Pulmoner fibrozisin patogenezini aydınlatmak ve yeni ilaç hedefleri bulmak için bleomisin kullanılarak çeşitli hayvan pulmoner fibrozis modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, akciğer dokusunu hedef alan çoğu pulmoner fibroz modelinde eşit olmayan ilaç uygulaması vardır. Burada, nazal bleomisin nebulizasyonunun neden olduğu tek tip pulmoner fibrozis modelini öneriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nazal Bleomisin Nebulizasyonunun Neden Olduğu Pulmoner Fibrozisin Bir Fare Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Pulmoner fibroz, çeşitli nedenlerden kaynaklanan çeşitli insan akciğer hastalıklarının karakteristiğidir. Tedavi seçeneklerinin oldukça sınırlı olduğu göz önüne alındığında, fare modelleri yeni anti-fibrotik stratejiler geliştirmek için önemli bir araç olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, klinik hastalık özelliklerini yakından taklit eden bir pulmoner fibrozis fare modeli oluşturmak için intrapulmoner bleomisin (BLM) uygulaması nazal nebulizasyon ile gerçekleştirilmiştir. C57BL / 6 fareleri, art arda 3 gün boyunca nazal nebulizasyon ile BLM (7 U / mL, 30 dakika / gün) aldı ve akciğer dokusundaki enflamatuar ve fibrotik değişiklikleri gözlemlemek için 9, 16 veya 23. günlerde sakrifiye edildi. Nazal aerosolize BLM doğrudan akciğerleri hedef alarak yaygın ve homojen akciğer iltihabı ve fibrozis ile sonuçlandı. Böylece, tipik insan pulmoner fibrozunun deneysel bir fare modelini başarıyla oluşturduk. Bu yöntem, çeşitli nazal aerosollerin uygulanmasının akciğer patofizyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek ve yeni anti-enflamatuar ve anti-fibrotik tedavileri doğrulamak için kolayca kullanılabilir.
Giriş
Pulmoner fibrozis, başta tip I kollajen olmak üzere hücre dışı matriks bileşenlerinin akciğerlerin interstisyumunda aşırı birikmesinin akciğer fonksiyonunun bozulmasına yol açtığı ilerleyici bir hastalık sürecidir1. Pulmoner fibrozisin patofizyolojisi karmaşıktır ve tedavi seçenekleri şu anda oldukça sınırlıdır. Fare modelleri, hastalığın ortaya çıkmasına ve ilerlemesine katkıda bulunan patojenik mekanizmaların yanı sıra ilaç geliştirme için yeni stratejileri incelemek için önemli bir araç olmaya devam etmektedir.
Pulmoner fibrozun çeşitli hayvan modelleri, BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12'nin intratrakeal damlatılmasına dayanır. Bununla birlikte, BLM'nin akciğerlerde neden olduğu fibrotik değişikliklerin dağılımı tek tip değildir ve hayvanlar damlatma işlemi sırasında boğulma riski altındadır. BLM'nin intraperitoneal enjeksiyonu akciğerde nispeten homojen fibrotik değişikliklere neden olmasına rağmen, yetersiz ilaç hedeflemesi nedeniyle çoklu dozlar gerektirir. Bir laringoskop ile intratrakeal aerosol uygulaması, trakeotomi veya ponksiyon gerektirmez ve sonuçta akciğer içinde ortaya çıkan ilaç dağılımı optimaldir. Bununla birlikte, aerosol haline getirilmiş partiküller büyüktür (5-40 μm) ve bu nedenle akciğer dokusunun subplevral bölgesine ulaşamaz.
