Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

6.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64091

⸱

18 Mayıs 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Özet

Caenorhabditis elegans'ın model bir organizma olarak keşfi ve gelişimi, biyolojide, özellikle yaşlanma alanında etkili olmuştur. Birçok tarihsel ve çağdaş çalışma, genetik mutasyonlar, transgenik gen ekspresyonu ve strese faydalı, düşük dereceli bir maruz kalma olan hormesis de dahil olmak üzere binlerce yaşam süresini değiştiren paradigmayı tanımlamıştır. Kısa bir ömür, kolay ve düşük maliyetli bakım ve tüm insan genlerinin neredeyse üçte ikisine homoloji ile tamamen sıralanmış genom dahil olmak üzere birçok avantajı ile C. elegans, stres ve yaşlanma biyolojisi için olağanüstü bir model olarak hızla benimsenmiştir. Burada, kullanım ömrünü ve sağlık süresini ölçmek için, özellikle sınırlı ekipman ve fonlara sahip olanlar olmak üzere hemen hemen her araştırma ortamına kolayca uyarlanabilen çeşitli standartlaştırılmış yöntemler araştırılmaktadır. C. elegans'ın inanılmaz faydası, kapsamlı bir altyapıya ihtiyaç duymadan yaşlanma biyolojisinde güçlü genetik analizler yapma kapasitesini vurgulayarak öne çıkıyor. Son olarak, her analizin sınırlamaları ve alternatif yaklaşımlar dikkate alınmak üzere tartışılmaktadır.

Giriş

Sydney Brenner'in 1974'teki en etkili makalelerinden biri olan 'Caenorhabditis elegans'ın genetiği'nin yayınlanmasından bu yana, bu mikroskobik solucan biyolojik gizemleri incelemek için olağanüstü bir model sistem olarak kabul edilmiştir1. 1977'de Michael R. Klass, C. elegans'ın ömrünü ölçme yöntemini yayınladı ve yaşlanmayı incelemek için bu model sistemi kurdu2. Stres ve uzun ömürlülük arasındaki ilişkiyi anlamak için yapılan araştırma, yaş-1 genindeki tek bir mutasyonun tanımlanmasıyla başlamış ve bu da C. elegans3'te yaşam süresinin uzamasına neden olmuştur. Ayrıca, çağdaş çalışmalar, strese karşı artan direnç gösteren uzun ömürlü mutant solucanları ortaya çıkaran diğer yaşam süresini artıran mutasyonları tanımlamıştır 4,5,6. Kısa ömrü, kolay bakımı, insan hastalığına neden olan tüm genlerin yaklaşık üçte ikisine homoloji içeren tamamen sıralanmış genomu, RNA girişim (RNAi) kütüphanelerinin kullanılabilirliği ve kullanım kolaylığı ve insanlarla fizyolojik benzerliği 7,8,9 gibi birçok avantajı ile C. elegans, stres ve yaşlanma biyolojisi için olağanüstü bir model olarak hızla benimsenmiştir.

Belki de C. elegans'ın en büyük faydaları, son derece düşük bakım maliyeti, deney kolaylığı ve çalışmalar için mevcut genetik araçların çeşitliliğidir. C. elegans tipik olarak bir E. coli besin kaynağı ile katı bir agar ortamında yetiştirilir. Yaygın olarak kullanılan iki E. coli suşu standart OP50, belki de en yaygın kullanılan 10 olan bir B suşu ve öncelikle RNAi deneyleri için kullanılan bir K-12 suşu olan HT115'tir11,12. HT115 K-12 suşu, bireysel C. elegans genlerine karşılık gelen dsRNA'yı eksprese eden plazmidlerin kullanıldığı RNAi yöntemleri için gerekli olan bir mutasyon olan RNAIII RNaz'da bir delesyon taşır. dsRNA besleme vektörleri, karmaşık haçlara veya genom düzenlemesine gerek kalmadan C. elegans genlerinin sağlam bir şekilde parçalanmasına izin verir, çünkü bu plazmidleri taşıyan bakteriler doğrudan nematodlara beslenebilir. Bu bakteriyel RNAi vektörlerinin binlercesi, 19.000 > bireysel RNAi yapısı13 ve 16.757 RNAi yapısı14 olan Ahringer RNAi kütüphanesi de dahil olmak üzere HT115 arka planında bulunur. Bununla birlikte, OP50 ve HT115 bakteri diyetleri, B12 Vitamini 15,16'daki farklılıklar da dahil olmak üzere metabolik profilde büyük farklılıklara sahiptir. Bu nedenle, daha önce tarif edildiği gibi birden fazla kafa karıştırıcı faktör ortaya çıkarabilecek gen-diyet etkileşimlerinden kaçınmak için mümkünse tüm deneylerin tek bir bakteri kaynağı üzerinde yapılması önerilir17,18,19. Kolaylığı nedeniyle, hayvanlar burada açıklanan tüm deneysel koşullar için OP50'de tutulur, ancak tüm deneyler daha önce açıklandığı gibi HT115 üzerinde gerçekleştirilir20. Kısaca, hayvanlar OP50'de tutulur ve RNAi ile RNAi olmayan deneyler arasında tutarlılık için senkronizasyon sonrası HT115'e (ağartmadan sonra) aktarılır. Alternatif olarak, E. coli K12 HT115 suşunda bulunan RNAIII RNaz'ın benzer bir delesyonunu taşıyan RNAi yetkin bir OP50 suşu da kullanılabilir21.

Belki de C. elegans'taki RNAi deneylerinin en büyük sınırlamalarından biri, nakavt verimliliği endişesidir. Nakavt verimliliği qPCR veya batı lekelemesi ile doğrulanabilirken, bunlar pahalı ekipman ve reaktifler gerektirir ve toplu analizle sınırlıdır. Bu, RNAi'ye dirençli (daha az hassas) olan nöronlar gibi spesifik hücrelere bakmak için daha da endişe vericidir. Spesifik hücrelerdeki RNAi etkinliği, dsRNA alımı22 için gerekli olan transmembran proteini olan SID-1'in aşırı ekspresyonu ile arttırılabilirken, bu hala bu yapılar için kullanılan promotörlerin hücre tipine özgü ekspresyon kalıpları ile sınırlıdır ve bu nedenle gen nakavtları ve mutasyonları, gen fonksiyonlarını tüketmenin en kusursuz yoludur. RNAi aracılı nakavtın ötesinde, C. elegans ayrıca CRISPR tabanlı stratejilerle genom düzenlemeye23,24,25 ve mikroenjeksiyonlar yoluyla transgenik yapı aşırı ekspresyonuna oldukça uygundur ve transgenik yapıları ışınlama veya transpozon tabanlı entegrasyon yoluyla entegre etme seçeneği26,27,28,29 . Bununla birlikte, bu yöntemler pahalı mikroenjeksiyon ekipmanı gerektirir ve kılavuz RNA'ların veya Cas9 enziminin yüksek maliyeti, sınırlı finansmana sahip kurumlarda bu yöntemleri yasaklayabilir. Bunun yerine, binlerce transgenik çizgi ve mutant, hem Caenorhabditis Genetik Merkezi'nde (CGC) hem de Ulusal Biyokaynak Projesi'nde (NBRP) birkaç dolara kolayca bulunabilir. NBRP, yayınlanmış ve bu nedenle doğrulanmış mutant suşları, pilot projelerden türetilen mutantlar ve henüz karakterize edilmemiş mutantlar dahil olmak üzere çok sayıda C. elegans geni için izole mutantlar sunmaktadır. Buna karşılık, CGC, araştırma topluluğundan çoğunlukla yayınlanmış ve kurulmuş C. elegans hatlarının bir deposudur. Her ikisi de dünya çapında çok makul fiyatlarla suşlar gönderiyor ve şirket içinde suşları sentezlemek için sınırlı kapasiteye sahip olanlar için çok çeşitli seçenekler sunuyor.

Burada, C. elegans'ta yaşam süresini ve sağlık süresini analiz etmek için en düşük maliyetli yöntemler olması muhtemel olan küratörlü bir yöntem koleksiyonu sunulmaktadır. Burada sunulan tüm yöntemler düşük maliyetli ekipman ve sarf malzemeleri gerektirir ve yalnızca CGC'den kolayca temin edilebilen suşları kullanır. C. elegans'ta uzun ömürlülük ve hayatta kalma testleri için belki de en yasaklayıcı olanı, Nematod Growth Media (NGM) plakalarının maliyetidir. C. elegans hermafrodit olduğundan ve kendi kendine döllendiğinden, standart hayatta kalma testleri, yavrulardan kontaminasyonu önlemek için yetişkin hayvanların sürekli olarak soylarından uzaklaştırılmasını gerektirir. Bu işlem sadece zaman alıcı olmakla kalmaz, aynı zamanda tek bir ömür boyu tahlil yapmak için koşul başına yaklaşık 100 plaka gerekliliği nedeniyle pahalı hale gelebilir. Burada iki alternatif sunulmaktadır: sıcaklığa duyarlı germ çizgisi içermeyen mutant, glp-4 (bn2) kullanımı veya 5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR) kullanılarak kimyasal sterilizasyon. glp-4, bir valil aminoasil tRNA sentetazı kodlar ve sıcaklığa duyarlı glp-4 (bn2), azalmış protein translasyonu30,31 nedeniyle kısıtlayıcı sıcaklıklarda üreme açısından yetersizdir. FUDR, DNA replikasyonunu önleyerek C. elegans'ı kimyasal olarak sterilize etmek için sağlam bir yöntemdir, böylece üremeyi inhibe eder32. FUDR, bazı laboratuvarlar için engelleyici derecede pahalı olabilse de, solucanları kimyasal olarak sterilize etmek için sadece küçük bir miktar gereklidir ve toz formundaki stabilitesi çoğu grup için uygun hale getirebilir. Sıcaklığa duyarlı glp-4 (bn2) mutantını kullanmak kesinlikle en ucuz seçenektir, çünkü tek gereksinim hayvanları kısıtlayıcı 25 ° C'ye kaydırmak için bir inkübatördür; Bununla birlikte, 25 °C'de büyümenin hafif ısı stresine neden olabileceği unutulmamalıdır33,34. Yöntemden bağımsız olarak, steril hayvanların kullanılması, yaşa bağlı tahliller için gerekli sarf malzemelerinin maliyetlerini önemli ölçüde azaltabilir.

