Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Summary

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Abstract

Geleneksel olarak, aktin ve mikrotübül sitoiskeletleri, belirli hücresel bölgeler veya süreçlerle sınırlı ayrı varlıklar olarak incelenmiş ve her polimer için benzersiz olan farklı bağlayıcı protein paketleri tarafından düzenlenmiştir. Birçok çalışma, her iki sitoiskelet polimerinin dinamiklerinin iç içe geçtiğini ve bu çapraz konuşmanın çoğu hücresel davranış için gerekli olduğunu göstermektedir. Aktin-mikrotübül etkileşimlerinde yer alan bir dizi protein zaten tanımlanmıştır (yani, Tau, MACF, GAS, forminler ve daha fazlası) ve yalnızca aktin veya mikrotübüller açısından iyi karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, nispeten az sayıda çalışma, her iki polimerin dinamik versiyonlarıyla aktin-mikrotübül koordinasyonunun tahlillerini göstermiştir. Bu, aktin ve mikrotübüller arasındaki acil bağlantı mekanizmalarını tıkayabilir. Burada, toplam bir iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi tabanlı in vitro sulandırma tekniği, hem aktin hem de mikrotübül dinamiklerinin tek bir biyokimyasal reaksiyondan görselleştirilmesine izin verir. Bu teknik, aktin filament veya mikrotübüllerin polimerizasyon dinamiklerini ayrı ayrı veya diğer polimerin varlığında korur. Ticari olarak temin edilebilen Tau proteini, klasik bir sitoiskelet çapraz bağlama proteininin varlığında aktin-mikrotübül davranışlarının nasıl değiştiğini göstermek için kullanılır. Bu yöntem, bireysel düzenleyici proteinlerin tek filamentlerin veya daha yüksek dereceli komplekslerin çözünürlüğünde aktin-mikrotübül dinamiklerini nasıl koordine ettiğine dair güvenilir fonksiyonel ve mekanik bilgiler sağlayabilir.

Introduction

Tarihsel olarak, aktin ve mikrotübüller, her biri kendi düzenleyici proteinleri, dinamik davranışları ve farklı hücresel konumları olan ayrı varlıklar olarak görülmüştür. Bol miktarda kanıt, aktin ve mikrotübül polimerlerinin, göç, mitotik iğ konumlandırma, hücre içi taşıma ve hücre morfolojisi 1,2,3,4 dahil olmak üzere çok sayıda hücre işlemini yürütmek için gerekli olan fonksiyonel çapraz konuşma mekanizmalarına girdiğini göstermektedir. Bu örneklerin altında yatan çeşitli koordineli davranışlar, bağlantı faktörlerinin, sinyallerin ve fiziksel özelliklerin karmaşık bir dengesine bağlıdır. Bununla birlikte, bu mekanizmaları destekleyen moleküler detaylar hala büyük ölçüde bilinmemektedir, çünkü çoğu çalışma ^1,2,5 seferde tek bir sitoiskelet polimerine odaklanmaktadır.

Aktin ve mikrotübüller ^6,7,8 ile doğrudan etkileşime girmez. Hücrelerde görülen aktin ve mikrotübüllerin koordineli dinamiklerine ek faktörler aracılık eder. Aktin-mikrotübül çapraz hareketini düzenlediği düşünülen birçok protein tanımlanmıştır ve^{aktiviteleri tek başına} sitoiskelet polimeri ^1,2 ile ilgili olarak iyi karakterize edilmiştir. Artan kanıtlar, bu tek polimer yaklaşımının, aktin-mikrotübül eşleşme olaylarını 7,8,9,10,11,12,13 sağlayan bazı proteinlerin / komplekslerin ikili işlevlerini gizlediğini göstermektedir. Her iki polimerin de mevcut olduğu deneyler nadirdir ve genellikle tek bir dinamik polimer ve diğer 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18'in statik stabilize edilmiş versiyonuna sahip mekanizmaları tanımlar. . Bu nedenle, aktin-mikrotübül koordine proteinlerinin ortaya çıkan özelliklerini araştırmak için yöntemlere ihtiyaç vardır, bu da sadece her iki dinamik polimeri kullanan deneysel sistemlerde tam olarak anlaşılabilir.