Bu çalışmada, BLM'nin intrapulmoner uygulaması nazal nebulizasyon ile gerçekleştirilmiştir. Nebulizasyon sırasında, fareler kendiliğinden nefes aldı ve ilaç parçacıklarını soludu. Aerosol haline getirilmiş partiküller 2.5-4 μm boyutundaydı, bu da sadece akciğer boyunca eşit olarak dağılmalarını değil, aynı zamanda subplevral alana ulaşmalarını da sağladı. Düşük büyütme altında, idiyopatik pulmoner fibrozisli (İPF) hastaların en belirgin akciğer histopatolojik özellikleri, lezyonların değişen şiddeti, tutarsız dağılım, farklı faz lezyonlarının alternatif dağılımı ve normal akciğer dokusu ile dönüşümlü olarak interstisyel inflamasyon, fibrotik lezyonlar ve petek akciğer değişikliklerinin varlığıdır. Bu patolojik değişiklikler ağırlıklı olarak bronşiyoller etrafındaki periferik subplevral parankimi veya lobüler septumu içerir. Bu nedenle, bu yaklaşımın BLM partiküllerinin akciğerlerin subplevral bölgesine ulaşmasını sağladığı göz önüne alındığında, bu model insanlarda hastalığın klinik özelliklerini yakından simüle eder.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çin-Japonya Dostluk Hastanesi (Pekin, Çin) Hayvan Çalışmaları Komitesi, bu çalışmanın bir parçası olarak gerçekleştirilen fareleri içeren tüm prosedürleri onayladı (NO.190108). Fareler, Çin-Japonya Dostluk Klinik Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nün steril hayvan odasında, 20-25 °C oda sıcaklığında, %40-70 bağıl nemde, hayvan ışık yoğunluğu 15-20 LX ve 12 saat / 12 saat boyunca alternatif aydınlık ve karanlıkta tutuldu. Hayvanların yiyecek ve suya ücretsiz erişimi vardı.
1. Fareler
- Nebulizasyondan önce tüm hayvanların 7 gün boyunca barınma tesisine alıştığından emin olun.
- Nebulizasyon için 8-10 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri kullanın.
2. Nazal bleomisin nebulizasyonu
- Bleomisin preparasyonu
DİKKAT: BLM, tümörleri öldüren ancak normal hücrelere ve normal dokulara da zarar verebilen kimyasal bir zehirdir.- BLM solüsyonunu temiz bir tezgahta hazırlayın.
- Çalışma konsantrasyonunu (7 U/mL) elde etmek için, 15 U BLM hidroklorürü 2.14 mL normal salin içinde yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan BLM'yi tamamen eriyene kadar dikkatlice karıştırın.
- Çalışma solüsyonunu 4 °C'de veya buz üzerinde saklayın ve 1 gün içinde kullanın. Nebulizasyondan önce BLM çözeltisini oda sıcaklığına getirin.
- BLM solüsyonunu temiz bir tezgahta hazırlayın.
- Anestezi
- 0.1 g pentobarbital sodyumu 10 mL normal salin içinde çözerek anesteziye hazırlanın. Çalışma anestezi solüsyonunu karanlık bir yerde 4 °C'de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
- Pentobarbital sodyumu, 26 G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, 75 mg / kg vücut ağırlığının son dozunda karın içine enjekte ederek fareleri uyuşturun.
NOT: Bu çalışmada, fareler bu doza en az 30 dakika boyunca cevap vermedi. Gerekirse, farenin yanıtına göre veterinere danışarak dozu ayarlayın. - Birkaç dakika sonra, uzuv geri çekilme refleksinin kaybolduğundan emin olmak için anestezi uygulanmış farenin ayak parmaklarına işaret parmağı ve başparmağınızla bastırın.
- Nebulizasyon sisteminin hazırlanması
- Cihazı kalibre ettikten sonra, anestezi uygulanmış fareyi yumuşak bir ağ örtüsü ile sabitleyin (Şekil 1A), çalışan BLM solüsyonunu bir pipet ile pozlama kulesinin üst atomize kafasına ekleyin (Şekil 1B) ve kararlı atomizasyon elde etmek için nebulizatörü 30 dakika çalıştırın.
NOT: İş akışı Şekil 1C,D'de gösterilmiştir. Yazılımın ayrıntılı işlem adımları için, 1-2.3.1.1-2.3.1.9 adımlarını gösteren Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S2'ye bakın.- flexiWare 8 simgesine (Ek Şekil S1A) çift tıklayın, deney oturumuna tıklayın (Ek Şekil S1B) ve Yeni Çalışma düğmesine (Ek Şekil S1C) tıklayın.
- Deney adını düzenleyin (Ek Şekil S1D) ve Başlık ve Sahibi'ni düzenleyin (Ek Şekil S1E).
