Soyma-leke tekniği, kalınlığı azaltmak, numune konsantrasyonunu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik numunelerin tek katmanlara ayrılmasını sağlayan bir kriyo-EM ızgara hazırlama yöntemidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Soyulmuş leke kriyo-EM ızgara hazırlama tekniği, çok katmanlı numunelerin katmanlarında bir azalma sağlamak amacıyla önemli ölçüde modifiye edilmiş bir geri enjeksiyon yöntemidir. Dalma donmasından önce katmanların bu şekilde çıkarılması, numune kalınlığının kriyo-EM veri toplama için uygun bir seviyeye düşürülmesine, numune düzlüğünün iyileştirilmesine ve görüntü işlemenin kolaylaştırılmasına yardımcı olabilir. Soyma lekesi tekniği, çok katmanlı membranların tek katmanlara, katmanlı 2D kristallerin tek kristallere ve çözünür proteinlerin istiflenmiş, tabaka benzeri yapılarının da aynı şekilde tek katmanlara ayrılmasına izin verir. Bu tür numunelerin yüksek numune kalınlığı, özellikle mikroskop aşamasının veri toplama için eğilmesi gerektiğinde, kriyo-EM veri toplama ve kriyo-EM görüntü işleme için sıklıkla aşılmaz sorunlar ortaya çıkarmaktadır. Ayrıca, bu numunelerden herhangi birinin yüksek konsantrasyonlu ızgaraları, ızgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonu artırılabildiğinden ve soyma lekesi tekniği, tek katmanlı numunenin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabildiğinden, verimli veri toplama için hazırlanabilir.
Giriş
Soyma lekesi tekniği, kriyo-EM 2D ve 3D veri toplama için uygun derecede ince numuneler elde etmek ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için istiflenmiş iki boyutlu membran proteinleri kristallerini tek katmanlara ayırmak için geliştirilmiştir1. Protokol, diğer çok katmanlı numune tipleri için ve ayrıca Z'deki kalınlığı arttırmadan ızgarada her iki numune tipinin de yüksek numune konsantrasyonlarına ulaşmak için benzer şekilde uygundur.
Numune katmanlarının bir katmana indirgenmesi, kılcal basınç ve kesme kuvvetlerinin bir kombinasyonunun, geri enjeksiyon yöntemi2'yi önemli ölçüde genişleten ve değiştiren bir protokolde uygulanmasıyla elde edilir. İlk lekeleme adımı, geri enjeksiyon yöntemindeki 20-25μm filtre kağıdı gözenek boyutu yerine mikron altı üzerinde lekeleme sırasında sıkı sandviçleme ve karbon filme ve çok katmanlı numunenin her iki tarafında bir ızgara çubuğuna yapışma ile sonuçlanır. Tek bir tabakanın ayrılması veya soyulması, ızgara bir trehaloz damlasına dikey olarak bastırıldıktan sonra sandviçlenmiş tabakaların ayrılmasının zorlanması üzerine gerçekleşir ve karbon filmi ızgara çubuğundan uzaklaştırır (Şekil 1). Karbon filmin ızgara çubuğu ile orijinal temas noktasından uzağa yeniden konumlandırılması, ızgara bir kez daha mikron altı filtre kağıdı üzerinde lekelendiğinde bir sonraki adımda gerçekleşir. Bu adımların yineleme sayısı belirli örnekler için en iyi duruma getirilebilir. Ayrıca, protokol, Z'de agregasyondan kaçınırken numune konsantrasyonlarını arttırmak için kullanılabilir. ızgara çubuğuna ve karbon filme yapışmanın yanı sıra güçlü ayırmaya bağlı olması nedeniyle, bu yaklaşım bazı hassas ve / veya kararsız proteinler ve protein kompleksleri gibi oldukça kırılgan moleküller için uygun olmayabilir.
Soyma lekesi tekniği ne özel ekipman ne de pahalı malzemeler gerektirir. Bununla birlikte, belirli numunelere uygulanabilirlik, biyolojik parametrelerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirecektir. Düzlüğü sağlamak için karbon filmi gerektiğinden, 2D kristaller için karar daha kolaydır, ancak soyma-leke tekniği ile manipülasyon, numunenin biyolojik bütünlüğünü veya kristalin sırasını etkileyebilir. Soyulma lekesi tekniğinin tek parçacıklara uygunluğu, karbon film gerektiren ve manipülasyona kararlı olanlarla sınırlıdır ve bunlar için test edilebilir. Katmanlar arasında kritik biyolojik etkileşime sahip örnekler, bu tür etkileşimlerin bozulması nedeniyle soyma-leke tekniği yardımıyla karakterizasyon için uygun olmayabilir.
