül dinamiğinin birçok yönü, mikrotübül uzama hızının yanı sıra felaket ve kurtarma olaylarının sıklığı da dahil olmak üzere örnek kimograflardan belirlenebilir (Şekil 3A). Bu sistemde aktin dinamiklerini ölçmek için kimografilerin kullanılması o kadar kolay değildir, çünkü aktin filamentleri mikrotübüllerden daha kıvrımlıdır. Sonuç olarak, aktin filament dinamiklerinin parametreleri, zaman alıcı ve emek yoğun olan elle ölçülür. Çekirdeklenme sayımları, tüm koşullar için tutarlı bir zaman noktasında bulunan aktin filamentlerinin sayısı olarak ölçülür. Bu sayımlar TIRF görüntüleme alanlarında büyük farklılıklar gösterir, ancak birçok replikasyonla veya diğer polimerizasyon testlerinden elde edilen gözlemleri desteklemek için kullanılabilir. Nükleasyon sayımları, deneme koşullarında stabilize edilmiş mikrotübül tohumları yoksa, mikrotübüller için de kullanılabilir. Aktin filament uzama hızları, filamentin zaman içindeki uzunluğu olarak en az dört film karesinden ölçülür. Oran değerleri, bir mikron filament içindeki aktin monomerlerinin sayısını hesaba katmak için mikromolar aktin başına 370 alt birimlik bir düzeltme faktörü ile aktarılır (Şekil 3B)32. Aktin ve mikrotübüller arasındaki koordineli davranışları tanımlamak için ölçümler daha az iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, çizgi taramaları (Şekil 3C) veya örtüşen yazılım 5,11,34 dahil olmak üzere her iki polimerin tesadüfünü ölçmek için korelasyon analizleri uygulanmıştır.

Veri Kullanılabilirliği:
Bu çalışmayla ilişkili tüm veri kümeleri Zenodo'ya yatırılmıştır ve makul bir taleple şu adresten temin edilebilir: 10.5281/zenodo.6368327.

Şekil 1. Deneysel şemalar: görüntü elde etmek için akış odası montajı. (A) Görüntüleme odası tertibatı. Yukarıdan aşağıya: IBIDI görüntüleme odaları perfüzyon kuyucukları boyunca bantlanır (okla gösterilir); ikinci (beyaz) bant destek tabakası (kullanıcıları daha iyi yönlendirmek için gösterilen resimde solda) çıkarılır ve perfüzyon odasının (ok) kenarına Epoksi uygulanır. Not: Kullanıcıları epoksinin nereye yerleştirileceğini daha kolay yönlendirmek için, beyaz destek bu görüntüde açık bırakılmıştır. Temizlenmiş ve kaplanmış kapak kayması, kaplama tarafı perfüzyon kuyusunun içine bakacak şekilde görüntüleme odasına tutturulur. (B) Biyotin-streptavidin bağlantıları için görüntüleme odalarının koşullandırılmasına yönelik adımları gösteren akış şeması. (C) Dinamik mikrotübüllerin ve aktin filamentlerinin TIRF filmlerini elde etmek için kullanılan reaksiyon örnekleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Tau'nun yokluğunda veya varlığında büyüyen aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerin görüntü dizileri. 250 nM Tau'nun yokluğunda (A) veya varlığında (B) 0,5 μM aktin ( Alexa-647-aktin ve %0,09 biyotin-aktin etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 HiLyte-488 etiketli) içeren TIRF tahlillerinden hızlandırılmış görüntü montajı. Reaksiyon başlangıcından (Tüp A ve Tüp B'nin karıştırılması) geçen süre gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Mikrotübüllerin ve aktin filament dinamiklerinin örnek ölçümleri. (A) Tübülin kanalının ortalama zaman projeksiyonu, kimograf grafikleri oluşturmak için kullanılan çizgi taramaları için toplam mikrotübül uzunluklarını verimli bir şekilde görselleştirir. Siyah noktalı çizgiler, sağda gösterilen dinamik mikrotübüllerin iki örnek kimografına karşılık gelir. Mikrotübüllerin büyümesi (düz siyah çizgiler) ve sökme fazları (noktalı pembe çizgiler; pembe oklarla gösterilen ikisi) her kimografta gösterilir. Zaman ölçeği çubuğu, 3 dk. Uzunluk ölçeği çubuğu, 10 μm. Reaksiyon 0,5 μM aktin ( 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 488-HiLyte etiketi) içerir. Sadece tübülin kanalı gösterilir. (B) Aktif olarak polimerize olan tek aktinli filamentleri gösteren iki örnek hızlandırılmış görüntü montajı. Uzama oranları, mikromolar aktin başına zaman içinde aktin filamentlerinin uzunluğunun grafiklerinin eğimi olarak hesaplanır. Bu nedenle, tipik olarak 1 μM aktin konsantrasyonunda belirlenen oranlar için karşılaştırma için 0.5 μM aktin reaksiyonlarına iki düzeltme faktörü uygulanmalıdır. Beş filamentten örnekler sağda gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 10 μm. Reaksiyon 0,5 μM aktin ( 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 488-HiLyte etiketi) içerir. Sadece aktin kanalı gösterilir. (C) Dinamik mikrotübüllerin (MT) (yeşil) ve aktin filamentlerinin (mor) yokluğunda (solda) veya varlığında (ortada) polimerize olan TIRF görüntüleri. Mavi noktalı çizgiler ve oklar, her koşula karşılık gelen çizgi tarama grafikleri için bir çizginin çizildiği yeri işaretler (her görüntünün altında). Mikrotübüller ve aktin bölgeleri arasındaki örtüşme (siyah olarak gösterilir), alan başına belirli bir zaman noktasında (sağda) puanlanabilir. Ölçek çubukları, 25 μm. Reaksiyonlar, 250 nM Tau ile veya 250 nM Tau olmadan 0.5 μM aktin (% 10 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (% 4 488-HiLyte etiketi) içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Açıklanacak çıkar çatışması yoktur.