Yaşlanmayı incelemek için, standart ömür testleri gelenekseldir, çünkü uzun ömürlülüğü değiştiren paradigmaların yaşlanma üzerinde doğrudan etkileri vardır. Bununla birlikte, sağlık süresi ve stres toleransı ölçümleri, organizmanın sağlığı hakkında ek bilgiler sunmaktadır. Burada, sağlığı ölçmek için çeşitli yöntemler sunulmaktadır: 1) üreme sağlığının bir ölçüsü olarak doğurganlık; 2) Gelişimsel sağlığın ve serilen yavruların yaşayabilirliğinin bir ölçüsü olarak yavru büyüklüğü; ve 3) kas fonksiyonu ve hareketliliğinin bir ölçüsü olarak lokomotor davranış, her ikisi de yaşlanma ile doğrudan ilişkilidir. Ek olarak, stres toleransı testleri sunulmaktadır: ER stresine hayatta kalma, mitokondriyal / oksidatif stres ve termal stres sağkalımı. Gerçekten de, ER stresine karşı direnci artmış olan hayvanlar 35,36, mitokondriyal stres37 ve termal stres38 daha uzun ömür sergiler. ER stresi, C. elegans'ın N'ye bağlı glikozilasyonu bloke eden ve yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine neden olan tunikamisin'e maruz bırakılmasıyla uygulanır39. Mitokondriyal / oksidatif stres, özellikle mitokondri40'ta süperoksit oluşumunu indükleyen paraquat'a maruz kalarak indüklenir. Isı stresi, hayvanların 34-37°C 33,41'de kuluçkalanması yoluyla uygulanır. Burada açıklanan tüm tahliller minimum ekipman ve fonla gerçekleştirilebilir ve çeşitli gruplarda yaşlanmayı incelemek için çeşitli araçlar sunar.

