Standartlaştırılmış Sıçan Koroner Halka Hazırlama ve Damar Çapı Boyunca Dinamik Gerilim Değişikliklerinin Gerçek Zamanlı Kaydı

Koroner arter hastalığı (KAH), hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde önde gelen ölüm nedeni olan tipik ve temsili bir kardiyovasküler hastalık olarak yaygın olarak kabul edilmiş ve endişe duymaktadır ^1,2. Normal kardiyak fizyolojik fonksiyon için bir kan ve oksijen besleme yolu olarak, dolaşımdaki kan, iki ana koroner arter ve miyokard yüzeyindeki bir kan vasküler ağı yoluyla kalbe girer ve besler ^3,4. Koroner arterlerdeki kolesterol ve yağ birikintileri, kalbin kan akışını ve vasküler sistemin şiddetli enflamatuar yanıtını keserek ateroskleroz, stabil anjina, kararsız anjina, miyokard enfarktüsü veya ani kardiyak ölüme neden olur ^5,6. Koroner arterlerin patolojik darlığına yanıt olarak, telafi edici hızlandırılmış fizyolojik kalp atışı, sol ventrikülün çıkışını artırarak kalbin kendisinin veya vücudun hayati organlarının kan akışını tatmin eder⁷. Uzun süreli koroner darlık zamanla giderilmezse, kalbin belirli bölgelerinde geniş yeni kan damarları gelişebilir⁸. Günümüzde KAH klinik tedavisinde sıklıkla ilaç trombolizi veya cerrahi mekanik tromboliz ve sık ilaç tedavisi ve büyük cerrahi sakatlık ile ekzojen biyonik vasküler bypass uygulanmaktadır⁹. Bu nedenle, koroner arter fizyolojik aktivitesinin fonksiyonel olarak araştırılması kardiyovasküler hastalıklar için hala acil bir atılımdır¹⁰.

Koroner fizyolojik aktiviteyi tespit etmek için, in vivo koroner basıncı, vasküler gerilimi, kan oksijen doygunluğunu ve pH değerlerini dinamik olarak kaydedebilen kablosuz telemetri sistemleri dışında mevcut teknik bir araç yoktur¹¹. Bu nedenle, koroner arterlerin dokusal gizliliği ve karmaşıklığı göz önüne alındığında, koroner arterlerin doğru tanımlanması ve izolasyonu, KAH in vitro 4'ün çoklu mekanizmalarını araştırmak için şüphesiz en iyi seçeneklerdir.

Bir dizi multi myograf sistemi, özellikle bir tel mikrograf mikrovasküler gerilim dedektörü (bakınız Malzeme Tablosu), küçük vasküler, lenfatik ve bronşiyal tüplerin in vitro doku gerginliği değişikliklerini yüksek hassasiyet ve sürekli dinamik kayıt özellikleriyle kaydetmek için çok olgun bir pazarlanabilir cihazdır¹². Söz konusu sistem, 60 μm ila 10 mm çaplarındaki kavite yapılarının in vitro doku gerginlik özelliklerini kaydetmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Tel mikrograf platformunun sürekli ısıtma özellikleri, olumsuz dış ortamın uyarılmasını büyük ölçüde dengelemiştir. Bu arada, gaz karışımının sabit girişleri ve pH değerleri, benzer bir fizyolojik durumda daha doğru vasküler gerilim verileri elde etmemizi sağlar¹³. Bununla birlikte, sıçan koroner arterlerinin anatomik lokalizasyonunun karmaşıklığı göz önüne alındığında (Şekil 1), izolasyonu mekanizmanın çeşitlendirilmiş kardiyovasküler hastalık ve ilaç geliştirme araştırmalarını şaşırtmakta ve sınırlandırmaktadır. Bu nedenle, mevcut protokol, sıçan koroner arterinin anatomik yerleşimini ve ayırma işlemini ayrıntılı olarak tanıtmakta, ardından tel mikrograf^14'ün platformunda gerilim ölçümü yapmaktadır.

Hayvan protokolü, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Yönetim Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (Kayıt No. 2021-11). Bu çalışmada erkek Sprague Dawley (SD) sıçanları (260-300 g, 8-10 haftalık) kullanıldı. Sıçanlar bir hayvan odasında tutuldu ve deney sırasında içmek ve yemek için özgürdüler.

