Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

6.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64076

⸱

7 Haziran 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.

Özet

Kan-retina bariyerinin (BRB) işlev bozukluğu, sıklıkla retinal ödem ve ardından görme kaybına neden olan çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur. İç kan-retina bariyeri (iBRB) esas olarak fizyolojik koşullar altında düşük geçirgenliğe sahip retinal vasküler endotelden oluşur. Düşük geçirgenliğin bu özelliği, bitişik retinal mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki düşük parasellüler taşıma oranları ve ayrıca bunlar aracılığıyla transsellüler transport (transsitoz) ile sıkı bir şekilde düzenlenir ve korunur. Retinal transsellüler bariyer geçirgenliğinin değerlendirilmesi, sağlık ve hastalıkta iBRB bütünlüğü hakkında temel bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) kullanarak iBRB geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro bir model olarak endotel hücresi (EC) transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör ve kaveola aracılı transsellüler transport süreçlerinde transferrin ve yaban turpu peroksidazını (HRP) taşıma yeteneğini değerlendirir. Gözenekli membran üzerinde kültürlenen tam akışkan HRMEC'ler, EC monokatmanındaki transsitoz seviyelerinin göstergesi olarak, alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerini ölçmek için floresan etiketli transferrin (klatrin bağımlı transsitoz) veya HRP (kaveola aracılı transsitoz) ile inkübe edildi. iBRB'yi düzenleyen bilinen bir yol olan Wnt sinyali, kaveola aracılı HRP bazlı transsitoz testi yöntemini göstermek için modüle edildi. Burada açıklanan EC transsitoz testi, vasküler patolojilerde EC geçirgenliğinin ve iBRB bütünlüğünün moleküler düzenleyicilerini araştırmak ve ilaç dağıtım sistemlerini taramak için yararlı bir araç sağlayabilir.

Giriş

İnsan retinası, vücuttaki en yüksek enerji gerektiren dokulardan biridir. Nöral retinanın düzgün çalışması, retinal çevreyi korumak için kan-retinal bariyer (BRB) aracılığıyla aracılık edilen diğer potansiyel olarak zararlı moleküllerin sınırlı bir akışı ile birlikte verimli bir oksijen ve besin kaynağı gerektirir1. Merkezi sinir sistemindeki kan-beyin bariyerine (BBB) benzer şekilde, BRB gözde seçici bir bariyer görevi görür ve iyonların, suyun, amino asitlerin ve şekerin retinanın içindeki ve dışındaki hareketini düzenler. BRB ayrıca bağışıklık hücreleri, antikorlar ve zararlı patojenler gibi dolaşım faktörlerine maruz kalmayı önleyerek retinal homeostazı ve bağışıklık ayrıcalığını korur2. BRB disfonksiyonu, diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), prematüre retinopatisi (ROP), retinal ven tıkanıklığı ve üveit gibi çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur ve vazojenik ödem ve ardından görme kaybına neden olur 3,4,5.

BRB, sırasıyla iki ayrı oküler vasküler ağ için iki ayrı bariyerden oluşur: retina vaskülatürü ve retinanın altındaki federe koryokapillaris. İç BRB (iBRB) esas olarak retinal nöronal tabakaları besleyen retinal mikrovasküler endotel hücrelerinden (RMEC'ler) oluşur. Öte yandan, retinal pigment epiteli, nörosensoriyel retina ve koryokapillaris2 arasında yer alan dış BRB'nin ana bileşenini oluşturur. iBRB için, RMEC'ler arasında moleküler taşıma hem parasellüler hem de hücreler arası yollardan gerçekleşir (Şekil 1). iBRB boyunca yüksek derecede madde seçiciliği, (i) bitişik endotel hücreleri (ECs) arasındaki parasellüler taşımayı kısıtlayan bileşke protein komplekslerinin varlığına ve (ii) endotel hücreleri içindeki düşük transsellüler arası taşıma oranlarını koruyan kaveola mediatörlerinin, taşıyıcılarının ve reseptörlerinin düşük ekspresyon seviyelerine dayanır 1,6,7,8 . Parasellüler akıyı düzenleyen kavşak kompleksleri, suyun ve küçük suda çözünür bileşiklerin geçişine izin veren sıkı kavşaklardan (klodinler, oklüdinler), ader kavşaklardan (VE kadherinler) ve boşluk kavşaklarından (konneksinler) oluşur. Küçük lipofilik moleküller RMEC'lerin iç kısmına pasif olarak yayılırken, daha büyük lipofilik ve hidrofilik moleküllerin hareketi, veziküler transport ve membran taşıyıcıları dahil olmak üzere ATP güdümlü trans-endotel yolları tarafından düzenlenir 5,9.