Protokol

1. C. elegans'ın büyümesi ve bakımı

  1. Dökme Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakaları
    1. C. elegans'ı standart %2 agar plakaları üzerinde 1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO4 (pH 6.0), 1 mM MgSO4, %0.25 w/v Peptone ve 51.3 mM NaCl'den oluşan Nematod Growth Media (NGM) ile büyütün.
    2. 1 L NGM-agar plakası için, 2.5 g Peptone, 3.0 g NaCl ve 20 g agar'ı karıştırma çubuğuna sahip 1 L'lik bir şişeye ölçün.
      NOT: Belirli bir agar kaynağının standartlaştırılması önerilir, çünkü markalar arasındaki sertlikte değişkenlik gördük, bu da tekrarlanabilirliği etkileyebilir. Burada Bacto-Agar kesinlikle kullanılmaktadır. Ek olarak, agar'ın doğrudan otoklavlanan şişeye eklenmesi önerilir, çünkü agar ısıtılmadan tamamen çözünmez ve agar içeren çözeltinin aktarılması agar kaybına ve konsantrasyon hatalarına neden olur.
    3. 970 mL'ye kadar dH2O ekleyin.
      NOT: Sterilizasyon sonrası 30 mL sıvı katkı maddesi, son hacmi 1 L'ye getirecektir. Ellerimizde, son hacmin 970 mL'sine ulaşmak için ~ 951 mL dH2O gerekecektir.
    4. Verimli sterilizasyon için standart bir otoklav veya ortam sterilizatörü kullanarak NGM-agar çözeltisini sterilize edin.
      NOT: Bu noktada, steril NGM-agar oda sıcaklığında birkaç ay saklanabilir. Depolandığı takdirde, NGM-agar, çözeltinin kaynamasını önlemek için 15-45 s darbeli bir mikrodalgada veya ısıtılmış bir su banyosunda sıvılaştırılabilir.
    5. Çözeltinin 60-75 °C'ye soğuyana kadar karıştırılmasına izin verin. Soğutma sırasında karıştırmak, düzensiz soğutmayı önlemek için önemlidir, bu da bazı agarların katılaşmasına neden olabilir.
    6. Çözelti soğurken, bir su banyosunu veya boncuk banyosunu 65-70 ° C'ye ısıtın.
    7. Çözelti 60-75 °C'ye soğuduktan sonra, sıvı katkı maddeleri ekleyin: 2.0 mL 0.5 M CaCl2, 1 mL 5 mg / mL kolesterol, 25 mL 1 M KPO 4 (pH 6.0) ve 0.5 M MgSO4 (tüm reaktifler için tarifler için Tablo 1'e bakınız) ve tam karıştırmayı sağlamak için çözeltinin ~ 5 dakika boyunca karışmasına izin verin.
      NOT: İlaçlar buradaki plakalara da dahil edilebilir (örneğin, 1 mL 100 mg / mL karbenisilin ve 1 mL 1 M IPTG ekleyin; 10 mL 2.5 mg / mL tunikamisin ekleyin; 10 mL 400 mM paraquat ekleyin).
    8. NGM-agar içeren şişeyi plakalara dökülürken katılaşmasını önlemek için 65-70 °C'lik bir su banyosuna batırın.
    9. Her 60 mm'lik plakaya 9-11 mL çözelti veya her 100 mm plakaya 20-30 mL çözelti pipetin.
      NOT: Pipetteki genişleyen havanın neden olduğu NGM sızıntılarını önlemek için mevcut en küçük pipet hacminin kullanılması önerilir. Pipetin tamamen boşalmasını önlemek için her plakaya eklenecek ortamdan 1-2 mL'ye kadar pipetlemek, kabarcık oluşumunu önlemeye yardımcı olacaktır. Alternatif olarak, plakalar doğrudan şişeden bir plakaya elle dökülebilir, ancak eşit hacimli plakaları sağlamak için pipetleme şiddetle tavsiye edilir. Çözeltilerin doğrudan bir plakanın üzerine uygulandığı yöntemleri kullanırken benzer çözelti konsantrasyonlarını sağlamak için eşit hacimli plakalar önemlidir (bkz. adım 1.1.17). Eşit hacimler, plakalar arasında benzer bir odak düzlemini korumak için kolay mikroskopiye de izin verir.
    10. Sıcaklığı korumak ve NGM-agar'ın katılaşmasını önlemek için pipeti ısıtılmış çözeltiye geri yerleştirin.
    11. Tüm plakalar için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın.
    12. NGM-agar plakalarının gece boyunca katılaşmasına izin verin.
    13. Plakalar katılaştıktan sonra, plakaları 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın veya bakteri içeren plakaları tohumlamak için adım 1.1.14'e geçin. Plaka kalitesini korumak amacıyla nemi korumaya yardımcı olmak için plakaları kapalı kaplarda saklayın.
    14. Lizojen et suyunda (LB) bir OP50 kültürü veya ortam sıcaklığında (~ 22-25 ° C) 24-48 saat boyunca tercih edilen eşdeğer bir ortam yetiştirin veya LB + antibiyotiklerde (HT115 için ampisilin / karbonhidrat + tetrasiklin önerilir) 12-16 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanan bir HT115 kültürü yetiştirin.
      NOT: OP50'nin oda sıcaklığında yetiştirilmesi önerilir, çünkü 37 ° C'de daha agresif bir OP50 büyümesi bulunmuştur ve bu da C. elegans ömrünü etkiler. Buna karşılık, HT115 daha yavaş bir büyüme oranına sahiptir ve daha az yoğun kültürler yapar; Bu nedenle, HT115'in 37 ° C'de sallanarak yetiştirilmesi önerilir.
    15. Doymuş bir OP50/HT115 kültürünün hacmini 100-200 μL'lik bir hacmi 60 mm'lik bir plakaya veya 100 mm'lik bir plaka için 1 mL'lik bir tohumlayın.
    16. Plakaların bir tezgahta gece boyunca kurumasını bekleyin ve plakalar hala ıslaksa kuruması için bir gün daha bekleyin. Plakaları kapalı kaplarda ~ 2 ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
    17. İsteğe bağlı: Solucanları kimyasal olarak sterilize etmek için ilaçları doğrudan tohumlanmış NGM-agar plakalarına (örneğin, 100 μL 10 mg / mL FUDR çözeltisi) ekleyin.
  2. C. elegans stoklarının bakımı
    1. Tohumlanmış bir NGM-agar plakasının tabanını uygun şekilde etiketleyin. Standart diseksiyon mikroskoplarında ışığın geçişini engellemeyi önlemek için plakanın altındaki kenarları etiketleyin.
    2. Standart bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, C. elegans pick'e tercih edilen bakterileri kepçeleyin.
      NOT: Bu protokolde, cam Pasteur pipetinin ucuna tutturulmuş %90/%10 platin/iridyum telden oluşan bir pikap kullanılmıştır.
    3. Bakterileri kullanarak, 10-20 yumurta, L1, L2 veya L3 hayvanı toplayın ve bunları yeni etiketlenmiş tohumlanmış bir NGM-agar plakasına aktarın.
      NOT: Genç hayvanları toplamak en iyisidir; Yazarların deneyimlerine göre, standart vahşi tip hayvanlar için, 10-20 yumurta / genç hayvanın taşınması, plakanın açlık olmadan 15 ° C'de büyümesini sağlayacaktır. Doğurganlığı azalmış transgenik veya mutant hayvanlar için, plakaya daha fazla hayvan taşınmalıdır.
    4. Vahşi tip doğurganlığı olan ve 15 ° C'de yetişen hayvanlar için, haftalık bir stoğu korumak için her 7 günde bir 1.2.1-1.2.3 adımlarını tekrarlayın. 20 °C'de yetişen hayvanlar için, açlığı önlemek için her 4-5 günde bir 1.2.1-1.2.3 adımlarını tekrarlayın.
  3. Solucanları eşitleme via Beyazlatma
    NOT: Tam, 60 mm'lik bir NGM-agar plakası (örneğin, 15 °C'de yetiştirilen 1 haftalık stok plakaları), tarif edilen çoğu standart tahlil için yeterli sayıda hayvan sağlayacaktır. Genel olarak, bir gravid yetişkin (yumurta dolu yetişkin) 10-15 yumurta sağlayacaktır.42ve tam, 60 mm'lik bir NGM-agar plakası, ~ 1000-2000 yumurta sağlayan 100-200 gravid yetişkinden herhangi bir yere sahiptir.
    1. Daha fazla hayvan gerektiren daha büyük ölçekli deneyler için, tam 60 mm'lik bir NGM-agar'ı dört ila altı eşit parçaya bölün ve genişleme için tohumlanmış 100 mm'lik plakalara koyun.
      NOT: Burada parçalama, solucanlar içeren NGM-agar plakasının bir parçasını kesmek ve solucanların yeni plakaya sürünmesine izin vermek için tüm agar + solucan yığınını yeni bir plakaya, solucan tarafına doğru hareket ettirmek anlamına gelir. Bir referans çerçevesi olarak, vahşi tip doğurganlığa sahip hayvanlar, parçalamadan sonra 2-3 gün boyunca 20 ° C'de yetiştirilirse tam 100 mm'lik bir plaka üretecektir.
    2. Nematodları toplamaya başlamak için, Petri kabını fazla doldurmamaya dikkat ederek, solucan içeren plakalara az miktarda M9 çözeltisi (Tablo 1) dökün. Solucanları bakteriyel çimlerden gevşetmek için M9 çözeltisini yavaşça döndürün.
    3. Yerçekimi yetişkin solucanlarını serolojik pipetle toplayın, agar'ı pipet ucuyla delmemeye dikkat edin.
      NOT: C. elegans plastiğe yapışma eğiliminde olduğundan cam serolojik pipetler önerilir. Cam pipetler mevcut değilse, plastik pipetlere yapışma nedeniyle bazıları kaybolacağından, gerekenden daha fazla sayıda hayvanla başlamanız önerilir.
    4. Hayvanları 1.100 x g'da 30 s santrifüjleme ile pelet edin. Süper natantı aspire edin.
      NOT: C. elegans peleti çok gevşektir, bu nedenle süpernatanı aspire ederken peleti sallamamaya veya bozmamaya dikkat edin.
    5. Hayvanlar santrifüj yaparken, suş başına 5 mL ağartma çözeltisi hazırlayın (tarif ayrıntıları için Tablo 1'e bakınız); 5 mL çözelti için, 1.5 mL% 6 sodyum hipoklorit (ağartıcı), 0.75 mL 5 M NaOH veya KOH ve 2.75 mL dH2O karıştırın.
      DİKKAT: Sodyum hipoklorit ve yüksek konsantrasyonlu hidroksit çözeltileri aşındırıcıdır ve bu nedenle kullanım sırasında eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmesi önerilir.
    6. Solucan peleti/M9 karışımına 5 mL ağartma çözeltisi ekleyin.
    7. Tüm yetişkin solucan gövdeleri çözülene ve karışımda sadece yumurtalar kalana kadar solucanları birkaç dakikada bir disseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Ağartma işlemini hızlandırmak için solucan/ağartıcı karışımını kuvvetlice çalkalayın.
      NOT: Yumurtaları uzun süre çamaşır suyu karışımı içinde bırakmak, yumurtaların zarar görmesine neden olacak ve hayvanların yaşayabilirliğini etkileyecektir. Vahşi tip hayvanlar için, ağartma genellikle sallama ile 4-6 dakika sürer. Bu nedenle, hayvanların mikroskop altında 4 dakikalık işaretten başlayarak 30 s aralıklarla kontrol edilmesi önerilir.
    8. Yumurta/ağartıcı karışımını 1.100 x g'da 30 sn aşağı döndürerek yumurtaları topaklayın.
      NOT: Bazı 15 mL konik tüplerin tüpün iç kısmında gradyan çizgileri vardır. Bu tüpler için, yumurtaların tüpün dibine peletlenmesini ve gradyan çizgilerinde kalmamasını sağlamak için yumurtaların daha yüksek bir hızda (örneğin, 2.000 x g'de 30 s) döndürülmesi önerilir.
    9. Beyazlatma solüsyonunu aspire edin.
      NOT: Bir yumurta peleti, solucan peletinden daha serttir, ancak yine de kolayca bozulabilir. Bu nedenle, santrifüjlemeden sonra tüpü sallamamaya dikkat edin.
    10. 15 mL'ye kadar M9 çözeltisi ekleyerek ve yumurtaların M9 çözeltisinde tamamen dağılmasını sağlamak için tüpü dört veya beş kez ters çevirerek yumurtaları yıkayın.
    11. Pelet yumurtaları 1.100 x g'da 30 s santrifüj edilerek M9 çözeltisini aspire edin.
    12. Yumurta karışımından herhangi bir ağartıcıyı ortadan kaldırmak için toplam dört yıkama için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın.
    13. Son yıkamadan sonra yumurtaları 100 μL ila 2 mL M9 çözeltisinde (yani, ağartılan toplam solucan sayısına bağlı olarak) tekrar askıya alın. Kümeleri parçalamak için yumurtaları iyice çalkalayın ve peletin tamamen askıya alındığından emin olun.
    14. Alternatif olarak, hayvanlar daha sıkı bir zamansal senkronizasyon için L1 tutuklanabilir; L1 tutuklama için, 15 mL'lik bir konik tüp içinde ~ 10 mL'ye kadar yumurta peletine M9 çözeltisi ekleyin. Solucanların 20 °C veya ortam sıcaklığında 24 saate kadar bir rotatörde dönmesine izin verin. L1 hayvanlarının yetişkinliğe ulaşması, adım 1.3.16'da açıklanan yumurtaların zamanlamasına kıyasla genellikle yarım gün daha az sürer.
    15. 4 μL yumurta/M9 karışımını bakterilerle tohumlanmış bir NGM plakasına pipetleyerek yumurta konsantrasyonunu (veya L1 konsantrasyonunu; bkz. adım 1.3.14) yaklaşık olarak belirleyin. μL kaplama başına kaç yumurta bulunduğunu sayın ve hesaplayın. Yaklaşımı iyileştirmek için sayımı üç veya dört kez tekrarlayın.
      NOT: Yumurta konsantrasyonuna yaklaşmak, aşırı kaplama olmadan deneyler için uygun numune büyüklüğü için yeterli sayıda hayvanın kaplanmasını sağlayacak ve bu da açlığa neden olacaktır.
    16. Yaklaşıma dayanarak, uygun sayıda yumurtayı, tercih edilen bakterilerle tohumlanmış NGM-agar plakalarına tabaklayın. OP50 plakalar için, 60 mm'lik bir plaka üzerinde maksimum 200 hayvan ve 100 mm'lik bir plaka üzerinde 1.000 hayvan plakalayın. HT115 plakalar için, 60 mm'lik bir plaka üzerinde maksimum 150 hayvan ve 100 mm'lik bir plaka üzerinde 600 hayvan plakalayın.
      NOT: Bunlar laboratuvar koşullarımıza göre yaklaşık sayılardır ve sayılar bakteriyel çimlerin kalınlığına bağlı olarak değişebilir. 15 ° C'de yetiştirilen yumurtaların 1. yetişkinlik gününe ulaşması ~ 5 gün sürecektir (yumurtlama maksimum, gravid yetişkin aşamasına ulaşmak için ~ 140 saat). 20 ° C'de yetiştirilen yumurtaların 1. gün yetişkinliğe ulaşması ~ 4 gün sürecektir (yumurtlama maksimum, gravid yetişkin aşamasına ulaşmak için ~ 96 saat). 25 ° C'de yetiştirilen yumurtaların 1. gün yetişkinliğe ulaşması ~ 3,5 gün sürecektir (yumurtlama maksimum, gravid yetişkin aşamasına ulaşmak için ~ 62 saat).
  4. C. elegans popülasyonlarını senkronize etmek için alternatif bir yöntem olarak yumurtlama
    1. Ağartma protokolleri mümkün değilse (örneğin, santrifüj mevcut değilse), C. elegans popülasyonlarını senkronize etmek için alternatif bir yöntem olarak, bir yumurtlama prosedürü uygulayın. Bu protokolün daha fazla emek yoğun olduğunu ve daha az hayvan verimine neden olacağını unutmayın.
    2. Yumurtlama için, 8-12 gravid yetişkini, tercih edilen bakterilerle tohumlanmış standart bir NGM-agar plakasına yerleştirin ve bir tabağa yerleştirilen hayvanların tam sayısını belgeleyin.
      NOT: Yumurtlama prosedürleri, deney için kullanılacak sıcaklıkta yapılmalıdır.
    3. Hayvanların 4-8 saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin.
      NOT: Hayvanların plaka üzerinde bırakılma süresi gerektiğinde ayarlanabilir. Örneğin, daha az zaman mevcut olduğunda daha kısa bir yumurtlama süresi için bir tabağa daha fazla sayıda hayvan konulabilir. C. elegans genellikle yumurtaları patlamalar halinde bırakır, bu da vahşi tip doğurganlığı olan hayvanlar için yaklaşık beş yumurta / s oranında tahmin edilebilir43. Hayvanların aşırı kaplanmasını önlemek için adım 1.3.16'daki önerileri izleyin.
    4. Tüm yetişkin hayvanları plakadan çıkarın.
      NOT: Plakada bırakılan yetişkin hayvanlar yumurta bırakmaya devam edecek ve senkronize edilmemiş bir popülasyonla sonuçlanacaktır.
    5. 1. gün yetişkinliğe ulaşmak için yumurtaları ~ 5 gün boyunca 15 ° C'ye veya ~ 4 gün boyunca 20 ° C'ye yerleştirin.