- IX-4DIO şablonunu seçin (Ek Şekil S1F), operatörü girin (Ek Şekil S1G), Onayla düğmesine tıklayın (Ek Şekil S1H) | İleri düğmesi (Ek Şekil S1I).
- Pompayı seçin ve ileri'ye tıklayın (Ek Şekil S1J) | İleri düğmesi (Ek Şekil S2A) | İleri düğmesi (Ek Şekil S2B) | Bitir düğmesi (Ek Şekil S2C).
- Continuous-1Lmin için Ayarlar'a tıklayın (üç nokta, Ek Şekil S2D) | DIO1, Görev Döngüsü'nü (%) %25 olarak ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın (Ek Şekil S2E).
- DIO2'ye tıklayın, Görev Döngüsü'nü (%) %25'e ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın (Ek Şekil S2F).
- DIO3'e tıklayın, Görev Döngüsü'nü (%) %25 olarak ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın (Ek Şekil S2G).
- DIO4'e tıklayın, Görev Döngüsü'nü (%) %25 olarak ayarlayın ve ardından Tamam'a tıklayın (Ek Şekil S2H).
- Çalıştırmaya başlamak için üstteki yeşil düğmeye (solda) tıklayın ve çalışmayı durdurmak için kırmızı düğmeye (sağda) tıklayın. Çıkmak için sağ üst köşedeki x işaretine tıklayın (Ek Şekil S2I).
- BLM grubunda, bir seferde 12 fareyi, toplamda dört kez, toplam 48 fareye kadar atomize edin. Normal kontrol grubunda bir seferde altı fareyi normal tuzlu su ile atomize edin.
- Cihazı kalibre ettikten sonra, anestezi uygulanmış fareyi yumuşak bir ağ örtüsü ile sabitleyin (Şekil 1A), çalışan BLM solüsyonunu bir pipet ile pozlama kulesinin üst atomize kafasına ekleyin (Şekil 1B) ve kararlı atomizasyon elde etmek için nebulizatörü 30 dakika çalıştırın.
- Hayvan kurtarma
- Nebulizatörde 30 dakika tedavi ettikten sonra, fareyi bir ısıtma yastığı ile donatılmış bir kurtarma kafesine taşıyın.
- Fareleri tamamen bilinçli olana kadar gözlemleyin.
- Farenin iyi durumda olduğu onaylandıktan sonra, bu da serbestçe hareket edebileceği anlamına gelir, orijinal kafesine geri koyun. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanlarla birlikte koymayın.
- BLM ile tedaviyi takip eden 24 saat boyunca solunum hızı, sağkalım ve herhangi bir semptom dahil olmak üzere fizyolojik indeksleri iki kez kontrol edin.
3. Akciğer dokusu işleme
- BLM uygulamasından 9, 16 ve 23 gün sonra, altı fareyi karın içine pentobarbital sodyum (son doz 100 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte ederek feda edin.
- Trakea ve akciğerleri çıkarın ve hemen soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile durulayın.
- Parafin yerleştirmeden önce sol akciğeri 24 saat boyunca% 10 nötr formalin tamponunda sabitleyin.
- Hematoksilen-eozin boyaması (H&E boyama)
- Sabit akciğer dokusunu bir kurutucuda kurutun.
- Susuz kalmış akciğer dokusu bloğunu 1 saat boyunca 56 ° C'de balmumu çözen bir kutuya yerleştirin.
- Gömmek için, erimiş parafini kalıp kutusuna dökün ve ardından parafin emdirilmiş doku bloğunu hızlı bir şekilde kalıp kutusunun altına yerleştirin, soğutun ve katılaşın.
- Gömülü mum bloğunu mikrotom üzerine sabitleyin, dilimleme tablasını uygun bir konuma yukarı ve aşağı ayarlayın, bıçağı itin, ölçeği ayarlayın ve 4 μm kalınlığında bir dilim kesin. Dilimi açmak için suyla dolu bir ekran kutusuna yerleştirmek için cımbız kullanın.url (ön tarafı yukarı).