Doğrudan protein etiketleme yaklaşımları, genetik olarak kodlanmış afinite etiketleri ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kombinasyonu, biyomimetik sulandırma sistemlerinde büyük bir başarı ile uygulanmıştır ^{19,20,21,22,23}. Birçok aşağıdan yukarıya şema, hücrelerdeki proteinleri düzenleyen tüm faktörleri içermez. Bununla birlikte, "kapak camı üzerinde biyokimya" teknolojisi, polimer montajı veya sökülmesi için gerekli bileşenler ve motor protein hareketi 5,12,23,24,25,26,27 dahil olmak üzere yüksek mekansal ve zamansal ölçeklerde birçok aktin ve mikrotübül dinamiği mekanizmasını rafine etmiştir. . Burada in vitro aktin-mikrotübül kuplajını araştırmak için minimal bileşenli tek filament yaklaşımı açıklanmaktadır. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen veya yüksek oranda saf saflaştırılmış proteinler, floresan olarak etiketlenmiş proteinler, perfüzyon odaları ile kullanılabilir ve hücre ekstraktları veya sentetik sistemler içeren daha karmaşık şemalara genişletilebilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen Tau proteini, bir aktin-mikrotübül eşleşme proteininin varlığında sitoiskelet dinamiklerinin nasıl değiştiğini göstermek için kullanılır, ancak diğer varsayılan aktin-mikrotübül koordinasyon faktörlerinin yerine geçebilir. Bu sistemin diğer yaklaşımlara göre en büyük avantajı, bir reaksiyonda çoklu sitoiskelet polimerlerinin dinamiklerini aynı anda izleme yeteneğidir. Bu protokol ayrıca kullanıcılara sitoiskelet polimerlerindeki değişiklikleri ölçmek için örnekler ve basit araçlar sunar. Böylece, protokol kullanıcıları, çeşitli düzenleyici proteinlerin aktin-mikrotübül dinamiklerini nasıl koordine ettiğinin altında yatan mekanizmaları tanımlamak için güvenilir, kantitatif, tek filament çözünürlüklü veriler üretecektir.

Protocol

1. Kapak kapaklarının yıkanması

NOT: Smith ve ark., 2013^28'e göre kapak kapaklarını yıkayın (24 mm x 60 mm, #1.5).

1. Kapak fişlerini plastik bir slayt posta kabına yerleştirin.
2. Kapakları aşağıdaki çözeltilerde sırayla daldırır ve 30-60 dakika boyunca sonikat yapar, her çözelti arasında ddH 2 O 10kez durulayın: ddH₂O bir damla bulaşık sabunu ile; 0,1 M KOH. Kapakları 6 aya kadar 0 etanol içinde saklayın.
   NOT: Cam yüzeylere sevilmeyen parmaklarla dokunmayın. Bunun yerine forseps kullanın.

2. Kaplama temizlenmiş (24 mm x 60 mm, #1,5) kapaklar mPEG- ve biotin-PEG-silan ile

NOT: Bu protokol, aktin ve mikrotübülleri TIRF görüntüleme düzlemi içinde konumlandırmak için özel olarak bir biyotin-streptavidin sistemi kullanır. Diğer kaplamalar ve sistemler kullanılabilir (örneğin, antikorlar, poli-L-lizin, NEM miyosin, vb.).

1. PEG-silan ve biotin-PEG-silan tozlarının alikotlarını çözün.
2. 
   
   
4. 
   
5. 
   

1. 
   
6. 
   
7. 
   

1. 4. 
      
   5. 
      

2. 2. 
      

1. 1. 2. 
         
   3. 
      
2. 1. 2. 
         
      3. 
         
      4. 
         
   3. 
      
3. 2. 
      

4. 
   

3. 2. 3. 
         