2. C. elegans'ta uzun ömürlülüğün ölçülmesi

  1. Standart kullanım ömrü
    1. NGM-agar plakalarını, tercih edilen 100 μL bakteri içeren plakaları tohumlayarak hazırlayın. Tutarlılık için, tüm replikalarda aynı bakterilerin kullanıldığından emin olun. Solucanlar yetişkinliğin yumurtlama aşamalarında her gün hareket ettirildiğinden, yaşam süresi boyunca beş ila yedi set NGM-agar plakası tohumlayın ve hayvanları yetişkinliğe yetiştirmek için suşta iki ila dört plaka tohumlayın (yani, yaşam süreleri için 15 hayvandan oluşan sekiz tabak kullanılıyorsa, koşul başına 40-56 plaka tohumlanması gerekir).
    2. Depolamadan önce plakaların gece boyunca kurumasını bekleyin.
      NOT: Plakaların 4 °C'de saklanması ve bakterilerin hareket etme/sayma ömrünü zorlaştırabilecek kalın çimler oluşturmasını önlemek için gerekli sayıda plakanın günlük olarak soğuk hava deposundan çıkarılması önerilir. Solucanları kaplamadan önce plakaların ısıtıldığından emin olun.
    3. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın.
    4. 10-15 gün 1 yetişkin hayvanı her biri 8-12 plakaya taşıyın. Standart bir yaşam süresi için, sansür olaylarından sonra örneklem büyüklüğünün 100'ün altına düşmemesini sağlamak için ~ 120 hayvanla başlayın (örneğin; 15 hayvandan oluşan sekiz tabak = 120 hayvan; 10 hayvandan oluşan 12 tabak = 120 hayvan).
      NOT: Mevcut durumda, 10-15 hayvan çoğu araştırmacı için yönetilebilir bir sayıdır, ancak sarf malzemelerinin maliyetini düşürmek için 20 hayvandan oluşan altı plaka da mümkündür.
    5. İlk 7-8 gün boyunca veya döl artık görünmeyene kadar, yetişkin hayvanları her 1-2 günde bir soylarından uzaklaştırın.
      NOT: Hayvanlar, materyalleri korumak için her gün hareket ettirilebilir, ancak yetişkin popülasyonların soylarla kontaminasyonunu önlemek için yumurta / larva hayvanlarının yetişkinle birlikte transfer edilmemesine özen gösterilmelidir. Bu çalışmada, en basit yöntem, yumurtlamanın maksimum olduğu 1-3. günlerden itibaren hayvanları her gün hareket ettirmek ve daha sonra yumurtlamanın minimum olduğu 5-8. günler için her gün hayvanları hareket ettirmeye geçmektir. Bu yöntemle 1-3. günlerde yumurta/larva hayvanlarının transferini engellemek zorunlu değildir, çünkü yetişkinler her gün taşınacaktır ve yumurta/larva 1 günde yetişkinliğe kadar gelişemez.
    6. Hayvanlar döl üretmeyi bıraktıktan sonra, tüm hayvanlar ölü veya sansürlü olarak puanlanana kadar her gün yaşam sürelerini puanlayın. Karışıklığı önlemek ve aynı hayvanı anlatmak için tüm ölü veya sansürlenmiş hayvanları plakadan çıkarın.
      NOT: Ölüm, bir toplama ile hafifçe dokunulduğunda hiçbir hareket göstermeyen hayvanlar olarak puanlanır. Sansür, torbalanmış, vulval / bağırsak çıkıntıları sergileyen veya kurudukları plakanın kenarlarına kadar sürünen hayvanlar olarak puanlanır.
  2. FUDR kullanarak kimyasal sterilizasyon ile kullanım ömrü
    1. NGM-agar plakalarını, tercih edilen 100 μL bakteri içeren plakaları tohumlayarak hazırlayın. Tutarlılık için, tüm replikalarda aynı bakterilerin kullanıldığından emin olun. Yaşam boyu deneyler için suş başına 8-12 plaka ve hayvanları yetişkinliğe yetiştirmek için suş başına iki ila dört plaka tohumlayın. Plakaların gece boyunca kurumasını bekleyin.
    2. Yaşam süresi testi için kullanılacak 8-12 plaka için bakteri çimlerinin ortasına 100 μL 10 mg / mL FUDR ekleyin. Hayvanların yetişkinliğe kadar büyümesine izin vermek için başlangıç plakaları olarak FUDR olmadan iki ila dört plaka bırakmayı unutmayın. Plakaların gece boyunca kurumasını bekleyin.
      DİKKAT: FUDR DNA sentezini bloke eder ve bu nedenle kullanım sırasında eldiven giyilmesi önerilir.
    3. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın.
      NOT: FUDR hayvanların tutuklanmasına / ölmesine neden olacağından, bu hayvanların FUDR içermeyen plakalarda yetiştirilmesi gerekir.
    4. 10-15 gün 1 yetişkin hayvanı, her biri FUDR içeren 8-12 plakaya taşıyın. Standart bir yaşam süresi için, sansür olaylarından sonra örneklem büyüklüğünün 100'ün altına düşmemesini sağlamak için ~ 120 hayvanla başlayın (örneğin; 15 hayvandan oluşan sekiz tabak = 120 hayvan; 10 hayvandan oluşan 12 tabak = 120 hayvan).
      NOT: Soy oluşumundan tamamen kaçınılması zorunluysa, hayvanlar L4 aşamasında da FUDR üzerine taşınabilir, ancak hayvanların vulval / bağırsak çıkıntıları için daha yüksek risk altında olmalarına neden olacağından ve sansürü artıracağından hayvanlar çok erken hareket ettirilmemelidir.
    5. Tüm hayvanlar ölü veya sansürlü olarak puanlanana kadar her gün ömürleri puanlayın. Karışıklığı önlemek ve aynı hayvanı anlatmak için tüm ölü veya sansürlenmiş hayvanları plakadan çıkarın.
      NOT: FUDR ömürleri için, herhangi bir soy L1 aşamasında tutuklanacağı ve sonunda öleceği için göz ardı edilebilir.
  3. Sıcaklığa duyarlı steril mutantların kullanım ömrü
    1. NGM-agar plakalarını, tercih edilen 100 μL bakteri içeren plakaları tohumlayarak hazırlayın. Tutarlılık için, tüm replikalarda aynı bakterilerin kullanıldığından emin olun. Yaşam boyu deneyler için suş başına 8-12 plaka ve hayvanları yetişkinliğe yetiştirmek için suş başına 2-4 plaka tohumlayın. Plakaların gece boyunca kurumasını bekleyin.
    2. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın. Hayvanların steril olmasını sağlamak için hayvanları 25 ° C'lik kısıtlayıcı sıcaklıkta yetiştirmeyi unutmayın.
    3. 10-15 gün 1 yetişkin hayvanı her biri 8-12 plakaya taşıyın. Standart bir yaşam süresi için, sansür olaylarından sonra örneklem büyüklüğünün 100'ün altına düşmemesini sağlamak için ~ 120 hayvanla başlayın (örneğin; 15 hayvandan oluşan sekiz tabak = 120 hayvan; 10 hayvandan oluşan 12 tabak = 120 hayvan).
    4. Tüm hayvanlar ölü veya sansürlü olarak puanlanana kadar her gün ömürleri puanlayın. Karışıklığı önlemek ve aynı hayvanı anlatmak için tüm ölü veya sansürlenmiş hayvanları plakadan çıkarın.
      NOT: Kısa ömürlü suşlarla uğraşırken, 25 ° C'deki ömürler çok daha kısa olduğundan ve bu nedenle dinamik aralık sınırlı olduğundan, her gün ömür puanlama yapılması önerilir. Yazarların deneyimlerine göre, hayvanlar 2. günden sonra 20 ° C'ye geri kaydırılabilir ve ömürleri 20 ° C'de puanlamak tercih edilirse hayvanlar steril kalacaktır.

3. C. elegans'ta sağlık süresinin ölçülmesi

  1. Thrashing yoluyla lokomotor davranışının ölçümleri
    1. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın.
    2. 1. gün yetişkin solucanlardan oluşan küçük bir koloniyi, diseksiyon kapsamı altında bir NGM-agar plakası üzerine 10-20 μL M9 çözeltisi üzerine taşıyın. Sayılabilir yönetilebilir sayıda hayvan olarak 10-15 hayvan önerilir.
    3. Bir seferde bir solucana odaklanarak, numunenin içbükey bir oluşumdan dışbükey formasyona 15 saniyede kaç kez geçtiğini sayın. Bir el sayacı ve bir zamanlayıcı kullanın, böylece tahlil süresi boyunca solucana odaklanılabilir.
      NOT: Daha kapsamlı/kolay analiz için plakanın bir videosu kaydedilebilir. Örneğin, standart mikroskop göz merceği ekleri çoğu akıllı telefon ve dijital kamera için mevcuttur (15-30 $) ve bunlar düşük maliyetle video ezme için mükemmel bir seçenektir.
    4. Sıvıdaki diğer solucanlar için adım 3.1.3'ü tekrarlayın ve 10-15 solucan için toplam hareketlilik oranının ortalamasını alın. Daha yüksek örnek boyutu için 3.1.2-3.1.4 arasındaki adımları yineleyin.
    5. Solucanları istenen yaşa kadar yaşlandırın. Adım 2.1-2.3'te açıklanan yaşam süresi tahlilleri için benzer yöntemler, solucanları yaşlandırmak için kullanılabilir. İstenilen yaşlarda thrashing'i analiz etmek için 3.1.2-3.1.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
      NOT: Adım 3.1.2 için alternatif bir yöntem, bir plaka üzerindeki bir solucan grubuna ~ 30 μL veya daha fazla M9 çözeltisi eklemektir. Bu, solucanları manuel olarak aktarmak zorunda kalmaktan zaman kazandıracaktır, ancak solucanların tek bir plakada nerede olduklarının rastgele şansı nedeniyle, bir grup solucanın plaka üzerinde tek bir noktada kalacağının garantisi yoktur.
  2. C. elegans'ta doğurganlık (yumurta sayısı) ölçümleri
    1. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın. Yumurta sayımı için tahliller, 1. yetişkinlik gününden ~ 1 gün önce (15 ° C'de ~ 3 gün veya L1 tutuklamasından sonra 20 ° C'de ~ 2 gün) olan L4 aşamasında başlar.
    2. L4 solucanlarını, tercih edilen bakterilerle tohumlanmış ayrı NGM-agar plakalarına ayırın. Doğurganlık testi için ~ 10-15 hayvanın kullanılması önerilir.
      NOT: Bakteri çimindeki yumurta görünürlüğünü artırmak için tercih edilen bakterilerin% 50 oranında seyreltilmesi (yani doymuş bir kültür değil) önerilir.
    3. Hayvanların 20 ° C'de bir gecede büyümesine izin verin. Yeni tohumlanmış bir plaka grubunun ertesi gün için hazır olduğundan emin olun.
    4. Yetişkinliğin 1. gününde, yetişkin solucanları, tercih edilen seyreltilmiş bakterilerle tohumlanmış taze NGM-agar plakalarına aktarın.
      NOT: Taze tohumlanmış plakaların kullanılması veya kalın bakteri çimlerini önlemek için kullanıma kadar plakaların 4 ° C'de saklanması önerilir.
    5. Her bir NGM-agar plakasına bırakılan toplam yumurta sayısını sayın.
      NOT: Plakanın taranmasına yardımcı olmak için, bir plakanın kapağına bir ızgara çizilebilir ve yumurtalar için puanlanan plakanın altına yerleştirilebilir. Plaka daha sonra, plaka hareket ettirildikçe oryantasyonu korumak ve herhangi bir yumurtanın yeniden sayılmasını önlemek için ızgara çizgileri boyunca taranabilir.
    6. 3.2.4-3.2.5 adımlarını 7-8 gün boyunca veya yumurtalar plakada artık görünmeyene kadar tekrarlayın.
      NOT: Yumurtlama oranlarının yüksek olduğu 1-3 gün boyunca, hayvanların en az 12 saatte bir taşınması ve günde iki kez yumurta sayımının tahlil edilmesi önerilir. Bununla birlikte, bu, iş miktarını ve sarf malzemelerinin maliyetlerini arttırır ve bu nedenle hareketli hayvanlar ve ölçümler günde bir kez ile sınırlandırılabilir, ancak tüm yumurtaların ve yumurtadan çıkan hayvanların doğru bir şekilde sayılmasını sağlamak için özen gösterilmelidir. Yumurtadan çıkan herhangi bir hayvan, bu tahlilin amacı için yumurta olarak sayılır.
  3. C. elegans soyunun yavru büyüklüğünün (gelişiminin) ölçülmesi
    1. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın. Yavru büyüklüğü için tahliller, 1. yetişkinlik gününden ~ 1 gün önce (15 ° C'de ~ 3 gün veya L1 tutuklamasından sonra 20 ° C'de ~ 2 gün) olan L4 aşamasında başlar.
    2. L4 solucanlarını, tercih edilen bakterilerle tohumlanmış ayrı NGM-agar plakalarına ayırın. Doğurganlık testi için ~ 10-15 hayvanın kullanılması önerilir.
    3. Hayvanların 20 ° C'de bir gecede büyümesine izin verin. Yeni tohumlanmış bir plaka grubunun ertesi gün için hazır olduğundan emin olun.
    4. Yetişkinliğin 1. gününde, yetişkin solucanları tercih edilen bakterilerle tohumlanmış taze NGM-agar plakalarına aktarın.
    5. Her 12-24 saatte bir (günde 2x veya günde 1x), yetişkin solucanları 7-8 gün boyunca veya döller artık görünmeyene kadar tercih edilen bakterilerle tohumlanmış taze NGM-agar plakalarına aktarın. Yumurta içeren tüm plakaları 20 °C'de tutun.
    6. Adım 3.3.5'i 7-8 gün boyunca veya döl artık görünmeyene kadar tekrarlayın. Yumurta içeren tüm plakaları 20 °C'de tutun.
      NOT: Döl plakaları, puanlanmaları gerekmeden önce süreyi uzatmak için 15 ° C'de de saklanabilir.
    7. Solucanları aktardıktan iki gün sonra, plakalardaki gelişmiş soyu sayın. F2 neslinin (yani, soyun soyunun) sonuçları karıştırmadığından emin olmak için L4 aşamasında (yani, 20 ° C'de yumurtadan çıktıktan 2 gün sonra) veya daha önce gelişen solucanları sayın. Canlı olan tüm solucanları sayın.
      1. Tüm solucanları sayıldıkları gibi plakadan çıkarın. Gecikmiş kuluçka / gelişime sahip hayvanların kaçırılmamasını sağlamak için plakaları tekrar puanlamadan önce 1-2 gün daha saklayın.
    8. Toplanan her yumurtlayan plaka için 3.3.7 adımını tekrarlayın.
      NOT: Yavru boyutu testleri, bir deneyden iki veri kümesi toplayarak sarf malzemelerinin işçiliğini ve maliyetlerini en aza indirmek için yumurta sayımı testi (adım 3.2) ile birlikte gerçekleştirilebilir. Bu aynı zamanda aynı hayvanlardaki yavru büyüklüğünün ve yumurta sayısının doğrudan karşılaştırılmasına izin verecektir.

