Yöntem makalesi

Standartlaştırılmış Sıçan Koroner Halka Hazırlama ve Damar Çapı Boyunca Dinamik Gerilim Değişikliklerinin Gerçek Zamanlı Kaydı

DOI:

10.3791/64121

⸱

16 Haziran 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Basic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, sıçan koroner arterinin vasküler reaktivitesini ölçmek için tel miyograf tekniğini açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyovasküler sistem hastalıklarının önemli bir olayı olan koroner arter hastalığı (KAH), tüm dünyada insanların yaşamını ve sağlığını ciddi şekilde tehdit eden ateroskleroz, miyokard enfarktüsü ve anjina pektorisin ana suçlusu olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, izole kan damarlarının dinamik biyomekanik özelliklerinin nasıl kaydedileceği uzun zamandır insanları şaşırtmıştır. Bu arada, in vitro dinamik vasküler gerilim değişikliklerini ölçmek için koroner arterlerin hassas konumlandırılması ve izolasyonu, CAD ilaç geliştirmede bir trend haline gelmiştir. Mevcut protokol, sıçan koroner arterlerinin makroskopik olarak tanımlanmasını ve mikroskobik olarak ayrılmasını tanımlamaktadır. Koroner arter halkasının damar çapı boyunca kasılma ve genişleme fonksiyonu, kurulan multi miyograf sistemi kullanılarak izlendi. Örneklemeden veri toplamaya kadar koroner halka gerilim ölçümünün standartlaştırılmış ve programlanmış protokolleri, fizyolojik, patolojik ve ilaç müdahalesinden sonra vasküler gerilim kayıtlarının gerçekliğini sağlayan deneysel verilerin tekrarlanabilirliğini büyük ölçüde geliştirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koroner arter hastalığı (KAH), hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde önde gelen ölüm nedeni olan tipik ve temsili bir kardiyovasküler hastalık olarak yaygın olarak kabul edilmiş ve endişe duymaktadır 1,2. Normal kardiyak fizyolojik fonksiyon için bir kan ve oksijen besleme yolu olarak, dolaşımdaki kan, iki ana koroner arter ve miyokard yüzeyindeki bir kan vasküler ağı yoluyla kalbe girer ve besler 3,4. Koroner arterlerdeki kolesterol ve yağ birikintileri, kalbin kan akışını ve vasküler sistemin şiddetli enflamatuar yanıtını keserek ateroskleroz, stabil anjina, kararsız anjina, miyokard enfarktüsü veya ani kardiyak ölüme neden olur 5,6. Koroner arterlerin patolojik darlığına yanıt olarak, telafi edici hızlandırılmış fizyolojik kalp atışı, sol ventrikülün çıkışını artırarak kalbin kendisinin veya vücudun hayati organlarının kan akışını tatmin eder7. Uzun süreli koroner darlık zamanla giderilmezse, kalbin belirli bölgelerinde geniş yeni kan damarları gelişebilir8. Günümüzde KAH klinik tedavisinde sıklıkla ilaç trombolizi veya cerrahi mekanik tromboliz ve sık ilaç tedavisi ve büyük cerrahi sakatlık ile ekzojen biyonik vasküler bypass uygulanmaktadır9. Bu nedenle, koroner arter fizyolojik aktivitesinin fonksiyonel olarak araştırılması kardiyovasküler hastalıklar için hala acil bir atılımdır10.

Koroner fizyolojik aktiviteyi tespit etmek için, in vivo koroner basıncı, vasküler gerilimi, kan oksijen doygunluğunu ve pH değerlerini dinamik olarak kaydedebilen kablosuz telemetri sistemleri dışında mevcut teknik bir araç yoktur11. Bu nedenle, koroner arterlerin dokusal gizliliği ve karmaşıklığı göz önüne alındığında, koroner arterlerin doğru tanımlanması ve izolasyonu, KAH in vitro 4'ün çoklu mekanizmalarını araştırmak için şüphesiz en iyi seçeneklerdir.