Veziküler transsitoz, kaveolin aracılı kavooler transsitoz, klatrin bağımlı (ve reseptör aracılı) transsitoz ve klatrin bağımsız makropinositoz olarak sınıflandırılabilir (Şekil 2). Bu veziküler taşıma işlemleri, makropinozomlar en büyük (200-500 nm arasında değişen) ve kaveoller en küçüğü (ortalama 50-100 nm) olan farklı büyüklükteki vezikülleri içerirken, klatrin kaplı veziküller 70-150 nm10 arasında değişmektedir. Kaveolalar, esas olarak lipit membran kolesterolünü ve diğer yapısal ve sinyal proteinlerini kaveolin-iskele alanları 11 aracılığıyla bağlayan kaveolin-1'den oluşan bir protein kaplaması ile şişe şeklinde lipit bakımından zengin plazma membran invaginasyonlarıdır11. Kaveolinler, plazma zarı12'de kaveola stabilizasyonunu teşvik etmek için periferik olarak bağlı kavain ile birlikte çalışır. Kaveoler membranlar ayrıca endotel hücreleri arasındaki hareketlerine yardımcı olmak için insülin, albümin ve yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) dahil olmak üzere dolaşımdaki lipoproteinler gibi diğer moleküller için reseptörler taşıyabilir13. Gelişim sırasında, fonksiyonel BRB oluşumu EC transsitoz8'in baskılanmasına bağlıdır. Bu nedenle, olgun retinal endotel, fizyolojik koşullar altında diğer endotel hücrelerine göre nispeten düşük seviyelerde kaveola, kaveolin-1 ve albümin reseptörlerine sahiptir ve bariyer özelliklerine katkıda bulunur 4,9.

iBRB parçalanması birçok patolojik göz rahatsızlığının önemli bir özelliği olduğundan, retinal vasküler geçirgenliği in vivo ve in vitro olarak değerlendirmek için yöntemler geliştirmek esastır. Bu yöntemler, tehlikeye atılmış BRB bütünlüğünün mekanizmaları hakkında olası bilgiler sağlamaya ve potansiyel terapötik hedeflerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur. Mevcut in vivo görüntüleme veya kantitatif vasküler kaçak tahlilleri tipik olarak floresan (sodyum floresein ve dekstran), kolorimetrik (Evans Blue boya ve yaban turpu peroksidaz [HRP] substratı) veya radyoaktif izleyiciler14 kullanarak vaskülatürden mikroskop görüntüleme ile veya izole doku lizatında çevredeki retinal dokulara ekstravazasyonu tespit eder. Vasküler bütünlüğü ölçmek için ideal bir izleyici, sağlıklı ve sağlam kılcal damarlarla sınırlıyken tehlikeye girmiş damarlara serbestçe nüfuz edecek kadar inert ve büyük olmalıdır. Canlı fundus floresein anjiyografide (FFA) sodyum floresein veya floresein izotiyosiyanat-konjuge dekstran (FITC-dextran) veya izole retinal düz montajlarda kullanılan yöntemler, retinal ekstravazasyonun in vivo veya ex vivo olarak ölçülmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. FITC-dextran, boyut seçici çalışmalar için 4-70 kDa arasında değişen farklı moleküler ağırlıklarda bulunma avantajına sahiptir15,16,17. FITC-albümin (~ 68 kDa), vasküler sızıntı çalışmaları için biyolojik açıdan uygun alternatif bir büyük boyutlu protein izleyicisidir18. İntrakardiyalolarak 19, retro-orbital veya kuyruk damarı 20 yoluyla enjekte edilen Evans Blue boyası, çoğunlukla spektrofotometrik tespit veya daha az yaygın olarak, düz montajlarda floresan mikroskobu ile ölçülebilen büyük bir molekül oluşturmak için endojen albümin ile bağlanmasına da dayanır20,21. Bununla birlikte, bu kantitatif veya hafif görüntüleme metodolojileri genellikle parasellüler transportu trans-endotelyal transporttan ayırmaz. Transsitozlu veziküllerin ultrastrüktürel görselleştirmesi ile transsitozun spesifik analizi için, HRP gibi izleyici moleküller tipik olarak bir elektron mikroskobu22,23,24 altında gözlemlenebilen endotel hücreleri içindeki transsitozlu vezikülleri bulmak için kullanılır (Şekil 3A-C).