4. C. elegans'ta stres direncinin ölçülmesi

  1. Tunicamycin kullanılarak ER stres duyarlılığının ölçümleri
    1. NGM-agar plakalarını, tunikamisin içeren plakaları (bkz. adım 1.1.7, NOT) tercih edilen 100 μL bakteri ile tohumlayarak hazırlayın.
      DİKKAT: Tunikamisin kullanılırken eldiven giyilmelidir.
    2. Tutarlılık için, tüm replikalarda aynı bakterilerin kullanıldığından emin olun. Hayatta kalma testleri için suş başına 8-12 tunikamisin plakası ve hayvanları yetişkinliğe yetiştirmek için suş başına tunikamisin içermeyen iki ila dört plaka tohumlayın. Plakaların gece boyunca kurumasını bekleyin.
    3. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın.
      NOT: Hayvanlar yetişkinliğin 1. gününe kadar tunikamisin içermeyen plakalarda yetiştirilmelidir, çünkü hayvanlar tunikamisin üzerinde tutuklanacak / ölecektir.
    4. 10-15 gün 1 yetişkin hayvanı her biri 8-12 plakaya taşıyın. Standart bir hayatta kalma testi için, sansür olaylarından sonra örneklem büyüklüğünün 100'ün altına düşmemesini sağlamak için ~ 120 hayvanla başlayın (örneğin, 15 hayvanın sekiz plakası = 120 hayvan; 10 hayvandan oluşan 12 tabak = 120 hayvan).
      NOT: FUDR testlerine benzer şekilde, tunikamisin hayatta kalma testleri, tunikamisin L1 hayvanlarının ölümüne / tutuklanmasına neden olduğundan, hayvanları hareket ettirmeden yapılabilir. Bununla birlikte, bir DMSO kontrolü yapılırken, DMSO plakaları üzerinde soy gelişecektir, bu nedenle hayvanların günlük olarak taşınması veya bir sterilizasyon tekniği gerekecektir (yaşam süreleri için bölüm 2'de kullanılan aynı yöntemler hayatta kalma testleri için kullanılabilir).
    5. Sağkalım tahlilleri yaşam sürelerine benzer şekilde puanlanır. Karışıklığı önlemek ve aynı hayvanı anlatmak için tüm ölü veya sansürlenmiş hayvanları plakadan çıkarın.
      NOT: Her gün hayvanları puanlamak mümkün olsa da, ölüm tunikamisin üzerinde hızla meydana geldiğinden, günlük hayatta kalma tahlillerinin puanlanması önerilir.
  2. Paraquat kullanarak mitokondriyal/oksidatif stres duyarlılığının ölçülmesi
    1. Paraquat içeren plakaları tohumlayarak NGM-agar plakalarını hazırlayın (bkz. adım 1.1.7; NOT) 100 μL bakteri tercih edilir.
      DİKKAT: Paraquat kullanılırken çevresel bir tehlike olduğu için eldiven giyilmelidir. Birçok araştırma kurumu çevresel tehlikeler için özel atma talimatları gerektireceğinden, atma gereklilikleri için kurumun çevre sağlığı ve güvenliği ile kontrol edin.
    2. Tutarlılık için, tüm replikalarda aynı bakterilerin kullanıldığından emin olun. Hayatta kalma tahlilleri için suş başına 8-12 plaka ve hayvanları yetişkinliğe yetiştirmek için suş başına paraquat içermeyen iki ila dört plaka tohumlayın. Plakaların gece boyunca kurumasını bekleyin.
    3. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın.
      NOT: Yetişkinliğin 1. gününe kadar paraquat olmadan tabaklarda hayvan yetiştirmeyi unutmayın; Bununla birlikte, bir sterilizasyon tekniği uygulamak veya yetişkinleri döllerden uzaklaştırmak gerekir, çünkü bazı hayvanlar paraquat plakalarında yetişkinliğe kadar gelişebilir (bkz. adım 2.2-2.3).
    4. 10-15 gün 1 yetişkin hayvanı her biri 8-12 plakaya taşıyın. Standart bir hayatta kalma testi için, sansür olaylarından sonra örneklem büyüklüğünün 100'ün altına düşmemesini sağlamak için ~ 120 hayvanla başlayın (örneğin; 15 hayvandan oluşan sekiz tabak = 120 hayvan; 10 hayvandan oluşan 12 tabak = 120 hayvan).
    5. Sağkalım tahlilleri yaşam sürelerine benzer şekilde puanlanır. Karışıklığı önlemek ve aynı hayvanı anlatmak için tüm ölü veya sansürlenmiş hayvanları plakadan çıkarın.
      NOT: Her gün hayvanları puanlamak mümkün olsa da, ölüm paraquat'ta hızla meydana geldiğinden, günlük hayatta kalma tahlillerinin puanlanması önerilir. Bu, özellikle 25 ° C'de yetiştirilen glp-4 (bn2) hayvanları kullanıldığında geçerlidir, çünkü ölüm çok hızlı bir şekilde gerçekleşecektir.
  3. Yüksek sıcaklıklar kullanılarak ısı stresi duyarlılığı (termotolerans) ölçümleri
    1. Adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi standart bir ağartma testi kullanarak senkronize bir C. elegans popülasyonu toplayın.
    2. NGM-agar plakalarını 37 °C'lik bir inkübatöre en az 1 saat boyunca yerleştirerek hayvanları plakalara taşımadan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
    3. 10-15 gün 1 yetişkin hayvanı, her biri dört ila altı önceden ısıtılmış plakaya taşıyın. Standart bir termotolerans için, ~ 60 hayvanla başlayın (örneğin; 15 hayvandan oluşan dört plaka = 60 hayvan; 10 hayvandan oluşan altı tabak = 60 hayvan)
    4. Hayvanları 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve her 2 saatte bir ölüm için puan alın. Ölüm, bir kazma ile hafifçe dokunulduğunda hiçbir hareket göstermeyen hayvanlar olarak tanımlanır. Karışıklığı önlemek ve aynı hayvanı anlatmak için tüm ölü veya sansürlenmiş hayvanları plakadan çıkarın.
    5. Plakaların 37 °C inkübatörden mümkün olan en az süre boyunca çıkarıldığından emin olun, çünkü puanlama sırasında ortam sıcaklığında uzun süre bırakılan plakalar termotolerans sonuçlarını değiştirecektir.
      NOT: Puan almak için bir seferde yalnızca bir suşu çıkarmanız önerilir, çünkü agarın sıcaklığı bir suşu puanlamak için gereken sürede önemli ölçüde değişmemelidir.
    6. Medyan termotolerans genellikle 7-9 saatte gerçekleştirilir; Bu nedenle, 7 saat, 9 saat ve 11 saatte uygun bir tahlil sağlayın.
      NOT: İnkübatörlerin değişkenliği, plakaların kalınlığı ve her laboratuvardaki diğer kafa karıştırıcı faktörler nedeniyle 1-5 saat atlanabilirken, zaman noktalarının atlanması planlanıyorsa, zamanlamanın her laboratuvarda dikkatli bir şekilde titre edilmesi önemlidir. Termotolerans hakkında tam bir kılavuz için referans 44'e bakınız.
    7. Alternatif olarak, termotolerans testini 37 °C yerine 34 °C'de yapın.
      NOT: 34 ° C'de medyan termotolerans çok daha sonra (bu çalışmada 10-14 saat) gerçekleşir, bu da termotolerans testlerinin gece geç saatlerde hazırlanmasına (34 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirilir) ve puanlamanın ertesi gün erken başlamasına izin verir. Bu, 37 ° C'lik bir termotolerans testi için gereken tipik 12 saatlik periyot yerine ~ 8 saatlik sürekli puanlamaya izin verir.