Bir dizi multi myograf sistemi, özellikle bir tel mikrograf mikrovasküler gerilim dedektörü (bakınız Malzeme Tablosu), küçük vasküler, lenfatik ve bronşiyal tüplerin in vitro doku gerginliği değişikliklerini yüksek hassasiyet ve sürekli dinamik kayıt özellikleriyle kaydetmek için çok olgun bir pazarlanabilir cihazdır12. Söz konusu sistem, 60 μm ila 10 mm çaplarındaki kavite yapılarının in vitro doku gerginlik özelliklerini kaydetmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Tel mikrograf platformunun sürekli ısıtma özellikleri, olumsuz dış ortamın uyarılmasını büyük ölçüde dengelemiştir. Bu arada, gaz karışımının sabit girişleri ve pH değerleri, benzer bir fizyolojik durumda daha doğru vasküler gerilim verileri elde etmemizi sağlar13. Bununla birlikte, sıçan koroner arterlerinin anatomik lokalizasyonunun karmaşıklığı göz önüne alındığında (Şekil 1), izolasyonu mekanizmanın çeşitlendirilmiş kardiyovasküler hastalık ve ilaç geliştirme araştırmalarını şaşırtmakta ve sınırlandırmaktadır. Bu nedenle, mevcut protokol, sıçan koroner arterinin anatomik yerleşimini ve ayırma işlemini ayrıntılı olarak tanıtmakta, ardından tel mikrograf14'ün platformunda gerilim ölçümü yapmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan protokolü, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Yönetim Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (Kayıt No. 2021-11). Bu çalışmada erkek Sprague Dawley (SD) sıçanları (260-300 g, 8-10 haftalık) kullanıldı. Sıçanlar bir hayvan odasında tutuldu ve deney sırasında içmek ve yemek için özgürdüler.

1. Çözelti hazırlama

  1. 118 mM NaCl, 4.7 mM K+, 2.5 mM CaCl 2, 1.2 mM KH 2 PO4, 1.2 mM MgCl 2∙6H2 O,25 mM NaHCO3, 11 mM D-glikoz ve 5 mM HEKES'i çözerek fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) hazırlayın (bkz.
  2. 58 mM NaCl, 60 mM K+, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO4,1,2mM MgCl 2∙6H2 O,25mM NaHCO3, 11 mM D-glikoz ve 5 mM HEPES'i çözerek yüksek K+ tuz çözeltisi hazırlayın.
  3. Yukarıdaki iki çözeltiyi ve kabarcığı% 95 O2 ve% 5 CO2'lik karışık bir gazla doyurun. Bu arada, çözeltinin pH değerlerini 2 mM NaOH ile 7,38 ila 7,42 arasında tutun.
    NOT: Çözelti hazırlama hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen referans15'e bakın.

2. Sıçan koroner arter diseksiyonu

  1. Sıçanı% 2 izofluran inhalasyonu ile anestezi yapın. Ayak parmağınızı sıkıştırarak derin anesteziyi onaylayın ve gerekirse ek anestezikler uygulayın. Ardından, daha önce yayınlanmış bir rapor12'yi takiben kalbi taşınabilir ameliyat masasında ortaya çıkarmak için derhal göğüs boşluğunu açın.
  2. Kalbi ayırdıktan ve çıkardıktan sonra, tıbbi plastik forsepslerle hafifçe sıkarak kalan kanı tüm kalp odalarından boşaltın. Önceden işlenmiş kalbi, pH değeri 7.40 olan 4 °C'de% 95 O2 +% 5 CO2 doymuş PSS içeren bir Petri kabına hızlı bir şekilde yerleştirin.
  3. Koroner arterlerin anatomik pozisyonunu doğru bir şekilde tanımlamak için, ışık mikroskobu altında izole kalbin duruşunu şematik diyagrama göre ayarlayın (Şekil 2A).
    NOT: Önden görünümde, sağ kulak kepçesi ve pulmoner arter sırasıyla sol üst ve sağ üstteydi.
    1. İnterventriküler septum boyunca sol ve sağ ventrikül boşluklarını pulmoner arter kökünden cerrahi makas ve cımbızla kesin (Şekil 2B).
  4. Sol ve sağ koroner arterleri miyokard dokusundan ayırmak için, sağ koroner arter dalını iyice ortaya çıkarmak için sağ ventrikülü optik anatomik mikroskop altında diseke edin. Daha sonra kalp dokusunu saat yönünde 45 ° döndürerek sol koroner arterin konumunu tanımlayın (Şekil 2D).
  5. Çevreleyen yapışkan miyokard dokusunu çıkardıktan sonra, titreşen sol (yaklaşık 5 mm) ve sağ (yaklaşık 5 mm) koroner arterleri açıkça ayırt edin. Ortadaki koroner arterleri hemen ayırın ve 4 ° C'de PSS'ye tamamen daldırın. Farklı uyaranlar altında vasküler gerginliği kaydetmek için ayrılmış arteri anatomik makasla dikey olarak keserek yaklaşık 2 mm'lik bir arteriyel halka elde edin (Şekil 2E).

