Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kan-retina bariyerinin (BRB) işlev bozukluğu, sıklıkla retinal ödem ve ardından görme kaybına neden olan çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur. İç kan-retina bariyeri (iBRB) esas olarak fizyolojik koşullar altında düşük geçirgenliğe sahip retinal vasküler endotelden oluşur. Düşük geçirgenliğin bu özelliği, bitişik retinal mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki düşük parasellüler taşıma oranları ve ayrıca bunlar aracılığıyla transsellüler transport (transsitoz) ile sıkı bir şekilde düzenlenir ve korunur. Retinal transsellüler bariyer geçirgenliğinin değerlendirilmesi, sağlık ve hastalıkta iBRB bütünlüğü hakkında temel bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) kullanarak iBRB geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro bir model olarak endotel hücresi (EC) transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör ve kaveola aracılı transsellüler transport süreçlerinde transferrin ve yaban turpu peroksidazını (HRP) taşıma yeteneğini değerlendirir. Gözenekli membran üzerinde kültürlenen tam akışkan HRMEC'ler, EC monokatmanındaki transsitoz seviyelerinin göstergesi olarak, alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerini ölçmek için floresan etiketli transferrin (klatrin bağımlı transsitoz) veya HRP (kaveola aracılı transsitoz) ile inkübe edildi. iBRB'yi düzenleyen bilinen bir yol olan Wnt sinyali, kaveola aracılı HRP bazlı transsitoz testi yöntemini göstermek için modüle edildi. Burada açıklanan EC transsitoz testi, vasküler patolojilerde EC geçirgenliğinin ve iBRB bütünlüğünün moleküler düzenleyicilerini araştırmak ve ilaç dağıtım sistemlerini taramak için yararlı bir araç sağlayabilir.
Giriş
İnsan retinası, vücuttaki en yüksek enerji gerektiren dokulardan biridir. Nöral retinanın düzgün çalışması, retinal çevreyi korumak için kan-retinal bariyer (BRB) aracılığıyla aracılık edilen diğer potansiyel olarak zararlı moleküllerin sınırlı bir akışı ile birlikte verimli bir oksijen ve besin kaynağı gerektirir1. Merkezi sinir sistemindeki kan-beyin bariyerine (BBB) benzer şekilde, BRB gözde seçici bir bariyer görevi görür ve iyonların, suyun, amino asitlerin ve şekerin retinanın içindeki ve dışındaki hareketini düzenler. BRB ayrıca bağışıklık hücreleri, antikorlar ve zararlı patojenler gibi dolaşım faktörlerine maruz kalmayı önleyerek retin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ışık mikroskobu ve EM görüntülerinin oluşturulması için onaylanmıştır (Şekil 3). İn vivo çalışmalar için protokoller Wang ve ark.24'ten elde edilebilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) içeren tüm deneyler, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin Hazırlanması
- Doku kültürü kabının kaplanması için çözelti: 500 mL steril doku kültürü sınıfı 1x PBS'de ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Retinal vasküler endotelin EM görüntülerinde transsitotik veziküler transportu ve endotel hücrelerinde kavoler veziküller in vivo olarak görülmektedir.
EC transsitoz, retinal kesitler içinde, HRP içeren kan damarlarını yansıtan koyu kahverengi çökelti ile ışık mikroskobu altında (Şekil 3A) ve HRP içeren transsitotik veziküllerin göstergesi olan elektron yoğun çökelti olarak (Şekil 3B, C) transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kull.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
BRB, retina sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar. Vasküler geçirgenliği değerlendiren in vitro tekniklerin, bariyer (BRB/BBB) gelişimi ve fonksiyonu ile ilgili çalışmalarda çok önemli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Burada açıklanan prosedür, EC transsitozunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek veya BRB geçirgenliğini etkileyen ilgili moleküler modülatörleri değerlendirmek için kullanılabilir. İn vitro EC transsitoz tahlilleri, in vivo testlere veya vasküler geçirgenliği değ.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak çıkar çatışmaları veya finansal çıkarları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, JC'ye NIH hibeleri (R01 EY028100, EY024963 ve EY031765) ile desteklenmiştir. ZW, Knights Templar Eye Foundation Kariyer Başlangıç Bursu tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Biyolojik Güvenlik Kabini | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Hücre kültürü petridish | Nest Biyoteknoloji | 704001 | |
| Santrifüjü | Eppendorf | 5702 | |
| Santrifüj tüpleri (15 mL) | Corning Inc. | ||
| Santrifüj tüpleri (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Siyanin 3-İnsan Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endotel Hücreli Bazal Ortam-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 (EGM-2) SingleQuots takviyeleri | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Elektrik Direnç Sistemi-2 (ERS-2) | Milipore | MERS00002 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Jelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemositometre (2 çipli) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Yaban turpu Peroksidaz (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| İnsan retinal mikrovasküler endotel hücreleri (HRMEC) | Hücre Sistemleri | ACBRI 181 | |
| İnkübatör | Termo Elektron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L hücreler (Kontrol şartlandırılmış ortam için) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A hücreleri (Wnt3A şartlandırılmış ortam için) | ATCC | CRL-2647 | |
| Işık mikroskobu | Leica | DMi1 | |
| Çok Modlu Plaka Okuyucu | EnSight, PerkinElmer | ||
| Fosfat tamponlu salin (PBS) tampon (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Florojenik Peroksidaz Substrat kiti | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Rekombinant insan Norrin (rhNorrin) | R& D Systems | 3014-NR | |
| Rekombinant insan Vasküler endotelyal büyüme faktörü (rhVEGF) | R& D Systems | 293-VE | |
| Şırınga filtresi (0.22 & mikro; m) | Millipore SLGP033RS | ||
| Transwell ekleri (6,5 mm transwell, 0,4 &mikro; m gözenekli polyester membran eki) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Tripsin-EDTA (% 0.25) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Su | banyosu Hassas, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β -katenin İnhibitörü) | Selleckchem | S1180 |
Kaynaklar
- Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
- Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