- Dilimleri yamalayın ve pişirin. Balmumu dilimi tamamen kıvrıldıktan sonra, cam sürgüyü balmumu dilimine 135°'lik bir açıyla yerleştirin, balmumu dilimini cam slayt üzerine hareket ettirmek için cımbız kullanın, cam slaytı kaldırın ve balmumu diliminin konumunu gerektiği gibi ayarlayın. Dilimlerin tekrar açılmasını sağlamak için slaytları monte edilmiş balmumu dilimleri ile 47 °C'de 1 dakika sabit sıcaklıktaki bir masaya yerleştirin; Dilimler tamamen düz olduğunda, slaytları 1 saat boyunca 62 °C'lik bir inkübatöre koyun.
- Mum almak için, pişmiş slaytları iki kez 20 dakika ksilen içine koyun.
- Rehidrasyon için, akciğer dokusu dilimlerini yeniden sulandırmak için slaytları kademeli bir alkol serisine yerleştirin: 2 dakika boyunca %100 alkol, 1 dakika boyunca %95 alkol, 1 dakika boyunca %90 alkol, 1 dakika boyunca %85 alkol, 1 dakika boyunca %75 alkol ve 3 dakika boyunca damıtılmış su.
- Bölümleri hematoksilen içinde 5 dakika boyayın. İki kez 1 dakika yıkayın, ardından 5 saniye boyunca% 0.5 hidroklorik asit alkol farklılaştırma çözeltisine koyun, iki kez 1 dakika su ile yıkayın, 8-10 saniye boyunca Mavi boyama solüsyonuna koyun, iki kez musluk suyuyla durulayın ve 30 saniye boyunca eozin ile boyayın.
- Dehidrasyon ve leke çıkarma için lekeli kısımları 1 dakika %75 alkol, 1 dakika %85 alkol, 1 dakika %90 alkol, 1 dakika %95 alkol, 1 dakika %100 alkol ve ardından iki kez 1 dakika ksilen içine koyun ve kalan tüm sıvıyı emici kağıtla çıkarın.
- Montaj için, dilimin ortasına bir damla nötr sakız sızdırmazlık solüsyonu damlatın ve bir lamel monte edin.
- Fare akciğer dokusunun morfolojik derecelendirme standardı
- Ashcroft ve ark. tarafından açıklanan yöntemi kullanarak, deney grubuna kör olan bir araştırmacının her numuneden rastgele üç mikroskobik alan seçmesini sağlayın ve 100x büyütmede pulmoner fibroz derecesini gözlemleyin: derece 0, normal akciğer; derece 1, hafif şişmiş alveoller, lokalize hafif fibrozis; derece 2, belirgin fibroz (alveolar duvarın kalınlığı normalin üç katından fazla), fibröz odaklı; derece 3, sürekli fibroz alanları (alveolar duvarın kalınlığı normalden üç kat daha fazla); derece 4, fibröz odakların füzyonu, fibrotik alan akciğer dokusunun% 10'undan daha azını oluşturur; derece 5, fibröz odaklar kaynaşır, fibroz alanı% 10 ila% 50'dir ve alveolar yapı önemli ölçüde hasar görür; derece 6, büyük sürekli fibröz odaklar (akciğer dokusunun% 50'sinden fazlası); derece 7, alveolar boşluk fibröz doku ile doldurulur, pulmoner büller mevcuttur; 8. derece, tam fibrozis.