1. Çözelti hazırlama

1. 118 mM NaCl, 4.7 mM K⁺, 2.5 mM CaCl 2, 1.2 mM KH 2 PO₄, 1.2 mM MgCl 2∙_6H2 O,₂₅ mM NaHCO₃, 11 mM D-glikoz ve 5 mM HEKES'i çözerek fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) hazırlayın (bkz.
2. 58 mM NaCl, 60 mM K+, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO4,_1,2mM MgCl 2∙6H₂ O,₂₅mM NaHCO₃, 11 mM D-glikoz ve 5 mM HEPES'i çözerek yüksek K⁺ tuz çözeltisi hazırlayın.
3. Yukarıdaki iki çözeltiyi ve kabarcığı% 95 O2 ve% 5 CO_2'lik karışık bir gazla doyurun_. Bu arada, çözeltinin pH değerlerini 2 mM NaOH ile 7,38 ila 7,42 arasında tutun.
   NOT: Çözelti hazırlama hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen referans^15'e bakın.

2. Sıçan koroner arter diseksiyonu

1. Sıçanı% 2 izofluran inhalasyonu ile anestezi yapın. Ayak parmağınızı sıkıştırarak derin anesteziyi onaylayın ve gerekirse ek anestezikler uygulayın. Ardından, daha önce yayınlanmış bir rapor^12'yi takiben kalbi taşınabilir ameliyat masasında ortaya çıkarmak için derhal göğüs boşluğunu açın.
2. Kalbi ayırdıktan ve çıkardıktan sonra, tıbbi plastik forsepslerle hafifçe sıkarak kalan kanı tüm kalp odalarından boşaltın. Önceden işlenmiş kalbi, pH değeri 7.40 olan 4 °C'de% 95 O₂ +% 5 CO₂ doymuş PSS içeren bir Petri kabına hızlı bir şekilde yerleştirin.
3. Koroner arterlerin anatomik pozisyonunu doğru bir şekilde tanımlamak için, ışık mikroskobu altında izole kalbin duruşunu şematik diyagrama göre ayarlayın (Şekil 2A).
   NOT: Önden görünümde, sağ kulak kepçesi ve pulmoner arter sırasıyla sol üst ve sağ üstteydi.
   1. İnterventriküler septum boyunca sol ve sağ ventrikül boşluklarını pulmoner arter kökünden cerrahi makas ve cımbızla kesin (Şekil 2B).
4. Sol ve sağ koroner arterleri miyokard dokusundan ayırmak için, sağ koroner arter dalını iyice ortaya çıkarmak için sağ ventrikülü optik anatomik mikroskop altında diseke edin. Daha sonra kalp dokusunu saat yönünde 45 ° döndürerek sol koroner arterin konumunu tanımlayın (Şekil 2D).
5. Çevreleyen yapışkan miyokard dokusunu çıkardıktan sonra, titreşen sol (yaklaşık 5 mm) ve sağ (yaklaşık 5 mm) koroner arterleri açıkça ayırt edin. Ortadaki koroner arterleri hemen ayırın ve 4 ° C'de PSS'ye tamamen daldırın. Farklı uyaranlar altında vasküler gerginliği kaydetmek için ayrılmış arteri anatomik makasla dikey olarak keserek yaklaşık 2 mm'lik bir arteriyel halka elde edin (Şekil 2E).

3. Arteriyel halkanın süspansiyonu ve sabitlenmesi

NOT: Bu adımla ilgili ayrıntılar için lütfen referans^14'e bakın.

1. İki adet 2 cm'lik paslanmaz çelik tel hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve% 95 O 2 +% 5 CO₂ ile doymuş 4 °C PSS çözeltisine önceden batırın_. Her iki teli de arteriyel halkadan paralel olarak, optik anatomik mikroskop altında damarın yönüyle ve vasküler boşluğun her iki ucunda eşit uzunlukta teller açıkta olacak şekilde geçirin.
2. Arteriyel halkayı, çelik tel ön ve arka ile% 95_O2 +% 5 CO 2 ile köpüren PSS ile doldurulmuş tel mikrografın banyosuna sabitleyin_. Uygun bir ön ve arka aralık için yatay vida düğmesini döndürün, böylece iki tel yatay olur ve arteriyel halka doğal bir gevşeme durumunda olur.
3. DMT banyosunu termostatik cihaza kurduktan sonra, ilgili yol sinyalinin kaydedildiğinden emin olmak için veri toplama yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakınız). Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: göz merceği kalibrasyonu (mm/div): 0,36; hedef basınç (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; çevrimiçi ortalama süre: 2 sn; gecikme süresi: 60 sn. Arteriyel halka fiksasyonunun basamakları Şekil 3'te gösterilmiştir.