3. Arteriyel halkanın süspansiyonu ve sabitlenmesi

NOT: Bu adımla ilgili ayrıntılar için lütfen referans14'e bakın.

  1. İki adet 2 cm'lik paslanmaz çelik tel hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve% 95 O 2 +% 5 CO2 ile doymuş 4 °C PSS çözeltisine önceden batırın. Her iki teli de arteriyel halkadan paralel olarak, optik anatomik mikroskop altında damarın yönüyle ve vasküler boşluğun her iki ucunda eşit uzunlukta teller açıkta olacak şekilde geçirin.
  2. Arteriyel halkayı, çelik tel ön ve arka ile% 95O2 +% 5 CO 2 ile köpüren PSS ile doldurulmuş tel mikrografın banyosuna sabitleyin. Uygun bir ön ve arka aralık için yatay vida düğmesini döndürün, böylece iki tel yatay olur ve arteriyel halka doğal bir gevşeme durumunda olur.
  3. DMT banyosunu termostatik cihaza kurduktan sonra, ilgili yol sinyalinin kaydedildiğinden emin olmak için veri toplama yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakınız). Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: göz merceği kalibrasyonu (mm/div): 0,36; hedef basınç (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; çevrimiçi ortalama süre: 2 sn; gecikme süresi: 60 sn. Arteriyel halka fiksasyonunun basamakları Şekil 3'te gösterilmiştir.

4. Sıçan arteriyel halkasında vasküler gerilimin standardizasyonu

NOT: Farklı kavite numuneleri için, damarların in vitro olarak olağanüstü aktiviteyi sürdürmeleri için optimum başlangıç gerilimi gerekliydi. Ayrıntılar için lütfen referans15'e bakın.

  1. Geminin çapı boyunca makul bir gerginlik uygulayarak arteriyel halkanın optimal başlangıç gerginliğini elde edin.
    NOT: Önceki çalışma 16'ya dayanarak, maksimum agonist kaynaklı gerilim, başlangıç gerilme gerilimi 1.16 ± 0.04 mN / mm (farklı kap örnekleri için referans değerler: k değeri, 0.90-0.95; başlangıç gerilimi, 1.16-1.52 mN / mm) ile 0.90 faktör k değerinde gerçekleştirilmiştir.
  2. Bu noktada, görüntülenen vasküler gerilim değerini sıfıra ayarlayın. Daha sonra, banyonun spiral eksenini döndürerek arteriyel halkaya 3 mN'lik bir çekme uyaranı uygulayın.
  3. 37 °C, pH 7.40'ta oksijene doymuş PSS tamponunda 1 saat inkübasyondan sonra, tel mikrografın gerilim kontrol panelinde gerilim değerini tekrar 0 mN'ye ayarlayın. Arteriyel halkanın başlangıç geriliminin ayar süreci Şekil 4'te gösterilmiştir.

5. Koroner arter halkasının reaktivite tespiti

  1. Tel miyograf tekniği 14 ile koroner arter halkasının kasılma aktivitesini gerçekleştirin ve her biri10 dakika boyunca 60 mM K+ çözeltisi ile uyararak üç ayrı operasyonda doğrulayın.
  2. Her stimülasyondan sonra, vasküler ton başlangıç durumuna dönene kadar banyoyu oksijene doymuş PSS ile yıkayın.
    NOT: Sadece üç paralel ölçümün gerilim dalgalanması %10'dan az olduğunda ve her bir kasılmanın genliği 1 mN/mm'den büyük olduğunda, daha ileri deneyler için nitelikli ve yüksek derecede aktif arteriyel halkalar kullanılabilir. Sıçan koroner halkasının aktivite doğrulaması Şekil 5'te gösterilmiştir.