Soyma-leke tekniği ("soyma-leke"), oda sıcaklığında TEM tarafından negatif lekeli veya lekesiz numunelerle test edilerek ve taranarak en hızlı şekilde optimize edilir. Optimum sayıda soyulma-leke yinelemesi belirlendikten sonra, vitrifikasyondan önce kalınlığı kontrol etme süresi belirlenebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Peel-blot tekniği için hazırlık adımları
NOT: Hazırlık, aşağıdaki öğelerin birbirine bitişik olarak yerleştirilmesini gerektirir.
- İki parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı istifleyin (bkz.
- Filtre kağıdının bitişiğine, kağıt yukarı bakacak şekilde ~8 cm x 10 cm uzunluğunda bir parafin film yerleştirin.
- İki adet #4 filtre kağıdının üzerine bir parça mikron altı filtre kağıdı yerleştirin (Şekil 1-1).
- Anti-kılcal forsepsleri, bükülmüş bacak yukarı bakacak ve düz bacak aşağı bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, pürüzsüz/parlak tarafı yukarı bakacak şekilde 600 mesh ızgara seçin. Forsepsleri, temiz ızgaranın diğer öğelerle temasını önlemek için bir Petri kabına veya başka bir yükseltilmiş yüzeye yerleştirin.
- Kağıdı parafin filmden çıkarın ve küçük bir jant oluşturmak için kenarları (~ 5 mm) çekin. Pipet, parafin filmin kısa bir tarafından ~1-2 cm ve parafin filminde ~1 cm arayla% 4 trehaloz çözeltisinin iki 150 μL damlasıdır.
- Ayrı bir tezgahta veya zeminde, küçük bir polistiren köpük kaba sıvı azot dökün (bkz.
DİKKAT: Donma ısırmasını önlemek için eldiven ve yüz siperliği kullanarak doğru kullanım için eğitim alın. - Sıvı azotun içine küçük bir kriyo-EM ızgara kabı yerleştirin ve polistiren köpük kabı tüy bırakmayan mendillerle örtün.
2. Karbon filmin ızgaraya yerleştirilmesi
- Trehaloz çözeltisinin damlalarından birinde mikanın bir tarafına aşağı doğru hafif bir açıyla (~ 20 ° -40 °) dokunarak karbon filmini mikadan yüzdürmek için Dumont #5 forseps kullanın (bkz. Karbon film damlacığın yüzeyinde yüzdükten sonra mikayı serbest bırakın.
- Kırık şeklinde hasarlı karbon kullanmaktan kaçınmak için karbon filmi görsel olarak inceleyin.
- Anti-kılcal forseps tarafından bir açıyla (~ 20 ° -30 °) tutulan ızgarayı, karbon filme bitişik bir konumda bir trehaloz damlasına yerleştirin ve ardından karbon filmin altında ortalayın. Karbon filmi alın (Şekil 1-2).
- Izgarayı aynı yönde tutun ve ızgaranın kenarını kaba tarafa sarmış olabilecek gereksiz karbon filmi çıkarmak için damlanın yüzey gerilimini kırmadan ikinci trehaloz damlasının yüzeyine yavaşça indirin.
3. Çok katmanlı 2D kristallerin tek katmanlara ayrılması
- Anti-kılcal forsepsleri döndürün (bakınız Malzeme Tablosu) ve ızgaranın karbon tarafı aşağı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1-3).
- Pipetten 1.3 μL'lik numune ızgaranın üstündeki hafif trehaloz menisküsün içine alınır. Trehaloz ve numuneyi ızgaranın her iki tarafına karıştırmak ve dağıtmak için çözeltiyi ~ 8-10 kez pipetleyin.
- Çözeltiyi 1 dakika boyunca inkübe ederken, pipet parafin filmine bir veya daha fazla 1.7 μL trehaloz çözeltisi damlatın.
- Karbon filmi yukarı bakacak şekilde ızgarayı orijinal konumuna geri döndürün.
- Izgarayı mikron altı filtre kağıdına bastırmak için kılcal forseps kullanın (Şekil 1-4). Çözelti filtre kağıdı tarafından emildikten ve karbon film düz durduğunda, ızgarayı kaldırmadan ve dikey olarak 1.7 μL trehaloz çözeltisi damlasına hareket ettirmeden önce 3 saniye bekleyin (Şekil 1-5).