- Her bir görüş alanına nota karşılık gelen bir puan atayın (örneğin, 4. sınıf dört puana eşittir) ve altı örnekten oluşan her bir grubu ayrı ayrı puanlayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Akciğer hasarı nebulize BLM ile indüklendi ve kontrol hayvanları aynı hacimde normal salin ile nebulize edildi. Fareler, 7 U / mL'lik bir BLM konsantrasyonu kullanılarak 3 gün boyunca günde bir kez, günde 30 dakika nebulize edildi. Fareler, BLM uygulamasından sonra 9, 16 ve 23. günlerde H & E boyaması için sakrifiye edildi (Şekil 2B). Kontrol grubundaki farelere kıyasla BLM alan farelerin akciğerlerinde normal alveolar mimarinin kaybı, septal kalınlaşma, genişlemiş alveoller ve inflamatuar hücrelerin...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İntratrakeal bleomisin enjeksiyonu, her iki akciğerde akut inflamatuar ve fibrotik bir yanıtla sonuçlanır ve insan interstisyel akciğer hastalığının deneysel bir fare modelini oluşturmak için etkili bir yaklaşım olarak kabul edilebilir. İntratrakeal uygulama en sık kullanılan uygulama yoludur 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 92068108) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| bleomisin | Bioway / Nippon Kayaku Co Ltd | & nbsp; DP721 | Fibrozis model ilaçlar |
| enjeksiyon için% 0.9 salin | Baxter Healthcare (Tianjin) Co., Ltd. | Bleomisin preparatı | |
| 1 mL şırınga | BD | 300481 | Hayvanları uyuşturun |
| %10 nötr formalin tamponu | TechaLab Biotech Company | Akciğer dokusunu düzeltin | |
| 15 mL santrifüj tüpü | corning | 430790 | Anestezi için hazırlanın |
| 20 &°C; C buzdolabı | Yeni sinek grubu | BCD-213K | Mağaza ilaçları |
| 4 & derece; C buzdolabı | Yeni sinek grubu | BCD-213K | Mağaza ilaçları |
| Adobe illustrator cc2020 | Adobe | Süreç görüntüleri | |
| mavi geri sıvı | Pekin Kimya İşleri | doku boyama | |
| temiz tezgah | Suzhou Sujie Arındırıcı Equipment Co., Ltd. | Bleomisin preparat | |
| farklılaşma sıvısı | Pekin Kimyasal İşler | doku boyama | |
| Elektronik terazi | METTLER TOLEDO | AA-160 | Anestezi |
| eozin lekesi | Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd. | doku boyama | |
| Isıtma yastığı | HIDOM | Fareler kuluçka | |
| hematoksilen lekesi | Pekin Yili İnce Kimyasallar Co, Ltd | doku boyama | |
| fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu | Hyclone | SH30256.01 | Temiz akciğer dokusu |
| Photoshop çizim yazılımı | Adobe | Süreç görüntüleri | |
| SCIREQ INEXPOSE | EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd. | Püskürtücü cihaz | |
| Dik floresan mikroskobu | Olympus | BX53 | Dilimi gözlemleyin |
Kaynaklar
- Raghu, G., et al. Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis. An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (5), e44-e68 (2018).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
- Degryse, A. L., et al. Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L442-L452 (2010).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. The American Journal of the Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Peng, R., et al. Bleomycin induces molecular changes directly relevant to idiopathic pulmonary fibrosis: a model for "active" disease. PLoS One. 8 (4), e59348(2013).
- Izbicki, G., et al. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. International Journal of Experimental Pathology. 83 (3), 111-119 (2002).
- Aguilar, S., et al. Bone marrow stem cells expressing keratinocyte growth factor via an inducible lentivirus protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. PLoS One. 4 (11), e8013(2009).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (14), 8407-8411 (2003).
- Rojas, M., et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (2), 145-152 (2005).
- Ortiz, L. A., et al. Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 11002-11007 (2007).
- Foskett, A. M., et al. Phase-directed therapy: TSG-6 targeted to early inflammation improves bleomycin-injured lungs. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), L120-L131 (2014).
- Hecker, L., et al. Reversal of persistent fibrosis in aging by targeting Nox4-Nrf2 redox imbalance. Science Translational Medicine. 6 (231), 231ra47(2014).
- Taooka, Y., et al. Effects of neutrophil elastase inhibitor on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine. 156 (1), 260-265 (1997).
- Gharaee-Kermani, M., Ullenbruch, M., Phan, S. H. Animal models of pulmonary fibrosis. Methods in Molecular Medicine. , 251-259 (2005).
- Orlando, F., et al. Induction of mouse lung injury by endotracheal injection of bleomycin. Journal of Visualized Experiments. (146), e58902(2019).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Gauldie, J., Kolb, M. Animal models of pulmonary fibrosis: how far from effective reality. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L151(2008).
- Jenkins, R. G., et al. An official American thoracic society workshop report: use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 667-679 (2017).
- Moeller, A., et al. The bleomycin animal model: A useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