Results

Yukarıda açıklanan koşullarla (Şekil 1), aktin ve mikrotübül polimerleri görüntü elde edildikten sonraki 2 dakika içinde görünür (ve dinamik) olmalıdır (Şekil 2). Herhangi bir biyokimya tabanlı protokolde olduğu gibi, farklı düzenleyici proteinler veya protein partileri için optimizasyon gerekebilir. Bu nedenlerden dolayı, TIRF açısı ve görüntü pozlamaları, her bir polimeri içeren reaksiyonlarla ilk önce ayarlanır. Bu, depolanan proteinlerin işlevsel olduğunu ve tespit için yeterli etiketli proteinin mevcut olduğunu doğrular. Her zaman gerekli olmasa da (ve burada gerçekleştirilmese de), filmlerin son işlenmesi (yani, arka plan çıkarma, ortalama veya Fourier dönüşümleri) görüntü kontrastını (özellikle mikrotübüllerin) artırmak için kullanılabilir5,25,33. Bu tahlil tarafından sağlanan tek aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerin doğrudan görselleştirilmesi, polimerizasyon parametreleri (yani, çekirdeklenme veya uzama hızı), sökme parametreleri (yani, büzülme oranları veya felaket olayları) ve polimer birlikte hizalama / örtüşme (Şekil 3) dahil olmak üzere, tek başına veya birlikte sitoiskelet bileşeni için çeşitli dinamik önlemlerin nicel olarak belirlenmesini destekler (Şekil 3 ). Ayrıca, bu önlemler Tau gibi düzenleyici ligandların bağlayıcılığını veya etkisini deşifre etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir (Şekil 3). Tek aktin filamentlerin veya mikrotübüllerin birçok ölçümü bir TIRF filminden yapılabilir. Bununla birlikte, kapak kayması kaplaması, pipetleme ve diğer faktörlerdeki farklılıklar nedeniyle, güvenilir ölçümler birden fazla teknik çoğaltma reaksiyonu / filmi de içermelidir.

Mikrotübül dinamiğinin birçok yönü, mikrotübül uzama hızının yanı sıra felaket ve kurtarma olaylarının sıklığı da dahil olmak üzere örnek kimograflardan belirlenebilir (Şekil 3A). Bu sistemde aktin dinamiklerini ölçmek için kimografilerin kullanılması o kadar kolay değildir, çünkü aktin filamentleri mikrotübüllerden daha kıvrımlıdır. Sonuç olarak, aktin filament dinamiklerinin parametreleri, zaman alıcı ve emek yoğun olan elle ölçülür. Çekirdeklenme sayımları, tüm koşullar için tutarlı bir zaman noktasında bulunan aktin filamentlerinin sayısı olarak ölçülür. Bu sayımlar TIRF görüntüleme alanlarında büyük farklılıklar gösterir, ancak birçok replikasyonla veya diğer polimerizasyon testlerinden elde edilen gözlemleri desteklemek için kullanılabilir. Nükleasyon sayımları, deneme koşullarında stabilize edilmiş mikrotübül tohumları yoksa, mikrotübüller için de kullanılabilir. Aktin filament uzama hızları, filamentin zaman içindeki uzunluğu olarak en az dört film karesinden ölçülür. Oran değerleri, bir mikron filament içindeki aktin monomerlerinin sayısını hesaba katmak için mikromolar aktin başına 370 alt birimlik bir düzeltme faktörü ile aktarılır (Şekil 3B)³². Aktin ve mikrotübüller arasındaki koordineli davranışları tanımlamak için ölçümler daha az iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, çizgi taramaları (Şekil 3C) veya örtüşen yazılım ^5,11,34 dahil olmak üzere her iki polimerin tesadüfünü ölçmek için korelasyon analizleri uygulanmıştır.

Veri Kullanılabilirliği:
Bu çalışmayla ilişkili tüm veri kümeleri Zenodo'ya yatırılmıştır ve makul bir taleple şu adresten temin edilebilir: 10.5281/zenodo.6368327.