NOT: Yüksek oranda yığılmış numuneler için bu adımı birden çok kez yineleyin veya sonraki adımlarda kılavuz vitrifikasyon için hazırlanır. - Izgarayı iki filtre kağıdı parçası üzerine dökün ve ardından ızgarayı filtre kağıdından kaldırın (Şekil 1-6). Yaklaşık 13 sn sonra, neme ve numune tamponuna bağlı olarak, ızgarayı küçük strafor kaptaki sıvı azota daldırın ve ızgarayı kriyo-EM ızgara kabına yerleştirin veya kriyo-EM taraması veya veri toplama için doğrudan aktarın.
NOT: Protokolü hızlı bir şekilde optimize etmek için, soyulmuş lekeli ızgarayı sıvı azota batırmak yerine bu adımda negatif olarak lekeleyin. Izgaraya 3 μL% 1 uranil asetat uygulayarak numuneyi negatif olarak lekeleyin, ızgarayı 30 s boyunca inkübe edin ve yırtık bir parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı ile lekeleyin. Trehaloz, tanen veya glikozda vitrifiye edilen 2D kristallerin ızgaraları, trehaloz, tanen ve glikoz, elle daldırma2 için kullanılan oranlarda kristalin buz oluşumunu önlediğinden, vitrifikasyon için rutin olarak elle daldırılır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Başarılı bir soyma lekesi deneyi, genellikle yüksek konsantrasyonlarda tek bir numune katmanı ile sonuçlanacaktır. Çoğu ızgara karesindeki bazı bölgelerin, özellikle soyulma lekesi adımlarının daha az sayıda yinelemesinde, hala birden fazla katman içermesi beklenir. Bununla birlikte, ızgara karelerinin çoğunluğu, insan lökotrienC4 sentazının (Şekil 2) ve lipozomların (adım 3.2, Şekil 3'te eklenmiştir) 2D kristalleri için gözlemlendiği gibi, tek katman...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Soyma lekesi, kriyo-EM veri toplama ve görüntü işleme için çok katmanlı 2D kristallerin ve benzeri numunelerin istiflenmesinin ve kalınlığının üstesinden gelmek için güçlü bir yöntemdir. Soyma lekesinin kullanımına ilişkin bir karar, numunenin biyolojik parametrelerine dayanacak ve ayrıca bir 3D kriyo-EM modeli mevcut olduğunda değerlendirme gerektirecektir. Temaslıların biyolojik önemi ve temas bölgelerinin potansiyel esnekliği bu değerlendirmede özellikle önemli olacaktır.
Soyulma lekelerini...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışmanın bir kısmı NIH hibesi HL090630 (ISK) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 600 gözenekli ızgaralar | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-kılcal forseps | Ted Pella | 510-5 | |
| Mika | |||
| karbon Cryo-EM | Cryo-EM ızgaraları 120 kV veya 200 kV'da taranabilir. Yüksek çözünürlüklü veriler 300 kV'da toplanır. | ||
| Dumpont #5 forseps | Ted Pella | 5622 | |
| Cryo-EM depolama için ızgara kutusu | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Mendil | |||
| Sıvı nitrojen | |||
| Mika | Ted Pella | 56 | Mika karbon kaplıdır ve bir TEM ızgarasından çok daha büyük kareler halinde kesilir. Karbon kalınlığı, birden fazla soyma lekesi üzerinde kolayca kırılan ince karbonu önlemek için optimizasyon gerektirebilir. |
| Negatif leke | %1-2 uranil asetat birçok numune için uygundur. Fosfotungstik asit gibi diğer lekeler ikame edilebilir. | ||
| Parafilm | |||
| Polistiren kap | Soyma-leke ızgarasını vitrifiye etmek için kullanılır. Polistiren bir nakliye konteyneri bu amaç için geri dönüştürülebilir ve alüminyum folyo ile kaplanabilir. | ||
| Mikron altı filtre kağıdı | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmisyon elektron mikroskobu | JEOL | JEM-1400 | 80-120 kV'luk bir hızlanma geriliminde çalıştırılan herhangi bir TEM, negatif lekeli ızgaraların taranması için uygun olacaktır. |
| Trehaloz | % 4 trehaloz çözeltisi hazırlayın. | ||
| Whatman #4 filtre kağıdı | MilliporeSigma | WHA1004150 | Bu, 20-25 &mu'ya karşılık gelir; Protokolde m gözenek boyutu filtre kağıdı. |
Kaynaklar
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