4. Sıçan arteriyel halkasında vasküler gerilimin standardizasyonu

NOT: Farklı kavite numuneleri için, damarların in vitro olarak olağanüstü aktiviteyi sürdürmeleri için optimum başlangıç gerilimi gerekliydi. Ayrıntılar için lütfen referans^15'e bakın.

1. Geminin çapı boyunca makul bir gerginlik uygulayarak arteriyel halkanın optimal başlangıç gerginliğini elde edin.
   NOT: Önceki çalışma 16'ya dayanarak, maksimum agonist kaynaklı gerilim, başlangıç gerilme gerilimi 1.16 ± 0.04 mN / mm (farklı kap örnekleri için referans değerler: k değeri, 0.90-0.95; başlangıç gerilimi, 1.16-1.52 mN / mm) ile 0.90 faktör k değerinde gerçekleştirilmiştir.
2. Bu noktada, görüntülenen vasküler gerilim değerini sıfıra ayarlayın. Daha sonra, banyonun spiral eksenini döndürerek arteriyel halkaya 3 mN'lik bir çekme uyaranı uygulayın.
3. 37 °C, pH 7.40'ta oksijene doymuş PSS tamponunda 1 saat inkübasyondan sonra, tel mikrografın gerilim kontrol panelinde gerilim değerini tekrar 0 mN'ye ayarlayın. Arteriyel halkanın başlangıç geriliminin ayar süreci Şekil 4'te gösterilmiştir.

5. Koroner arter halkasının reaktivite tespiti

1. Tel miyograf tekniği 14 ile koroner arter halkasının kasılma aktivitesini gerçekleştirin ve her biri¹⁰ dakika boyunca 60 mM K⁺ çözeltisi ile uyararak üç ayrı operasyonda doğrulayın.
2. Her stimülasyondan sonra, vasküler ton başlangıç durumuna dönene kadar banyoyu oksijene doymuş PSS ile yıkayın.
   NOT: Sadece üç paralel ölçümün gerilim dalgalanması %10'dan az olduğunda ve her bir kasılmanın genliği 1 mN/mm'den büyük olduğunda, daha ileri deneyler için nitelikli ve yüksek derecede aktif arteriyel halkalar kullanılabilir. Sıçan koroner halkasının aktivite doğrulaması Şekil 5'te gösterilmiştir.

6. Ameliyat sonrası tedavi

1. Ameliyattan sonra, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek hayvanları ötenazi yapın.
   NOT: Bu çalışmada, hayvanlar aşırı izofluran solunarak ötenazi yapıldı.

Anatomik olarak konumlandırılmış, miyokard dokusunun derinliklerine dağılmış ve gizlenmiş sıçan koroner arterleri kolayca tanınmadı. İnsanların koroner arterleri (Şekil 1A) ve sıçanlar (Şekil 1B) karşılaştırılarak, Şekil 2'deki örnekleme işlemine göre sıçan koroner arterlerinin hızlı ve doğru bir şekilde ayrılması gerçekleştirilmiştir. Sağ kulak kepçesini, pulmoner arteri ve tepeyi önden optik mikroskop altında tam olarak bulduktan sonra, miyokard Şekil 2A'da gösterilen katı siyah çizgi boyunca diseke edildi. Koroner arterin interventriküler dalının yaklaşık 5 mm'si görüşümüze açıkça maruz kaldı. Ventriküler septal arteri çevreleyen yapışkan miyokardın ince bir şekilde ayrılmasından sonra, koroner arterin 2 mm'lik bir döngüsünü vasküler hizalama yönünde geçmek için 2 cm'lik bir tel kullanıldı. Anında, ayrılan 2 mm'lik koroner halka, Şekil 3'te gösterildiği gibi, DMT banyosuna sağlam bir şekilde sabitlendi. Arteriyel halkaya başlangıçta 3 mN gerilim uygulandıktan sonra (Şekil 4), üç kez paralel olarak 60 mM K+ uygulanarak gerilimi 2 mN'den fazla aştı (Şekil 5). Böylece, yukarıdaki prosedürler mükemmel fizyolojik aktiviteye sahip izole bir koroner halka ile sonuçlanmıştır.