Endotel hücre geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro iBRB modellerinin geliştirilmesi ve kullanılması, in vivo deneyleri tamamlamak ve vasküler sızıntının moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasına yardımcı olmak için sağlam ve yüksek verimli bir değerlendirme sağlayabilir. Sıkı kavşakların parasellüler transportunu ve bütünlüğünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan testler arasında trans-endotelyal elektriksel direnç (TEER), iyonik iletkenlik ölçüsü (Şekil 4) 2,25 ve küçük moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler kullanılarak in vitro vasküler sızıntı testi26 bulunmaktadır. Ek olarak, klatrin bağımlı transsitoz27'yi araştırmak için BBB'yi modelleyen transferrin bazlı transsitoz tahlilleri kullanılmıştır. Buna rağmen, BRB'yi ve daha spesifik olarak retinal EC kaveoler transsitozunu in vitro olarak değerlendirmek için yapılan testler sınırlıdır.

Bu çalışmada, iBRB geçirgenliğini ve EC transsitozunu belirlemek için in vitro model olarak insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin (HRMEC'ler) kullanıldığı bir EC transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör aracılı veya kaveola bağımlı transsitoz yolları aracılığıyla transferrin veya HRP'yi taşıma yeteneğine dayanır (Şekil 2). Apikal odada (yani filtre ekinde) tam akıcılığa kadar kültürlenmiş HRMEC'ler, sadece EC transsitozu yoluyla alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerine karşılık gelen floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan konjuge transferrin (Cy3-Tf) veya HRP ile inkübe edildi. Hücre tek katmanının akıcılığı, sıkı bağlantı bütünlüğünü gösteren TEER ölçülerek doğrulanabilir25. TEER ve transsitoz testi tekniğini göstermek için, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)28 ve Wnt sinyallemesindekiler (Wnt ligandları: Wnt3a ve Norrin)29 dahil olmak üzere vasküler geçirgenlik ve EC transsitozunun bilinen moleküler modülatörleri kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ışık mikroskobu ve EM görüntülerinin oluşturulması için onaylanmıştır (Şekil 3). İn vivo çalışmalar için protokoller Wang ve ark.24'ten elde edilebilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) içeren tüm deneyler, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktiflerin Hazırlanması

  1. Doku kültürü kabının kaplanması için çözelti: 500 mL steril doku kültürü sınıfı 1x PBS'de (pH = 7.4) 1 mL jelatin stok çözeltisini (% 40 -% 50) çözerek% 0.1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden süzün. % 0.1 jelatin çözeltisini 2-8 ° C'de saklayın. Söz konusu sıcaklıkta steril bir durumda belirsiz bir süre saklanabilir.
  2. Büyüme ortamı: EGM takviyelerini üreticinin talimatlarına göre endotel hücre büyüme bazal ortamına (EBM) çözerek 500 mL endotel hücre büyümesi tam ortamı (EGM) hazırlayın (Malzeme Tablosu). Aliquot büyüme ortamı 50 mL tüplere dönüşür ve tüpleri 4 ° C'de saklar. Büyüme ortamının raf ömrü 4 °C'de 12 aydır.
  3. Tripsin çözeltisi:% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi için, stok şişesinden 50 mL tüplere aliquot yapın ve 4 ° C'de (2 haftaya kadar) veya -20 ° C'de (24 aya kadar) saklayın.