6. Ameliyat sonrası tedavi

  1. Ameliyattan sonra, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek hayvanları ötenazi yapın.
    NOT: Bu çalışmada, hayvanlar aşırı izofluran solunarak ötenazi yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anatomik olarak konumlandırılmış, miyokard dokusunun derinliklerine dağılmış ve gizlenmiş sıçan koroner arterleri kolayca tanınmadı. İnsanların koroner arterleri (Şekil 1A) ve sıçanlar (Şekil 1B) karşılaştırılarak, Şekil 2'deki örnekleme işlemine göre sıçan koroner arterlerinin hızlı ve doğru bir şekilde ayrılması gerçekleştirilmiştir. Sağ kulak kepçesini, pulmoner arteri ve tepeyi önden optik mikroskop altında tam olarak bulduktan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KAH hastalarının geniş bir bölümünü içeren koroner mikrosirkülasyonun bozulması yavaş yavaş fark edilmiş ve yeterli miyokard perfüzyonunun temeli ile ilgilidir. Ani koroner kalp hastalığı ve kardiyovasküler hastalığın ciddi komplikasyonları göz önüne alındığında, KAH17'li bir klinik birey için zamanında ilaç önleme ve tedavisi son derece önemlidir. Kaçınılmaz olarak, koroner arter anatomisinin gizliliği ve fizyolojik yapısının ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Sichuan İl Bilim ve Teknoloji Planı'nın Anahtar Ar-Ge projesi (2022YFS0438), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82104533), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2020M683273) ve Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bölümü (2021YJ0175) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ApigeninSangon Biotech Co., Ltd., Şangay, Çin150731
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., Şangay, ÇinA501330
D-glikozSangon Biotech Co., Ltd., Şangay, ÇinA610219
HEPESXiya Reagent Co., Ltd., Shandong, ÇinS3872
KClSangon Biyoteknoloji A.Ş., Ltd., Şangay, ÇinA100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., Şangay, ÇinA100781
LabChart Professional sürüm 8.3 ADInstruments, Avustralya—
MgCl2 ve orta nokta; 6H < > 2 < / sub >Sangon Biotech Co., Ltd., Şangay, ÇinA100288
Çoklu miyograf sistemi ve nbsp;Danimarkalı Myo Technology, Aarhus, Danimarka620M
NaClSangon Biotech Co., Ltd., Şangay, ÇinA100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., Şangay, Çin A100865
Çelik tellerDanimarkalı Myo Teknolojisi, Aarhus, Danimarka400447
U46619Sigma, ABDD8174