Şekil 1. Deneysel şemalar: görüntü elde etmek için akış odası montajı. (A) Görüntüleme odası tertibatı. Yukarıdan aşağıya: IBIDI görüntüleme odaları perfüzyon kuyucukları boyunca bantlanır (okla gösterilir); ikinci (beyaz) bant destek tabakası (kullanıcıları daha iyi yönlendirmek için gösterilen resimde solda) çıkarılır ve perfüzyon odasının (ok) kenarına Epoksi uygulanır. Not: Kullanıcıları epoksinin nereye yerleştirileceğini daha kolay yönlendirmek için, beyaz destek bu görüntüde açık bırakılmıştır. Temizlenmiş ve kaplanmış kapak kayması, kaplama tarafı perfüzyon kuyusunun içine bakacak şekilde görüntüleme odasına tutturulur. (B) Biyotin-streptavidin bağlantıları için görüntüleme odalarının koşullandırılmasına yönelik adımları gösteren akış şeması. (C) Dinamik mikrotübüllerin ve aktin filamentlerinin TIRF filmlerini elde etmek için kullanılan reaksiyon örnekleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Tau'nun yokluğunda veya varlığında büyüyen aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerin görüntü dizileri. 250 nM Tau'nun yokluğunda (A) veya varlığında (B) 0,5 μM aktin ( Alexa-647-aktin ve %0,09 biyotin-aktin etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 HiLyte-488 etiketli) içeren TIRF tahlillerinden hızlandırılmış görüntü montajı. Reaksiyon başlangıcından (Tüp A ve Tüp B'nin karıştırılması) geçen süre gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Mikrotübüllerin ve aktin filament dinamiklerinin örnek ölçümleri. (A) Tübülin kanalının ortalama zaman projeksiyonu, kimograf grafikleri oluşturmak için kullanılan çizgi taramaları için toplam mikrotübül uzunluklarını verimli bir şekilde görselleştirir. Siyah noktalı çizgiler, sağda gösterilen dinamik mikrotübüllerin iki örnek kimografına karşılık gelir. Mikrotübüllerin büyümesi (düz siyah çizgiler) ve sökme fazları (noktalı pembe çizgiler; pembe oklarla gösterilen ikisi) her kimografta gösterilir. Zaman ölçeği çubuğu, 3 dk. Uzunluk ölçeği çubuğu, 10 μm. Reaksiyon 0,5 μM aktin ( 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 488-HiLyte etiketi) içerir. Sadece tübülin kanalı gösterilir. (B) Aktif olarak polimerize olan tek aktinli filamentleri gösteren iki örnek hızlandırılmış görüntü montajı. Uzama oranları, mikromolar aktin başına zaman içinde aktin filamentlerinin uzunluğunun grafiklerinin eğimi olarak hesaplanır. Bu nedenle, tipik olarak 1 μM aktin konsantrasyonunda belirlenen oranlar için karşılaştırma için 0.5 μM aktin reaksiyonlarına iki düzeltme faktörü uygulanmalıdır. Beş filamentten örnekler sağda gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 10 μm. Reaksiyon 0,5 μM aktin ( 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 488-HiLyte etiketi) içerir. Sadece aktin kanalı gösterilir. (C) Dinamik mikrotübüllerin (MT) (yeşil) ve aktin filamentlerinin (mor) yokluğunda (solda) veya varlığında (ortada) polimerize olan TIRF görüntüleri. Mavi noktalı çizgiler ve oklar, her koşula karşılık gelen çizgi tarama grafikleri için bir çizginin çizildiği yeri işaretler (her görüntünün altında). Mikrotübüller ve aktin bölgeleri arasındaki örtüşme (siyah olarak gösterilir), alan başına belirli bir zaman noktasında (sağda) puanlanabilir. Ölçek çubukları, 25 μm. Reaksiyonlar, 250 nM Tau ile veya 250 nM Tau olmadan 0.5 μM aktin (% 10 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (% 4 488-HiLyte etiketi) içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Görselleştirilmiş saflaştırılmış proteinler için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunun kullanılması, sitoiskelet regülasyonunun benzersiz mekanizmalarını incelemek için verimli ve zorlayıcı bir yaklaşım olmuştur 5,23,24,25,26,27,35. Geleneksel biyokimyasal analizlerle karşılaştırıldığında, TIRF reaksiyonları çok küçük hacimler (50-100 μL) gerektirir ve sitoiskelet dinamiklerinin nicel ölçümleri bireysel bir tahlilden toplanabilir. Sitoiskelet dinamiği üzerine yapılan çalışmaların çoğu, tek bir polimer sistemine (yani, aktin filamentleri veya mikrotübüller) odaklanır, bu nedenle tipik olarak hücrelerde görülen aktin filamentleri ve mikrotübüller arasındaki çapraz konuşma veya ortaya çıkan davranışların ayrıntılı ölçümleri, test tüpünde özetlenmesi zor ve zor kalmıştır. Bu sorunu çözmek için, bu protokol, aynı biyokimyasal reaksiyonda dinamik aktin ve mikrotübül polimerlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayan tek filamentli bir TIRF mikroskopi sistemini tanımlamaktadır. Böylece, bu yöntem tek başına aktin filamentlerinin veya mikrotübüllerin dinamik davranışını özetleyen geleneksel testlerin ötesine geçer. Bu teknik, bir sitoiskelet bağlantı faktörünün varlığında birkaç dinamik özelliğin nasıl değiştiğine bir örnek olarak Tau ile de gerçekleştirildi. Bu protokol, MACF, GAS, forminler ve daha fazlası dahil (ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere) aktin veya mikrotübül dinamiklerini koordine ettiği bilinen veya şüphelenilen ek proteinlerle kullanılabilir. Son olarak, sağlanan örnek analizler, bu protokolle elde edilen verileri ölçmek için bir rehber olarak kullanılabilir.