2. HRMEC'lerin Kültürlenmesi

  1. İlk hücre kültürü
    1. Laminer akış davlumbazının altında 5 mL %0,1 jelatin çözeltisi içeren Petri haznelerini (100 mm çap x 20 mm yükseklik) kaplayın ve homojen kaplama için oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca davlumbazda bozulmadan tutun.
      NOT: Bulaşıkların jelatin kaplaması hücre bağlantısını arttırır. Alternatif olarak, jelatin kaplı T75 kültür şişeleri de kullanılabilir.
    2. Hücreleri tohumlamadan önce, bir vakum pompası kullanarak jelatin çözeltisini aspire edin. Kullanılan aspiratörün vakum basıncı 724 mmHg'ye kadar çıktı.
      NOT: Kaplama çözeltisinin kurumasını önlemek için aspirasyon, tohumlama hücrelerinden hemen önce yapılmalıdır.
    3. Dondurulmuş bir HRMEC şişesini (sıvı azotta depolamadan) 37 ° C'de bir su banyosu kullanarak veya şişeye ılık bir büyüme ortamı ekleyerek çözün. Çözüldükten sonra, hücre süspansiyonunu 9 mL büyüme ortamına aktarın (HRMEC'lerin çözülmüş şişesinin 1 mL olduğu varsayılarak).
      NOT: HRMEC'ler ticari olarak elde edilmiştir (Malzeme Tablosu). Hücrelere eklenen büyüme ortamı, kullanımdan önce daima 37 ° C'ye ısıtılmalıdır.
    4. RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 200 x g'de döndürün ve hücre peletini çıkarmamak için süpernatantı dikkatlice aspire edin.
    5. Hücre peletini 10 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın ve elde edilen süspansiyonu jelatin kaplı bir Petri kabına aktarın. İnkübatördeki hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Tipik olarak, HRMEC'ler 72 saat sonra% 70 -% 80 oranında akıcıdır.
      NOT: Büyüme ortamı her geçen gün değiştirilir.
  2. HRMEC'lerin geçirgen membran uçları üzerindeki alt kültürü
    1. HRMEC'leri tohumlamak için hücre kültürü filtre ekleri (0,4 μm gözenek boyutunda polikarbonat membranlı 6,5 mm'lik kesici uçlar, 24 delikli bir plakaya yerleştirilmiş) hazırlayın ve her bir kesici ucu (apikal oda) laminer bir akış başlığı altında 30 dakika boyunca 200 μL %0,1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Çözeltinin filtre ekinin tüm alt yüzeyini kapladığından emin olun.
      NOT: Her kuyucuk, gözenekli bir membranla ayrılmış apikal ve bazolateral bir odaya sahiptir.
    2. Petri kabını kültürlü HRMEC'lerle (adım 2.1.5.) inkübatörden çıkarın ve büyüme ortamını aspire edin. Potansiyel yüzen / ölü hücrelerden kurtulmak için hücreleri laminer bir akış başlığı altında 10 mL 1x PBS ile 2x hafifçe durulayın.
    3. Hücreleri 0.5-1 mL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve Petri kabını 5 dakika boyunca inkübatöre (37 ° C ve% 5 CO2) yerleştirin.
    4. 4.5-9 mL büyüme ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini söndürün ve hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
    5. RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 200 x g'de döndürün, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 3 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın.
    6. Manuel hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve filtre eki başına 4 x 104 hücre yoğunluğunda tohumlayın (yani, 1.25 x 105 hücre /cm2). Her kesici uç için hücre süspansiyonunun hacmi 250 μL'dir.
    7. Kaplama çözeltisini geçirgen kesici uçlar içeren kuyucuklardan aspire edin ve kesici uç başına hücre süspansiyonunun 250 μL'sini aktarın (apikal oda). Kesici uçlardan birine yalnızca ortam (yani hücreler olmadan) ekleyin ve bu da TEER ölçümü için "boş kontrol" olarak kullanılacaktır. Aynı zamanda, bazolateral odalarda kuyu başına 750 μL ortam ekleyin.
    8. Geçirgen uçlara sahip 24 delikli plakayı, kültürlenmiş hücreler tamamen kaynaşıncaya ve istenen ~20 Ω · cm2 TEER değerine ulaşılana kadar 7-12 gün boyunca inkübatörde (37 ° C ve% 5 CO2) tutun.
    9. Büyüme ortamını her geçen gün değiştirin. Ortam değişimi sırasında, hücre tek katmanının bozulmasını en aza indirmek için ortamı dikkatlice aspire edin ve apikal ve bazolateral odalara sırasıyla kuyucuk başına 250 μL ve 750 μL taze ortam ekleyin.
      NOT: Büyüme ortamı, kuyuların hem apikal hem de bazolateral odaları için değiştirilir.