DMT 620M banyosuna kümülatif K + (20, 28, 39, 55, 77 ve 108 mM) veya U46619 (0.01, 0.03, 0.1, 0.3 ve 1 μM) eklendi ve bu da in vitro vasküler tonda konsantrasyona bağlı bir artışa neden oldu. Bir sonraki K+ veya U46619 konsantrasyonu (bir tromboksan A2 (TP) reseptör agonisti)15, vazokonstriksiyon etkisi bir platoya ulaştığında eklenmiştir. Deney sonuçları Şekil 6A,B'de gösterilmiştir. K+ (60 mM) ve U46619 (0.3 μM) tarafından daraltılan izole koroner halkalar için, test ilacı apigenin (1, 3, 10, 30 ve 100 μM) şaşırtıcı derecede konsantrasyona bağımlı bir şekilde vazodilatasyona neden olmuştur (Şekil 6C).

Şekil 1: İnsan ve sıçan koroner arterlerinin serbest el çizimleri. (A) sol ve sağ koroner arterlerin yüzeysel dağılımının özelliklerini insan kalbinin önden görünümünden sunar ve çıplak gözle kolayca tanınır. (B) sıçan sol ve sağ koroner arterlerini miyokardın derinliklerinde ve dallanan interventriküler septumlarında gösterir. Kısaltmalar: RCA = sağ koroner arter; LCA = sol koroner arter; ISB = interventriküler septum dalı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sıçanlarda koroner arter ayrımının diyagramı. (A) Sıçan kalbinin sağ kulak kepçesi, pulmoner arter, tepe noktası ve anatomik çizgisi ışık mikroskobu altında önden izlendi. (B) Sol ve sağ ventrikül lümenleri pulmoner arter kökünden septum boyunca kesildi. (C) Sol ve sağ koroner arterlerin anatomik lokalizasyonu ve interventriküler septal dalları. (D) Arterin 2 mm'lik halkası. (E) Arteriyel halka, damarın yönü boyunca tel ile sabitlenir. Kısaltmalar: RA = sağ kulak kepçesi; PA = pulmoner arter; RCA = sağ koroner arter; ISB = interventriküler septum dalı; LCA = sol koroner arter. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Arteriyel montaj prosedürünün bir şeması. Telli arteriyel halka ( A)' ya transfer edildi ve DMT banyosuna (B) kelepçelendi. Çelik tel sabitlendi ve saat yönünde sol üst ( C ) ve sol alt (D) vidalandı. (E) Çeneler, ikinci telin arteriyel halkadan geçmesine izin vermek için yer açmak üzere vidalandı. (F) İkinci tel arteriyel halka boyunca paraleldi. Çelik tel sabitlendi ve saat yönünde sağ üst ( G ) ve sağ alt (H) vidalandı. (I) Birbirinden ayrılan çeneler, arteriyel halkayı doğal durumunda bırakmak için gevşek bir şekilde vidalandı. Yeşil çizgiler telleri temsil eder ve turuncu silindirler 2 mm izole arteriyel halkayı temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Arteriyel halkanın normalizasyon prosedürü. Sabit izole arteriyel halkanın gerginliği 0 mN'ye geri döndükten sonra, bir kerede arteriyel halkaya 3 mN'lik bir çekme kuvveti uygulandı. 5 dakika sonra vasküler gerilim 2,5 mN'ye düştü. Gerilimi 3 mN'ye çıkararak ve 5 dakika boyunca sabit tutarak, koroner arter halkasının gerginliği 0 mN'ye başlatıldı ve farklı uyaranların vasküler gerilimi üzerine sonraki çalışmalar için 1 saat dinlendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Vasküler reaktivitenin test edilmesi. 60 mM K + 'nın üç uygulaması, izole koroner arter halkasının gerginliğini 2 mN'den fazla uyardı ve üç ölçüm% 10'dan azdı, bu da üstün bir vasküler aktivite olduğunu düşündürdü. Her stimülasyondan sonra, banyo gerginlik 0 mN olana kadar 37 °C oksijene doymuş PSS çözeltisi ile hafifçe yıkandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Sıçan koroner arterinin K+ veya U46619 yoluyla kümülatif doz kontraksiyonunun temsili izleyicisi. K + (A) ve U46619 (B) dozu arttıkça, kuvvet doza bağımlı olarak artmıştır. (C) apigeninin 60 mM K+- ve 0.3 μM U46619 sözleşmeli arteriyel halka üzerindeki gevşetici etkisine konsantrasyona bağlı bir şekilde atıfta bulunulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.