"Görmek inanmaktır", mikroskopi tabanlı tahliller yapmak için zorlayıcı bir nedendir. Bununla birlikte, TIRF mikroskopi deneylerinin yürütülmesinde ve yorumlanmasında dikkatli olunması gerekmektedir. Sitoiskelet birlikte montaj testlerinin en büyük zorluklarından biri, yaygın olarak kullanılan birçok görüntüleme koşulunun her polimerle uyumlu olmamasıdır. Mikrotübüller ve aktin tipik olarak polimerizasyon için farklı tampon, sıcaklık, tuz, nükleotid ve konsantrasyon gereksinimlerine sahiptir. Aktin, tübülin, ilgili düzenleyici proteinler ve bu protokolde kullanılan tamponlar donma-çözülme döngülerine duyarlıdır. Bu nedenle, bu protokolü başarılı bir şekilde yürütmek için proteinlerin ve tamponların dikkatli bir şekilde kullanılması gerekir. Bu endişelerin çoğunu hafifletmek için, taze geri dönüştürülmüş tübülin (<6 hafta boyunca dondurulmuş) kullanılması ve ultrasantrifüjleme yoluyla dondurulmuş / yeniden askıya alınmış aktinlerin önceden temizlenmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu hususlar, bu prosedürle değerlendirilecek sayısız düzenleyici protein için de geçerlidir; bunlar donma-çözülme döngülerine veya tampon tuzlarının konsantrasyonuna duyarlı olabilir ^5,11,36.

Ne yazık ki, deneysel ödünleşimler olmadan tek bedene uyan tüm tamponlar mevcut değildir. Daha düşük konsantrasyonlu proteinler için daha fazla hacim elde etmek için, ATP ve GTP 2x TIRF tampon çözeltisine dahil edilebilir (Şekil 1C). Bununla birlikte, bu nükleotidler donma-çözülme döngülerine karşı son derece hassas olduklarından, tavsiye edilmez. Burada kullanılan oksijen süpürücü bileşikler (yani, katalaz ve glikoz-oksidaz), proteinleri uzun süre (dakikalar ila saatler) görselleştirmek için gereklidir, ancak mikrotübül polimerizasyonunu yüksek konsantrasyonlarda kısıtladığı bilinmektedir⁵. Bu tampon hususlarla ilgili olarak, bu protokolün bir sınırlaması, bazı kanonik mikrotübül ile ilişkili düzenleyici proteinlerin, hücrelerde bulunan işlevleri veya tahlilleri tek başına mikrotübülleri kullanarak (aktin olmadan) özetlemek için az ya da çok tuz gerektirebilmesidir. Bu endişeleri gidermek için tuzun doğasını veya konsantrasyonunu değiştirmek, aktin filament polimerizasyon oranlarını ve / veya mikrotübül dinamiklerinin parametrelerini muhtemelen etkileyecektir. Çoklu tanımlayıcı parametrelerin ölçümleri (minimum, çekirdeklenme, uzama oranları ve stabilite) (Şekil 3), protokol başarısını doğrulamak veya spesifik tamponların veya düzenleyici proteinlerin etkilerini açıkça belgelemek için gereklidir. Örneğin, çok fazla aktin filament polimerizasyonu, aktin-mikrotübül eşleşme olaylarını saniyeler içinde gizleyebilir. Sonuç olarak, aktinin genel konsantrasyonunu düşürerek veya aktin nükleasyonunu (yani profilin) baskılamak için ek proteinler ekleyerek deneysel koşullara ince ayar yapmak, koordineli aktin-mikrotübül aktivitelerinin açıkça görülebildiği genel süreyi uzatacaktır. Bu önkoşulları ele alan denetimler ve teknik çoğaltmalar (birden çok görüş alanının ötesinde), kullanıcıların güvenilir ve yeniden üretilebilir sonuçlar üretmesi için kritik öneme sahiptir.