3. TEER ölçümleri (Şekil 4)

  1. 14. günde hücre tohumlama sonrası (adım 2.2.9.), HRMEC'ler için TEER'yi epitel volt-ohm metre (EVOM) elektriksel direnç (ER) sistemi (Malzeme Tablosu) kullanarak aşağıdaki gibi ölçün.
  2. ER sistemini önceden şarj edin ve STX04 test elektrodunu kullanarak ölçüm cihazının işlevselliğini kontrol edin. Gerekirse kalibre edin.
  3. Elektrodu sayaca bağlayın ve elektrodu önce 15-20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra hücre kültürü EGM büyüme ortamına kısaca batırarak dengeleyin.
  4. Bu arada, sıcaklık dengesi için hücre içeren 24 delikli plakayı RT'deki laminer akış davlumbazında 15-20 dakika tutun.
    NOT: TEER ölçümleri sıcaklıktan etkilenir, bu nedenle dengeleme adımı esastır.
  5. TEER ölçümü için, kuyuların hem apikal (250 μL) hem de bazolateral (750 μL) odalarına taze büyüme ortamı ekleyin.
  6. Elektrotu, kısa uç kesici uçta olacak ve daha uzun uç kuyucuğun dibine değecek şekilde dikkatlice daldırarak TEER ölçümü gerçekleştirin. Önce boş kontrol boyunca direnci ölçün. Her kesici uç için TEER'i üçlü olarak ölçün.
    NOT: Ölçümler arasında elektrodu durulamak için kültür ortamı kullanılır. Sabit okumalar için elektrotun kesici ucun altına 90° açıyla tutulduğundan emin olun.
  7. TEER = net direnç (Ω) x filtre ekinin yüzey alanı (cm2) formülünü kullanarak tek katman boyunca elektrik direncini (Ω·cm2 cinsinden) hesaplayın; burada net direnç, her bir kuyucuğun direnci (hücrelerle büyüme ortamı) ile boş kuyu (sadece büyüme ortamı) arasındaki farktır.
  8. Hücrelerin daha fazla tedavisini ancak TEER değeri ~ 20 Ω · cm2'ye ulaştıktan sonra gerçekleştirin. İstenilen TEER seviyesine ulaşılamazsa, plakayı inkübatörde tutun ve ertesi gün TEER'yi ölçün.
    NOT: HRMEC akıcılığı, tipik parke taşı morfolojisi ile hücre şeklinin morfolojik incelemesi (mikroskop altında) ve / veya immünohistokimya boyaması ile ayrı ayrı hücre bağlantı proteinlerinin varlığı ile de doğrulanabilir.