Sonuçlar

C. elegans, yaşlanma mekanizmalarının büyük çoğunluğunun insanlarla korunması nedeniyle yaşlanma araştırmaları için mükemmel bir model organizmadır. Daha da önemlisi, ekipman ve sarf malzemeleri için minimum gereksinimlerle bakım ve deney konusunda çok düşük bir maliyete sahiptirler, bu da onları sınırlı fonlara sahip kurumlar için imrenilen bir model sistem haline getirir. Dahası, sığ öğrenme eğrilerine sahip basit tahlillerin bolluğu, onları çok az deneyime sahip veya hiç deneyimi olmayan en genç araştırmacı için bile mükemmel bir sistem haline getirir. Tüm bu faktörler, genom düzenleme kolaylığı, nominal maliyetlerle binlerce mevcut mutant ve transgenik hayvan ve hemen hemen her genin genetik olarak yıkılması için mevcut RNAi kütüphaneleri de dahil olmak üzere C. elegans'ın güçlü genetiği ile birleştiğinde, onları lisans kurumları için ideal bir sistem haline getirmektedir. Burada, C. elegans'ta yaşlanmayı incelemek için en düşük maliyetli yöntemlerden bazıları araştırılmış, öncelikle minimum ekipman ve sarf malzemesi maliyeti ile yapılan tahlillere ve sığ öğrenme eğrilerine odaklanılmıştır. Aslında, protokollerin ve veri toplamanın tamamı, çoğunlukla lisans öğrencileri olmak üzere <5 aylık araştırma deneyimine sahip genç araştırmacılar tarafından yazılmıştır / gerçekleştirilmiştir.

C. elegans'taki uzun ömürlülük çalışmaları, hayvanların 14-20 gün arasında değişen kısa ömürleri nedeniyle çok basittir. Daha da önemlisi, ömür boyu testler son derece standartlaştırılmıştır ve sadece bir inkübatör, standart bir diseksiyon mikroskobu, standart bir solucan toplama ve NGM-agar plakalarını hazırlamak için sarf malzemeleri gerektirir. C. elegans'taki ömür ölçümlerinin belki de en maliyet engelleyici yönü, gerekli sarf malzemeleridir. Bunun nedeni, C. elegans'ın kendi kendini dölleyen hermafroditler olmasıdır; bu nedenle, uzun ömür tahlilleri için izlenen yetişkinlerin günlük olarak soydan uzaklaştırılması gerekir. Bununla birlikte, hayvanlar FUDR'ye maruz bırakılarak veya30,31,32 gereken sarf malzemesi miktarını azaltmak için yasaklayıcı 25 ° C'de yetiştirilen sıcaklığa duyarlı germ çizgisi içermeyen glp-4 (bn2) mutantı gibi mutantlar kullanılarak sterilize edilebilir. Burada, yaşam süresi testleri FUDR veya glp-4 (bn2) germ çizgisi olmayan mutantlarla gerçekleştirildi ve bu da steril olmayan hayvanlar üzerinde gerçekleştirilen standart yaşam sürelerine benzer sonuçlar gösterdi. FUDR 45'in veya25 ° C'de büyümenin yaşam süresi 2 üzerindeki etkileri nedeniyle vahşi tip ömürler aynı olmasa da, kısa ömürlü hsf-1 nakavt hayvanı, tüm koşullar için yaşam süresinde önemli bir azalma olduğunu güvenilir bir şekilde göstermektedir (Şekil 1). hsf-1, termal stres tepkisinin düzenlenmesinde rol oynayan ısı-şok faktörü-1 transkripsiyon faktörünü kodlar ve nakavt, yaşam süresi 38,46'da önemli bir azalmaya neden olur.

Uzun ömürlülük, yaşlanma biyolojisinde dikkate alınması gereken önemli bir faktör olsa da, çoğu zaman, uzun ömürlülük, C. elegans47'de bile, artan sağlıkla ilişkili değildir. Bu nedenle, tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, üreme sağlığı, lokomotor davranış ve stres direnci dahil olmak üzere organizma sağlığını ölçmek için çeşitli yöntemler sunuyoruz. Üreme sağlığı iki yoldan biriyle ölçülebilir. İlk olarak, yumurta sayımı ölçümleri, kendi kendine döllenen tek bir hermafrodit tarafından kaç yumurta bırakıldığının doğrudan bir ölçümünü verecektir. Bununla birlikte, hayvanlar spermden daha fazla yumurta ürettiğinden, asla canlı soy üretmeyecek bazı döllenmemiş yumurtalar daserilir 48. Bu nedenle, bir hayvanın gerçek üreme kapasitesini daha iyi anlamak için, yavru büyüklüğünün ölçümleri, kaç tane canlı yavru üretildiğinin bir ölçüsünü sağlar. Çoğu zaman, artan stres direnci, potansiyel olarak algılanan stresin üreme üzerindeki doğal etkisinden dolayı üreme kapasitesini azaltabilir49. Benzer şekilde, hem yumurtlayan yumurta sayısında hem de yavru boyutunda, vahşi tip kontrollere kıyasla hsf-1 aşırı ekspresyon hayvanlarında önemli bir azalma bulunmuştur (Şekil 2A, B). Aslında, bazı hsf-1 aşırı ekspresyon hayvanları, üreme sağlığının uzun ömürlülükle ters orantılı olabileceğine dair kanıt sağlayan tam sterilite sergiler.

Üreme sağlığı, germline sağlığını, fonksiyonel mayozu ve üreme kapasitesini anlamak için önemli olsa da, genel olarak, uzun ömürlülük ile yavru büyüklüğü50 arasında doğrudan bir ilişki yoktur. Bu nedenle, tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, lokomotor davranışı,51 yaşı sırasında C. elegans sağlık süresini test etmek için altın standart bir yöntem olarak sunulmaktadır. Lokomotor davranışını ölçmek için birçok yöntem vardır, ancak çoğu yöntem sofistike kameralar, izleme yazılımları veya pahalı kimyasallar gerektirir. Buna karşılık, ezme testleri, standart bir C. elegans laboratuvarının sahip olduğu ekipmanın ötesinde neredeyse hiçbir ekipman gerektirmez: diseksiyon mikroskobu, solucan toplama, pipet ve NGM-agar plakaları yapmak için sarf malzemeleri. Thrashing oranları, yaşlı hayvanlarda genç hayvanlara kıyasla thrashing'de önemli bir azalma ile ölçüldüğü gibi, yaşlanma sırasında sağlık süresini ölçmek için güvenilir bir yöntem sağlar (Şekil 2C).

Son olarak, stres tahlillerine hayatta kalmak, esnekliğin ek bir fizyolojik ölçümüdür. Stres tepkilerini aktive etme kapasitesi genellikle yaşlanma sürecinde azalır, bu da hayvanları daha az esnek ve strese karşı daha duyarlı hale getirir. Böylece, stres direnci organizma sağlığı için güvenilir bir vekil olarak kullanılabilir. Burada, 1) N'ye bağlı glikozilasyonu bloke eden ve ER'de yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine neden olan kimyasal bir ajan olan tunikamisin maruziyetine yanıt olarak ER stresine duyarlılığı araştırmak için yöntemler sunulmaktadır; 2) mitokondride süperoksit oluşumunu indükleyen kimyasal bir ajan olan paraquat'a maruz kalma yoluyla mitokondriyal / oksidatif stres; ve 3) yüksek sıcaklıklara maruz kalma yoluyla termal stres. Tunikamisin ve paraquat tahlilleri için, ilaç plaka üretimi sırasında NGM-agar plakasına dahil edilir. Yüksek konsantrasyonlarda tunikamisin için, döl genellikle gelişmez ve bu nedenle sterilizasyon tekniklerinin kullanılmasına gerek yoktur. Burada sunulan protokol, tunikamisinin nihai konsantrasyonu olarak 25 ng / μL'yi önermektedir, ancak sınırlı fonları olanlar için 10 ng / μL de sağkalımda önemli bir azalma göstermektedir (Şekil 3A). Her iki konsantrasyon da döl gelişimini sınırlar ve bu nedenle sterilizasyon yöntemlerine gerek yoktur, ancak DMSO kontrolü bir sterilizasyon tekniği veya hayvanların yeni plakalara taşınmasını gerektirecektir. Bunun nedeni, tunikamisin toksisitesinin döl gelişimini önlemesidir, ancak DMSO neredeyse toksik değildir, bu da tunikamisin üzerinde yetiştirildiğinde soyunun tamamen gelişmesine izin verir.