Hücre bazlı çalışmalar, doğrudan protein-protein ilişkilerini veya düzenleyici komplekslerin etkisini gözlemlemek için sınırlı fırsat sağlar. Buna karşılık, in vitro tahlillerden toplanan mekanizmaların bazıları her zaman hücrelerde görülen proteinlerin kesin davranışlarını yansıtmaz. Bu klasik biyokimyacı ikilemi bu tekniğin gelecekteki uygulamalarında spesifik modifikasyonlarla ele alınabilir. Örneğin, fonksiyonel floresan olarak etiketlenmiş kuplaj proteinlerinin eklenmesi, bu yöntemi tek filament çalışmalarından tek moleküllü çalışmalara genişletir. Tahliller, hücre benzeri fenomenleri özetlemek için gereken "eksik" bilinmeyen anahtar faktörleri ekleyebilecek hücre ekstraktlarını kullanmak için daha da değiştirilebilir. Örneğin, maya veya Xenopus ekstraktlarını kullanan TIRF bazlı testler, kontraktil aktomiyozin halkaları 37, mitotik iğler 26,38, aktin veya mikrotübül düzeneğinin bileşenleri^39,40 ve hatta sentrozom ve kinetochores ^{36,41,42,43'teki} dinamikleri yeniden yapılandırmıştır. . Dahası, bu tür sistemler, lipitlerin veya sinyal faktörlerinin mevcut olduğu yapay hücre sistemlerine giden yolu açabilir^44,45,46.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
%1 BSA (w/h)	Fisher Scientific	BP1600-100	Bu amaçla (TIRF odalarını bloke ederek), BSA ddH20'da yeniden askıya alınır ve 0.22 & mikro; m filtresi.
1&kez; BRB80	Ev yapımı		80 mM BORULAR, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 KOH
ile 10 mg / mL (1000 U) glikoz oksidaz	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	G2133-50KU	Katalaz ile birlikte, alikot ve -80 o< / sup>C'de
100 & mikro kullanıma kadar saklayın; M tubulin	Cytoskeleton Inc, Denver, CO	T240	Ev yapımı tübülinler, polimerizasyona yetersiz tübülini çıkarmak için kullanılmadan önce geri dönüştürülmelidir (Hyman ve ark. (1992)29; Li ve Moore (2020)30). Ticari olarak temin edilebilen tübülinler genellikle geri dönüştürülemeyecek kadar seyreltiktir, ancak üreticiye göre yeniden askıya alındığında iyi işlev görür. talimatlar ve kullanımdan önce 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleme (278.000 & kez; g) ile önceden temizlenmiştir.
100 mM ATP	Altın Biyoteknoloji A.Ş., Olivette, MO	A-081	dd< / sub>H < sub>2< / sub>0 (pH 7.5) içinde yeniden askıya alındı ve filtre sterilize edildi.
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	1 kez yeniden askıya alındı; BRB80 (pH 6.8) ve filtre sterilize edilmiştir.
120-150 mW katı hal lazerleri	Leica Microsystems	11889151; 11889148
2 mg / mL katalaz	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	C40-100	Glikoz oksidaz ile birlikte, alikot ve -80 o< / sup>C'de 2 kez kullanıma kadar saklayın
; TIRF tamponu	Ev yapımı		2 kez; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glikoz, %0,5 (h/h) metilselüloz (4.000 cp); Not: 1 & 0.1M GTP ve 1 & mikro L; Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için TIRF reaksiyonlarına ayrı olarak eklenen L 0.1M ATP.
24 & kez; 60 mm, # 1.5 kapak camı	Fisher Scientific, Waltham, MA	22-266882	Kapak camı kullanımdan önce iyice yıkanmalıdır (Smith ve ark. (2014)22)