4. Transsitoz testi

  1. Cy3 etiketli transferrin kullanılarak klatrin aracılı in vitro transsitoz testi (Şekil 5)
    1. 20 Ω·cm2 civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, serum, ligand ile tedaviden önce her iki odacıkta (apikal oda:250 μL ve bazolateral odacık: 750 μL) EBM'de (serum indirgenmiş ortam) %0.5 FBS kullanarak hücreleri 37 °C'de 24 saat ve %5 CO 2 ile mahrum bırakır. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı.
    2. Apikal odadaki hücreleri (adım 4.1.1'de serum indirgenmiş ortamı kullanarak), floresan (siyanin 3) etiketli transferrin ligand (Cy3-Tf) (40 μg / mL'lik son konsantrasyon) ile 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Cy3-Tf içeren plakalar, alüminyum folyoya sarılarak ve deneyi ışıklar kapalıyken bir hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirerek Cy3-Tf'nin fotobeyazlatmasını önlemek için ışıktan korunmalıdır.
    3. 1 saat sonra, plakayı buz üzerine yerleştirin ve serbest bağlanmamış Cy3-Tf'yi çıkarmak için tek katmanlı apikal ve bazolateral olarak 4x (yıkama başına 3-5 dakika) RT'de serum azaltılmış ortamla yıkayın.
      NOT: Serbest izleyici moleküllerini çıkarmak ve parasellüler yoldan potansiyel sızıntı olmadan transsitozun doğru okunmasını sağlamak için yıkama şarttır.
    4. Hücre içeren iyice yıkanmış filtre eklerine taze serum azaltılmış ortam (adım 4.1.1'de olduğu gibi.) ekleyin ve kesici uçları, önceden ısıtılmış serum indirgenmiş ortam içeren 24 delikli plakanın taze kuyucuklarına aktarın.
    5. Hücreleri inkübatörde 90 dakika daha (37 ° C ve% 5 CO2) inkübe edin ve ardından ortamı bazolateral odadan toplayın.
    6. Bir floresan dedektörü kullanarak çözeltinin floresan yoğunluğunu bazolateral odadan kaydedin. Göreceli floresan birimleri (RFU) olarak ölçülen floresan yoğunluğu seviyeleri, klatrin bağımlı transsitoz yoluyla HRMEC tek katmanı boyunca transsitozlanan Cy3-Tf kompleksinin miktarını gösterir.
  2. HRP kullanılarak kaveola aracılı in vitro transsitoz testi (Şekil 6)
    1. 20 Ω· cm2 civarında TEER değerleri ile tam akıcılığa ulaştıktan sonra, serum tedaviden önce (adım 4.1.1'de olduğu gibi) % 0.5 FBS içeren EBM ortamı (serum indirgenmiş ortam) kullanarak, 37 ° C'de24 saat ve% 5 CO 2 için hücreleri mahrum eder. Serumla indirgenmiş EBM ortamı tüm tahlil boyunca kullanıldı.
    2. Apikal odadaki hücreleri istenen tedaviler ve araç kontrolleri ile tedavi edin.
      NOT: Burada, HRMEC'lerde Wnt sinyal yolu tarafından kaveola aracılı transsitozun düzenlenmesini göstermek için Wnt modülatörlerini örnek olarak kullandık: insan rekombinant Norrin ve Wnt inhibitörü XAV939. Tipik bir deneyde, hücreler aşağıdaki konsantrasyonlarla bir inkübatörde (37 ° C ve% 5 CO2) 24 saat boyunca tedavi edildi: Norrin (125 ng / mL), Norrin (125 ng / mL) + XAV939 (10 μM) ve araç kontrol çözeltisi. Ek olarak, Wnt3a şartlandırılmış ortam (L Wnt-3A hücrelerinden üretilen) de kullanılmıştır.
    3. Apikal odadaki hücreleri HRP (5 mg / mL) ile 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Daha sonra, 24 delikli plakayı buzun üzerine yerleştirin ve serbest hücre dışı HRP'yi çıkarmak için apikal ve bazolateral odaları P tamponu (10 mM HEPES pH = 7.4, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM glikoz, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) ile yoğun bir şekilde 6x yıkayın.
      NOT: Serbest izleyici moleküllerini çıkarmak ve parasellüler yoldan potansiyel sızıntı olmadan transsitozun doğru okunmasını sağlamak için yıkama şarttır.
    5. Apikal hazneye taze serum azaltılmış ortam (adım 4.1.1'de olduğu gibi.) ekleyin ve kesici uçları önceden ısıtılmış ortam içeren taze bir kuyuya aktarın.
    6. Ortamı bazolateral odadan toplamadan önce tek katmanı inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 90 dakika daha inkübe edin.
    7. Toplanan ortama, üreticinin talimatlarına göre 100 μL HRP florojenik peroksidaz substratı (Malzeme Tablosu) ekleyin ve 100 μL Stop çözeltisi ile reaksiyonu durdurmadan önce RT'de 10 dakika inkübe edin.
    8. Bir floresan plaka okuyucu kullanarak ortamdaki HRP substrat reaksiyon ürününün seviyelerini tespit edin. Floresan yoğunluğunu 420 nm emisyon dalga boyunda (325 nm uyarma ile) ve göreceli floresan birimleri (RFU) olarak ölçün. Değerler, kaveola aracılı transsitoz yoluyla HRMEC tabakası boyunca transsitoz edilen HRP seviyesini gösterir.
      NOT: Burada kullanılan floresan ürün (Malzeme Tablosu) fotobeyazlatıcı değildir. Fotobeyazlatmaya karşı ışık koruması gerekli değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Retinal vasküler endotelin EM görüntülerinde transsitotik veziküler transportu ve endotel hücrelerinde kavoler veziküller in vivo olarak görülmektedir.
EC transsitoz, retinal kesitler içinde, HRP içeren kan damarlarını yansıtan koyu kahverengi çökelti ile ışık mikroskobu altında (Şekil 3A) ve HRP içeren transsitotik veziküllerin göstergesi olan elektron yoğun çökelti olarak (Şekil 3B, C) transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kull...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