Paraquat tahlilleri için, paraquat tedavisi döllerin yetişkinliğe kadar gelişmesini engellemediğinden, bir sterilizasyon tekniği veya hayvanların hareketi gereklidir. Yüksek paraquat seviyeleri (4 mM) ömrü önemli ölçüde kısaltırken, düşük paraquat seviyeleri (0.25 mM), daha önce yayınlanan sonuçlarla tutarlı olarak hormetik bir etki nedeniyle ömrü uzatır (Şekil 3B)52. Son olarak, termotolerans testleri sadece 30-37 ° C'ye ulaşabilen bir inkübatör gerektirir ve ek reaktiflere gerek yoktur. HSF-1'in aşırı ekspresyonu, daha önce yayınlandığı gibi 37 ° C'de termotoleransı arttırır (Şekil 3C)53. Bununla birlikte, diğerlerinin daha önce ve mevcut verilerden gösterdiği gibi, termotolerans testleri ile ilgili en büyük sorun değişkenlikleridir. Termotolerans analizlerindeki değişkenliğe birçok faktör katkıda bulunabilir, inkübatörler arasındaki farklar ve hayvanların her saat termotoleransı puanlarken inkübatörün dışında geçirdikleri zaman da dahil olmak üzere. Kapsamlı bir termotolerans kılavuzu için, referans 41'e bakın.

figure-results-1
Şekil 1: Sterilizasyonlu ve sterilizasyonsuz ömür ölçümlerinin karşılaştırılması. (A) 20 °C'de boş vektör (ev) veya hsf-1 RNAi bakterileri ile tohumlanmış NGM-agar plakalarında yetiştirilen vahşi tip N2 nematodlarının ömrü. Hayvanlar, yetişkinliğin 1, 3, 5 ve 7. günlerinde soydan uzaklaştırıldı. (B) 20 °C'de boş vektör (ev) veya hsf-1 RNAi bakterileri ile tohumlanan NGM-agar-FUDR plakalarında yetiştirilen vahşi tip N2 nematodlarının ömrü. Hayvanlar standart ev veya hsf-1 RNAi plakalarında yetişkinliğe yetiştirildi ve daha sonra yetişkinliğin 1. gününde FUDR plakalarına taşındı. (C) 25 °C'de boş vektör (ev) veya hsf-1 RNAi ile tohumlanmış NGM-agar plakaları üzerinde yetiştirilen glp-4(bn2) mutant hayvanların ömürleri. Tüm koşullar için, tüm hayvanlar ölü olarak kaydedilene veya sansürlenene kadar her 2 günde bir hayvanlar ölüm için puanlandı. Vulvanın torbalanması, çıkıntısı veya patlaması olan veya plakaların kenarlarından yukarı doğru sürünen ve kurutulan hayvanlar sansürlendi. Tüm istatistikler Log-Rank Mantel-Cox testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve Tablo 2'de bulunabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Yumurta sayısı, yavru büyüklüğü ve sağlık ölçümü olarak thrashing . (A) Thrashing testleri, 1. gün (mavi), 4. gün (kırmızı) ve 9. gün (yeşil) hayvanlarda 25 °C'de boş vektörle tohumlanmış NGM-agar plakaları üzerinde yetiştirilen glp-4 (bn2) mutant hayvanlar üzerinde gerçekleştirildi. Bir NGM-agar plakası üzerinde M9 çözeltisine yerleştirilen hayvanlarda thrashing puanlandı, standart bir diseksiyon kapsamının göz merceğine monte edilmiş standart bir akıllı telefon kamerası kullanılarak video kaydedildi ve doğruluk için ağır çekimde thrashing puanlandı. n = koşul başına 15 hayvan. (B) Yumurta sayıları vahşi tip N2 (mavi) ve sur-5p::hsf-1 (kırmızı) hayvanlarda ölçülmüştür. Hayvanlar 20 ° C'de yetiştirildi ve taze plakalara taşındı ve yumurtalar her 12 saatte bir sayıldı. Atılan toplam yumurta sayısı toplandı. n = vahşi tip için 7 hayvan ve sur-5p için 9 hayvan::hsf-1. (C) Kuluçka tahlilleri, yumurtaların kuluçkaya izin vermek için 2 gün boyunca 20 ° C'de yetiştirildiği (B) ile aynı hayvanlar üzerinde ölçüldü ve yumurtadan çıkan tüm yumurtalar sayıldı. = p < 0.001 parametrik olmayan Mann-Whitney testi kullanılarak hesaplanmıştır. Her nokta tek bir hayvanı temsil eder ve çizgiler medyan ve çeyrekler arası aralığı temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Organizma sağlığına bir vekil olarak stres direnci. (A) 20 ° C'de boş vektör RNAi bakterilerinde yetiştirilen N2 hayvanlarının hayatta kalma testi. Hayvanlar, yetişkinliğin 1. gününde %1 DMSO, 10 ng/μL tunikamisin (TM) veya 25 ng/μL TM içeren plakalara taşındı. (B) 20 °C'de boş vektör RNAi bakterileri üzerinde yetiştirilen N2 hayvanlarının hayatta kalma testi. Hayvanlar, kapaktan su, 0.25 mM paraquat (PQ) veya 4 mM PQ içeren plakalar üzerinde yetiştirildi. A-B için, tüm hayvanlar ölü olarak kaydedilene veya sansürlenene kadar her 2 günde bir hayvanlar ölüm için puanlandı. Vulvanın torbalanması, çıkıntısı veya patlaması olan veya plakaların kenarlarından yukarı doğru sürünen ve kurutulan hayvanlar sansürlendi. Tüm istatistikler Log-Rank Mantel-Cox testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Tablo 2). (C) Vahşi tip N2 hayvanları için tüm 37 °C termotolerans testlerinin hsf-1'in aşırı ekspresyonuna karşı toplanan veriler (sur-5p::hsf-1). Veriler, bir termotolerans testinin 9 saati olan zamanda canlı yüzde = 9 saat olarak temsil edilir ve her çizgi aynı gün gerçekleştirilen eşleşen bir deneyi temsil eder. Hayvanlar 20 ° C'de boş vektör RNAi bakterileri üzerinde yetiştirildi ve tahlil için yetişkinliğin 1. gününde 37 ° C'ye taşındı. n = replika başına suş başına 60 hayvan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ReaktifYemek tarifi
Ağartıcı çözeltisi%1,8 (v/v) sodyum hipoklorit, 0,375 M KOH
KarbenisilinSuda 100 mg/mL stok çözeltisi (1000x). 6 aya kadar 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın
FUDRSuda 10 mg/mL çözelti. -20 °C'de saklayın.
IPTGSuda 1 M çözelti.
Lizojen Et Suyu (LB)Bu protokolde, ticari LB kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu), ancak Bacto-tripton, maya özü ve NaCl kullanan tüm standart LB ev yapımı tarifler yeterlidir.
M9 çözümü22 mM KH 2 PO4 monobazik, 42,3 mM Na2HPO 4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSOİ 4
Nematod Büyüme Ortamı (NGM)1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgS.4, %2 (w/v) agar, %0.25 (w/v) Bakto-Pepton, 51.3 mM NaCl
NGM RNAi plakaları1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, %2 (w/v) agar, %0.25 (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL karbenisilin/ampisilin. 4 ° C'de karanlıkta 3 aya kadar saklayın
NGM RNAi DMSO1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, %2 (w/v) agar, %0.25 (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL karbenisilin/ampisilin; %1 DMSO
(tunikamisin için kontrol)
NGM RNAi TM1 mM CaCl 2, 5 μg/mL kolesterol, 25 mM KPO 4 pH 6.0, 1 mM MgSO4, %2 (w/v) agar, %0.25 (w/v) Bacto-Peptone, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL karbenisilin/ampisilin; %1 DMSO, 25 ng/μL tunikamisin
ParaquatSuda 400 mM çözelti – taze hazırlanmalıdır
Tetrasiklin0 etanol içinde 10 mg/mL stok çözeltisi (500x). -20 °C'de saklayın
Tunikamisin0 DMSO'da 2,5 mg/mL stok çözeltisi. Uzun süreli depolama için -80 °C'de saklayın. Bu 100x çözümdür (25 ng/μL çalışma çözümü)

Tablo 1. Protokoller için reaktifler ve medya tarifleri.

İlgili Şekil paneliGerinim, TedaviOrtalama Ömrü# Ölümler/# Toplamp-değeri
(Log-Rank)
1AN2, RNAi vektörü, 20 °C1774/120--
N2, hsf-1 RNAi, 20 °C1165/120<0,001
1BN2, vektör RNAi, FUDR, 20 °C19120/120--
N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C11116/120<0,001
1CN2, glp-4(bn2), RNAi vektörü, 25 °C13115/121--
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C4120/120< 0,001
2AN2, vektör RNAi, 20 °C, %1 DMSO1985/120--
N2, vektör RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunikamisin15109/120<0,001
N2, vektör RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunicamycin12117/120<0,001
2BN2, RNAi vektörü, 20 °C1984/120--
N2, vektör RNAi, 20 °C, 0.25 mM paraquat2491/120<0,001
N2, vektör RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat650/120<0,001

Tablo 2. Yaşam süresi ve strese dayanıklılık istatistikleri.

Tartışma

En basit şekilde yaşam süresi olarak tanımlanan yaşam süresi, çoğu organizmada açık bir ikili fenomendir - bir organizma yaşıyor ya da yaşamıyor. Bununla birlikte, uzun ömürlülük her zaman bir organizmanın sağlığı ile ilişkili değildir. Örneğin, mitokondriyal strese maruz kalmanın ömrünü önemli ölçüde artırdığı mitokondriyal hormez modelleri genellikle en uzun ömürlü hayvanlardan bazılarıdır, ancak bodur büyüme ve azalmış metabolik fonksiyon sergiler37,54. Benzer şekilde, hiperaktif endoplazmik retikulum stres yanıtı olan hayvanlar, protein homeostazını ve ömrünü önemli ölçüde iyileştirmiş olmalarına rağmen, azalmış sağlıkla ilişkili olabilecek belirli davranışlar ve fenotipler sergilerler 36,49. Son olarak, model organizmalarda artan HSF-1 fonksiyonu55, artmış XBP-1 fonksiyonu 56 ve değiştirilmiş FoxO sinyal57 dahil olmak üzere birçok uzun ömür paradigması, artan kanser riski ile ilişkilidir ve bir organizma kanser ve diğer sağlık hastalıkları ile sürekli bir mücadele içindeyse, uzun ömrün yararlı olmadığı tartışılmazdır. Bu nedenle, uzun ömürlülük yaşlanma biyolojisinde bağımsız bir ölçüm olamaz.

Bu nedenle, sağlık süresi kavramı yaşlanma biyolojisinde büyüyen bir alan olmuştur. Gevşek bir şekilde kişinin sağlıklı olduğu yaşam süresi olarak tanımlanan sağlık süresi, uzun ömürlülükten daha zordur. Bununla birlikte, uzun ömürlülüğün aksine, organizma sağlığına birçok farklı okuma olduğu için "sağlık" kavramı karmaşıktır: organizma düzeyinde, kas fonksiyonu / gücü, nöronal / bilişsel işlev, üreme sağlığı vb. Vardır; hücresel düzeyde protein homeostazı, lipid homeostazı, glikoz homeostazı, metabolizma vb. Vardır. 2014 yılında, yaşlanan biyologlar, yaşlanmanın biyolojik özelliklerini, yaşlanma sırasında doğal olarak parçalanan ve deneysel alevlenmenin yaşlanmayı hızlandırması ve deneysel müdahalenin yaşlanmayı yavaşlatması gerektiği şekilde deneysel olarak değiştirilebilecek bir şey olması gerektiği yapılandırılmış tanımıyla kesin olarak karakterize etmişlerdir. Yaşlanmanın bu dokuz ayırt edici özelliği arasında genomik instabilite, telomer yıpranması, epigenetik değişiklikler, protein homeostazı kaybı (proteostaz), kök hücre tükenmesi, değişmiş hücreler arası sinyalleşme, mitokondriyal disfonksiyon, deregüle besin algısı ve hücresel yaşlanma58 sayılabilir. O zamandan beri, çok sayıda çalışma, hücre dışı proteinler ve bağışıklık ve inflamasyon gibi sistemik fizyoloji de dahil olmak üzere diğer faktörlerin dahil edilmesi gerektiğini savunuyor59. Nihayetinde, healthspan'ın karmaşık tanımı, organizma sağlığının birden fazla farklı yöntem kullanılarak ölçülmesini zorunlu kılar.