37 oC ısı bloğu
37 oC su banyosu
5 mg/mL Streptavidin (600x stok)	Avantor, Philadelphia, PA	RLS000-01	Tris-HCl'de (pH 8.8) yeniden askıya alındı; alikotu 1 kez seyreltin; kullanım gününde HEK tamponunda
5 dk Epoksi reçine ve sertleştirici	Loctite, Rocky Hill, CT	1365736	Kombine reçine ve sertleştiricinin kürlenmesi 30 dakika kadar sürebilir.
% 50 biyotinillenmiş-GpCpp mikrotübül tohumları	Cytoskeleton Inc; Ev yapımı	T333P	(isteğe bağlı) GppCpp veya Taxol stabilize mikrotübül tohumları, mikrotübül polimerizasyonuna daha verimli bir şekilde aracılık edebilir. Taxol ve GppCpp, mikrotübül kafes yapısını ve belirli düzenleyici proteinlerin mikrotübülün stabilize edilmiş kısmına bağlanma yeteneğini etkileyebilecek farklı şekillerde mikrotübülleri stabilize eder. Çeşitli mikrotübül tohumları yapmak için bir yöntem Hyman ve ark. (1992).
70 oC inkübatör
Aktin karışımı stok	Ev yapımı; bu protokol		A 12.5 & mikro; Altı reaksiyona kadar etiketli (floresan ve biyotinillenmiş) ve etiketlenmemiş aktinden oluşan M aktin karışımı. 2 ve mikro; Son TIRF reaksiyonunda L stok kullanılır. Her reaksiyonda kullanılan son aktin konsantrasyonu 0.5 &'dir; M (%10 Alexa-647; %0,09 biyotin etiketli).
Uygun tampon kontrolleri	Ev yapımı		Değerlendirilen tüm proteinlerden elde edilen tamponların kombinasyonu
Biotin-PEG-silan (MW 3,400)	Laysan Bio Inc	biotin-PEG-SIL-3400	2-5 mg alikotlara dağıtılır, nitrojenle doldurulur, parafilme alınır ve kullanıma kadar kurutucu ile -20 o< / sup>C'de saklanır
Biyotinile aktin	Hücre İskeleti A.Ş; Ev yapımı	AB07	Biotin-actin, lizin kalıntıları üzerinde etiketleme ile yapılır ve bu nedenle en az% 100 etiketli olduğu varsayılır, ancak farklı lotlar / preparatlara göre değişir. Optimal biyotinile aktin konsantrasyonları, belirli kullanımlar/deneysel tasarımlar için ampirik olarak belirlenmelidir. Daha yüksek konsantrasyonlar daha verimli izlemeye izin verir, ancak polimerizasyonu veya düzenleyici proteinlerle etkileşimleri engelleyebilir. Burada, son TIRF reaksiyonunda küçük bir yüzde (% 0.09 veya 900 pM) biyotinile aktin bulunur.
Bulaşık Sabunu	Şafak, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		Bilinmeyen nedenlerden dolayı, mavi versiyon lamelleri mevcut diğer renklerden daha verimli bir şekilde temizler.
Kuru buz
FIJI Yazılımı	www.https://imagej.net/software/fiji/downloads		Schneider ve ark. (2012)31.
Floresan etiketli aktin	Hücre İskeleti, Inc; Ev yapımı	AR05	Ev yapımı floresan etiketli aktin, -20 oC'de %50 gliserol ile desteklenmiş G-tamponunda saklanır (Spudich ve ark. (1971)47; Liu ve ark. (2022)48). Floresan etiketli aktin, G-tamponuna karşı diyalize edilir ve 278.000 > kullanmadan önce g.
Floresan etiketli tübülin	Hücre İskeleti Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	20 & mikroda yeniden askıya alındı; L 1 ve kez; BRB80 (10 ve mikro; M nihai konsantrasyonu) ve kullanımdan önce 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleme (278.000 & kez; g) ile önceden temizlenir.