BRB, retina sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar. Vasküler geçirgenliği değerlendiren in vitro tekniklerin, bariyer (BRB/BBB) gelişimi ve fonksiyonu ile ilgili çalışmalarda çok önemli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Burada açıklanan prosedür, EC transsitozunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek veya BRB geçirgenliğini etkileyen ilgili moleküler modülatörleri değerlendirmek için kullanılabilir. İn vitro EC transsitoz tahlilleri, in vivo testlere veya vasküler geçirgenliği değ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak çıkar çatışmaları veya finansal çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, JC'ye NIH hibeleri (R01 EY028100, EY024963 ve EY031765) ile desteklenmiştir. ZW, Knights Templar Eye Foundation Kariyer Başlangıç Bursu tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Biyolojik Güvenlik Kabini Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific1286
Hücre kültürü petridish Nest Biyoteknoloji704001
Santrifüjü Eppendorf5702
Santrifüj tüpleri (15 mL)Corning Inc.
Santrifüj tüpleri (50 mL)Denville Scientific Inc.C1062-P
Siyanin 3-İnsan Transferrin Jackson ImmunoResearchAB_2337082
Endotel Hücreli Bazal Ortam-2 (EBM-2)Lonza BioscienceCC-3156
Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 (EGM-2) SingleQuots takviyeleriLonza BioscienceCC-4176
EVOM Millicell Elektrik Direnç Sistemi-2 (ERS-2)MiliporeMERS00002
Fetal Sığır Serumu (FBS)Lonza BioscienceCC-4102B
JelatinSigma-AldrichG7765
Hemositometre (2 çipli)Bulldog BioDHC-N002
Yaban turpu Peroksidaz (HRP)Sigma-AldrichP8250
İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri (HRMEC)Hücre SistemleriACBRI 181
İnkübatörTermo Elektron Corporation, Thermo Fisher Scientific3110
L hücreler (Kontrol şartlandırılmış ortam için)ATCCCRL-2648
L Wnt-3A hücreleri (Wnt3A şartlandırılmış ortam için)ATCCCRL-2647
Işık mikroskobuLeicaDMi1
Çok Modlu Plaka OkuyucuEnSight, PerkinElmer
Fosfat tamponlu salin (PBS) tampon (1x)GIBCO10010-023
QuantaBlu Florojenik Peroksidaz Substrat kitiThermo Fisher Scientific15169
Rekombinant insan Norrin (rhNorrin)R& D Systems3014-NR
Rekombinant insan Vasküler endotelyal büyüme faktörü (rhVEGF)R& D Systems293-VE
Şırınga filtresi (0.22 & mikro; m)Millipore SLGP033RS
Transwell ekleri (6,5 mm transwell, 0,4 &mikro; m gözenekli polyester membran eki)Corning Inc.CLS3470-48EA
Tripsin-EDTA (% 0.25) (1x)GIBCO25-200-072
Subanyosu Hassas, Thermo Fisher Scientific51221060
XAV939 (Wnt/β -katenin İnhibitörü)SelleckchemS1180
352097

Kaynaklar

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877(2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211(2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903(2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154(2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062(2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340(2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188(2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953(2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019(2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Endotelyal TransositozHRMEC'lerTEER ÖlçümüKaveola Aracılı TaşımaKlatrin Aracılı TransositozWnt Sinyal YolağıYaban Turpu PeroksidazıTransferrin Alımı
İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.