Bu nedenle, bu makalede, nematod modeli C. elegans kullanılarak sağlığın çeşitli yönlerini ölçmek için birçok yöntem sunulmuştur. Lokomotor davranışlarını ezme tahlilleri, yumurta sayısı ve yavru büyüklüğünü kullanarak üreme sağlığını ve strese duyarlılığı test ediyoruz. Gerçekten de, lokomotor davranışı, organizmalar51 yaşlılık sırasında önemli hareketlilik ve hareket kaybı sergilediğinden, sağlık süresini ölçmek için altın standart bir yöntemdir. Lokomotor davranış kaybı, yaşlanmanın birçok ayırt edici özelliğine atfedilebilir, çünkü C. elegans'taki kas fonksiyonu uygun proteostaz60, mitokondriyal disfonksiyon61 ve nöron-kas sinyalizasyonu62'ye bağlıdır. Bu makale lokomotor davranışın bir ölçümüne odaklanırken, katı bir agar plakası üzerindeki hayvanların hareketliliği, dokunma51'e yanıt ve kemotaksis tahlilleri63 dahil olmak üzere birçok başka yöntemin var olduğunu belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle daha karmaşık kayıt cihazları, solucan izleme yazılımının kullanımı veya pahalı, tehlikeli veya uçucu kimyasalların kullanılmasını gerektirir ve bunların hepsi bazı araştırma ortamlarında engelleyici olabilir.

Ek olarak, yumurta sayısı ve yavru büyüklüğü için yapılan tahliller, üreme sağlığını ölçmenin bir yöntemi ve yetişkin solucanlarda hücre bölünmesini ölçmek için en basit yöntem olarak sunulmaktadır, çünkü yetişkin solucanlar post-mitotiktir ve sadece germ hücreleri ve embriyolar yetişkin bir solucan içinde hücre bölünmesine uğrar64. Hücre bölünmesinin bir ölçüsü olarak, üreme sağlığı, hücresel yaşlanma ve kök hücre tükenmesinin yaşlanma özellikleri ile ilgili olabilir. Üreme sağlığı, patojenik enfeksiyon65 veya strese maruz kalma49 dahil olmak üzere birçok faktörden etkilenebilir, ancak üreme sağlığı ile uzun ömürlülük arasında doğrudan bir ilişki yoktur. Aslında, bazı uzun ömürlü hayvanlar yavru büyüklüğü49'da önemli bir düşüş gösterir ve hatta uzun ömürlülük ile yavru büyüklüğü50 arasında ters bir korelasyon olması bile mümkündür. Bu, C. elegans'a özgü bir fenomen değildir, çünkü üremenin uzun ömürlülük üzerindeki zararlı etkileri uzun zamandır insanlarda66, refakatçi köpeklerde 67 ve farelerde68 gözlenmiştir. Yine de, üreme sağlığının uzun ömürlülük veya sağlık süresi ile ilişkili olmayabileceği uyarısıyla üreme sağlığını ölçmek için güvenilir ve düşük maliyetli bir yöntem olarak yumurta sayısı ve yavru büyüklüğü sağlıyoruz.

Son olarak, hayatta kalma testleri organizma sağlığının dolaylı bir ölçüsü olarak sunulmaktadır. Önemli olarak, termal stres69 ve ER stres35'e yanıt da dahil olmak üzere hücresel stres tepkileri, yaşlanma sürecinde hızla azalır ve proteostaz 70,71'in yaşlanma özelliği ile doğrudan ilgilidir. Buna karşılık, aşırı aktive edici stres tepkileri, strese karşı direnci teşvik ederek ömrü önemli ölçüde artırabilir35,37,38. Bu çalışma en basit ve en düşük maliyetli yöntemlere odaklanırken, termotolerans41 ve oksidatif stres66 için stres direnci testleri için her biri farklı bir ekipman ve sarf malzemesi seti gerektiren çok sayıda alternatif yöntem bulunmaktadır. Stresörlere basit maruz kalma çalışmalarının ötesinde, ekipmana erişime bağlı olarak diğer fizyolojik yöntemler de uygulanabilir. Örneğin, bir hücre dışı akı analizörü mitokondriyal fonksiyonu ve hücresel solunumu izleyebilir73; floresan diseksiyon mikroskopları, stres yanıtı aktivasyonu için transkripsiyonel raporlayıcıların ölçümlerine izin verecektir20; ve yüksek çözünürlüklü bileşik veya konfokal mikroskoplar, mitokondri 74, endoplazmik retikulum 75,76 ve aktin sitoiskelet 77 için floresan problarla organel morfolojisini ölçmek içinkullanılabilir.

Uzun ömürlülük ölçümleri için son bir uyarı hikayesi olarak, solucanları sterilize etmek için kimyasal ve genetik yöntemler maliyeti önemli ölçüde azaltmak için sunulurken, her ikisinin de ömrü doğrudan etkileyebileceğini belirtmek önemlidir. Örneğin, FUDR'ye maruz kalmanın daha önce hem ömrü hem de termotoleransı etkilediği bildirilmiştir45. Glp-4 (bn2) mutantının kendisinin yaşam süresi üzerinde doğrudan bir etkisi olmasa da, 25 ° C'deki büyüme hafif bir ısı stresi 33,34'tür ve bu nedenle ömrü etkileyebilir 2. C. elegans'ı sterilize etmek için, oksin aracılı sterilite78 veya alternatif sıcaklığa duyarlı sperm eksikliği olan mutantlar79 dahil olmak üzere başka yöntemler de vardır. Bununla birlikte, tüm yöntemlerin bazı uyarıları vardır ve her laboratuvarın bilimsel ihtiyaçları için en az zararlı tahlilin kullanılmasına özen gösterilmelidir. Uzun ömürlülük çalışmalarının son bir sınırlaması, düşük örneklem büyüklükleri nedeniyle veya sadece araştırmacı tarafından yapılan objektif bir hatayla ortaya çıkabilecek potansiyel değişkenliktir. Yeni teknolojiler otomatik ömür teknolojileri80'de doğduğu için bu durum atlatılabilir, ancak yine de bu sistemler maliyetlidir ve bazı mühendislik ve hesaplama ekipmanı ve becerileri gerektirir. Nihayetinde, burada sağlanan yöntemlerin toplanması, hemen hemen her kurumda hızlı bir şekilde uyarlanabilen ve öğrenilebilen ve yaşlanma biyolojisi için sağlam bir temel sağlayan güvenilir bir araç setidir.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

G.G. T32AG052374 tarafından desteklenmektedir ve R.H.S. Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'nden R00AG065200 tarafından desteklenmektedir. CGC'ye (NIH Araştırma Altyapısı Programı P40 OD010440 tarafından finanse edilen) suşlar için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RNAiAPEX IPTGGenesee18-242
NGM plakaları içinBacto AgarVWR90000-764
NGM plakaları içinBacto PeptoneVWR97064-330
NGM plakaları içinkalsiyum klorür dihidratVWR97061-904
RNAiKarbenikilinVWR76345-522
NGM plakaları için80057-932
DMSOVWRBDH1115-1LPilaçlar için çözücü
LB Et suyuVWR95020-778LB
Magnezyum sülfat heptahidratVWR97062-132NGM plakaları için,
oksidatif/mitokondriyal stres içinParaquatSigma-Aldrich36541
Potasyum KlorürVWRÇamaşır suyu çözeltisi için 97061-566
NGM plakaları içinfosfat dibazikVWREM-PX1570-2
S7E Diseksiyon KapsamıiçinStandart diseksiyon mikroskobu
NGM plakaları içinSodyum KlorürVWR EM-SX0420-5
Sodyum hipokloritÇamaşır suyu çözeltisi içinVWR RC7495.7-32
Tetrasiklin hidroklorürRNAiVWR97061-638
ER stresi içinSigma-AldrichT7765-50MG
için Kolesterol VWR için için M9potasyum M9 potasyum fosfat monobazik VWR EM-PX1565-5 Leica 10450840 , M9 M9 için sodyum fosfat dibazik VWR 71003-472 Tunicamycin için

Kaynaklar

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  3. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  4. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  5. Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
  6. Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, Suppl 1 10-16 (2014).
  7. Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
  8. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  9. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994(2020).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  12. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  13. Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
  14. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  15. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  16. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011(2019).
  17. Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
  18. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545(2009).
  19. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
  20. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001(2020).
  21. Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
  22. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  23. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  24. Kim, H. -M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106(2019).
  25. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  26. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19648/ (2006).
  27. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
  29. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
  30. Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
  31. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), Cambridge, England. 755-766 (1992).
  32. Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
  33. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  35. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  36. Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489(2020).
  37. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  38. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  39. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  40. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  41. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  42. Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203(2013).
  43. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  44. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), San Diego, Calif. 450-457 (2014).
  45. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964(2014).
  46. Hsu, A. -L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  47. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
  48. Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
  49. Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
  50. Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), Albany NY. 986-994 (2016).
  51. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  52. Lee, S. -J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
  53. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
  54. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  55. Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
  56. Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069(2020).
  57. Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
  58. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  59. Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
  60. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  61. Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  62. Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
  63. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069(2013).
  64. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  65. Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
  66. Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
  67. Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082(2013).
  68. Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
  69. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  70. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  71. Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fragi.2022.860404 (2022).
  72. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086(2017).
  73. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  74. Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749(2017).
  75. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  76. Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441(2020).
  77. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
  78. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  79. Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
  80. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Yaşam Süresi ÖlçümüSağlık Süresi AnaliziYaşlanma BiyolojisiNematod SenkronizasyonuÇırpınma AnaliziBatın BüyüklüğüStres DirenciGenetik Analiz
Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.