G-tampon	Ev yapımı		3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Tampon	Ev Yapımı		20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Buz
Buz kovası
Görüntüleme odaları	IBIDI, Fitchburg, WI	80666	Farklı lamel kaplamaları kullanmak için tabanı olmayan hazneler sipariş
iXon Life 897 EMCCD kamera	Andor, Belfast, Kuzey İrlanda	8114137
LASX Premium mikroskop yazılımı	Leica Microsystems	11640611
Metilselüloz (4.000 cp)	Sigma Aldrich Inc	M0512
TIRF modülü ile donatılmış mikroskop tabanı	Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya
mPEG-silan (MW 2,000)	Laysan Bio Inc, Arab, AL	mPEG-SIL-2000	10-15 mg alikotlara dağıtılır, nitrojenle doldurulur, parafilme alınır, kapalı ve -20 oC'de kullanıma kadar kurutucu ile saklanır
Objektif ısıtıcı ve ısıtmalı kademe eki	OKO labs, Pozzioli, İtalya	8113569	Sıcaklık kontrollerini 35-37 oC'ye ayarlayın. Doğru kalibrasyon için üretici önerilerini kullanın.
Perfüzyon pompası	Harvard Aparatı, Holliston, MA	704504	Bir şırınga ve hortum ikame edilebilir.
Petri Kabı, 100 x 15 mm	Genesee Scientific, San Diego, CA	32-107
Plastik sürgülü posta kabı	Fisher Scientific	HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0,12 mm kalınlık	Grace Biolabs, Bend, OR	620001	Hassas üretilmiş boyutlarda çift taraflı bant şiddetle tavsiye edilir.
Küçük strafor konteyner	Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık		Nakliyeden yeniden kullanıldı
Küçük kantar Fisher	Scientific	02-202-100
Spektrofotometre
Tau	Hücre İskeleti Inc	TA01	Tau'nun ticari olarak temin edilebilen preparatında Tau'nun üç izoformu mevcuttur. Bu protokoldeki konsantrasyon, en yüksek moleküler ağırlık bandından (14.3 & M, üretici başına yeniden askıya alındığında' 50 & ile S önerileri; ddH20) L.
Sıcaklık 63 kez düzeltildi; Plan Apo 1.47 N.A. yağa daldırma TIRF hedefi	Leica Microsystems	11506319
Tubulin stoğu	Ev yapımı; Bu protokol		7.2 & mikrodan oluşan bir tübülin stoğu; L geri dönüştürülmüş 100 & M etiketsiz tübülin ve 3 &mikro; L / 10 & M, ticari olarak temin edilebilen floresan etiketli tübülini yeniden askıya aldı. Reaksiyon başına bir tübülin stoğu kullanılır ve buz üzerinde çözülür/saklanır. Her reaksiyondaki son serbest tübülin konsantrasyonu 15 &'dir; M (%4 etiketli). 15'ten fazla ve mikro; M tübülin, hiperstabilize (dinamik olmayan) mikrotübüllere neden olurken, 7.5 & altındaki konsantrasyonlar; M serbest tübülin iyi polimerize olmaz. Protein konsantrasyonunun dikkatli bir şekilde belirlenmesi ve kullanılması gereklidir.
Etiketsiz aktin (koyu)	Hücre İskeleti, Inc; Ev yapımı	AKL99	Aktin nükleatları hemen hemen her zaman ticari olarak temin edilebilen (liyofilize) veya donmuş aktinlerde bulunur ve kantitatif ölçümlerde değişkenliğe katkıda bulunur (Spudich ve diğerleri (1971)47; Liu ve ark. (2022)48). Tavşan kası aktini, -80 o< / sup>C'de G-tamponunda saklanır ve 278.000 & kez 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleme yoluyla önceden temizlenir; kullanmadan önce g.  Gün boyunca birkaç aktin stok çözeltisi yapılır (bir seferde altı reaksiyon için fazlasıyla yeterli değildir) şiddetle tavsiye edilir).