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Malakar, A. K., et al. A review on coronary artery disease, its risk factors, and therapeutics. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 16812-16823 (2019).
  2. Murray, C., et al. national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990-2013: A systematic analysis for the global burden of disease Study 2013. The Lancet. 385 (9963), 117-171 (2015).
  3. Zhang, Y., et al. Adenosine and adenosine receptor-mediated action in coronary microcirculation. Basic Research in Cardiology. 116 (1), 22(2021).
  4. Allaqaband, H., Gutterman, D. D., Kadlec, A. O. Physiological consequences of coronary arteriolar dysfunction and its influence on cardiovascular disease. Physiology. 33 (5), 338-347 (2018).
  5. Minelli, S., Minelli, P., Montinari, M. R. Reflections on atherosclerosis: Lesson from the past and future research directions. Journal of Multidisciplinary Healthcare. 13, 621-633 (2020).
  6. Alvarez-Alvarez, M. M., Zanetti, D., Carreras-Torres, R., Moral, P., Athanasiadis, G. A survey of sub-saharan gene flow into the mediterranean at risk loci for coronary artery disease. European Journal of Human Genetics. 25 (4), 472-476 (2017).
  7. LaCombe, P., Tariq, M. A., Lappin, S. L. Physiology, Afterload Reduction. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
  8. Gutterman, D. D., et al. The human microcirculation: regulation of flow and beyond. Circulation Research. 118 (1), 157-172 (2016).
  9. Wang, G., Li, F., Hou, X. Complementary and alternative therapies for stable angina pectoris of coronary heart disease: A protocol for systematic review and network meta-analysis. Medicine. 101 (7), 28850(2022).
  10. Markousis-Mavrogenis, G., et al. Coronary microvascular disease: the "meeting point" of cardiology. European Journal of Clinical Investigation. 52 (5), 13737(2021).
  11. Allison, B. J., et al. Fetal in vivo continuous cardiovascular function during chronic hypoxia. The Journal of Physiology. 594 (5), 1247-1264 (2016).
  12. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (1), 77-111 (2021).
  13. Liu, L., et al. Comparison of Ca2+ handling for the regulation of vasoconstriction between rat coronary and renal arteries. Journal of Vascular Research. 56 (4), 191-203 (2019).
  14. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. Journal of Visualized Experiments. (138), e58064(2018).
  15. Guo, P., et al. Coronary hypercontractility to acidosis owes to the greater activity of TMEM16A/ANO1 in the arterial smooth muscle cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 139, 111615(2021).
  16. Ping, N. N., Cao, L., Xiao, X., Li, S., Cao, Y. X. The determination of optimal initial tension in rat coronary artery using wire myography. Physiological Research. 63 (1), 143-146 (2014).
  17. Niccoli, G., Scalone, G., Lerman, A., Crea, F. Coronary microvascular obstruction in acute myocardial infarction. European Heart Journal. 37 (13), 1024-1033 (2016).
  18. Mumma, B., Flacke, N. Current diagnostic and therapeutic strategies in microvascular angina. Current Emergency and Hospital Medicine Reports. 3 (1), 30-37 (2015).
  19. Lanza, G. A., Parrinello, R., Figliozzi, S. Management of microvascular angina pectoris. American Journal of Cardiovascular Drugs. 14 (1), 31-40 (2014).
  20. Zhu, T. Q., et al. Beneficial effects of intracoronary tirofiban bolus administration following upstream intravenous treatment in patients with ST-elevation myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention: The ICT-AMI study. International Journal of Cardiology. 165 (3), 437-443 (2013).
  21. Huang, D., et al. Restoration of coronary flow in patients with no-reflow after primary coronary intervention of acute myocardial infarction (RECOVER). American Heart Journal. 164 (3), 394-401 (2012).
  22. Fu, W. J., et al. Anti-atherosclerosis and cardio-protective effects of the Angong Niuhuang Pill on a high fat and vitamin D3 induced rodent model of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 195, 118-126 (2017).
  23. Li, J., et al. Chinese medicine She-Xiang-Xin-Tong-Ning, containing moschus, corydalis and ginseng, protects from myocardial ischemia injury via angiogenesis. The American Journal of Chinese Medicine. 48 (1), 107-126 (2020).
  24. Wu, W., et al. Three dimensional reconstruction of coronary artery stents from optical coherence tomography: Experimental validation and clinical feasibility. Scientific Reports. 11 (1), 1-15 (2021).
  25. Liu, M., et al. Janus-like role of fibroblast growth factor 2 in arteriosclerotic coronary artery disease: Atherogenesis and angiogenesis. Atherosclerosis. 229 (1), 10-17 (2013).
  26. Hu, G., Li, X., Zhang, S., Wang, X. Association of rat thoracic aorta dilatation by astragaloside IV with the generation of endothelium-derived hyperpolarizing factors and nitric oxide, and the blockade of Ca2+ channels. Biomedical reports. 5 (1), 27-34 (2016).
  27. Guo, Y., et al. Anticonstriction effect of MCA in rats by danggui buxue decoction. Frontiers in Pharmacology. 12, 749915(2021).
  28. Jing, Y., et al. Apigenin relaxes rat intrarenal arteries, depresses Ca2+-activated Cl− currents and augments voltage-dependent K+ currents of the arterial smooth muscle cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 115, 108926(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S an Koroner ArterleriVask ler Gerilim KaydTel MiyografDamar ap l mArteriyel Ring zolasyonuPotasyum Kaynakl KontraksiyonVazodilatasyon DeneyiKardiyovask ler Hastal k Modeli

İlgili makaleler