Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Nöronal lizozom interaktomunun yakınlık etiketleme proteomikleri ile karakterizasyonu

2.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64132

⸱

23 Haziran 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, The George Washington University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlardaki dinamik lizozomal mikro çevreyi karakterize etmek için proteomik protokolü etiketleyen bir nöronal lizozom yakınlık protokolü burada tanımlanmıştır. Lizozomal membran proteinleri ve lizozomlarla etkileşime giren proteinler (kararlı veya geçici olarak), canlı insan nöronlarında mükemmel hücre içi uzamsal çözünürlük ile bu yöntemde doğru bir şekilde ölçülebilir.

Özet

Lizozomlar, bozunmayı ve diğer çeşitli hücresel fonksiyonları elde etmek için sıklıkla çeşitli biyomoleküllerle iletişim kurar. Lizozomlar insan beyni fonksiyonu için kritik öneme sahiptir, çünkü nöronlar postmitotiktir ve hücresel homeostazı korumak için otofaji-lizozom yoluna büyük ölçüde güvenirler. Çeşitli lizozomal fonksiyonların anlaşılmasındaki ilerlemelere rağmen, lizozomlar ve diğer hücresel bileşenler arasındaki son derece dinamik iletişimi yakalamak, özellikle yüksek verimli bir şekilde, teknik olarak zordur. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kaynaklı nöronlarda proteomik yöntemi etiketleyen yakın zamanda yayınlanan endojen (knock-in) lizozom yakınlığı için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

Hem lizozomal membran proteinleri hem de 10-20 nm yarıçap içindeki lizozomları çevreleyen proteinler, canlı insan nöronlarında güvenle tanımlanabilir ve doğru bir şekilde ölçülebilir. Protokolün her adımı, yani hiPSC-nöron kültürü, yakınlık etiketleme, nöron hasadı, floresan mikroskopisi, biyotinile protein zenginleştirme, protein sindirimi, LC-MS analizi ve veri analizi gibi ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Özetle, bu eşsiz endojen lizozomal yakınlık etiketleme proteomik yöntemi, canlı insan nöronlarındaki son derece dinamik lizozomal aktiviteleri incelemek için yüksek verimli ve sağlam bir analitik araç sağlar.

Giriş

Lizozomlar, makromolekülleri lizozomal-otofaji yolu1 yoluyla parçalayan katabolik organellerdir. Bozunmanın yanı sıra, lizozomlar sinyal iletimi, besin algılaması ve sekresyon 2,3,4 gibi çeşitli hücresel fonksiyonlarda rol oynar. Lizozomal fonksiyondaki pertürbasyonlar lizozomal depo bozuklukları, kanser, yaşlanma ve nörodejenerasyon 3,5,6,7 ile ilişkilendirilmiştir. Postmitotik ve yüksek polarize nöronlar için, lizozomlar nöronal hücresel homeostaz, nörotransmitter salınımı ve aksonlarboyunca uzun mesafeli transportta kritik rol oynar 8,9,10,11. Bununla birlikte, insan nöronlarındaki lizozomları araştırmak zor bir görev olmuştur. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı nöron teknolojilerindeki son gelişmeler, daha önce erişilemeyen canlı insan nöronlarının kültürünü mümkün kılarak hayvan modelleri ile insan hastaları arasındaki boşluğu doldurarak insan beynini incelemiştir12,13. Özellikle, gelişmiş i3Nöron teknolojisi, nörogenin-2 transkripsiyon faktörünü doksisiklin ile indüklenebilir bir promotör altında iPSC genomuna istikrarlı bir şekilde entegre eder ve iPSC'leri 2 hafta içinde saf kortikal nöronlara farklılaşmaya yönlendirir14,15.

Son derece dinamik lizozomal aktivite nedeniyle, diğer hücresel bileşenlerle lizozomal etkileşimleri yakalamak, özellikle yüksek verimli bir şekilde, teknik olarak zordur. Yakınlık etiketleme teknolojisi, olağanüstü mekansal özgüllük16,17 ile hem kararlı hem de geçici / zayıf protein etkileşimlerini yakalama kabiliyeti nedeniyle bu dinamik etkileşimleri incelemek için çok uygundur. Mühendislik peroksidaz veya biyotin ligaz, genetik olarak yem proteinine kaynaştırılabilir. Aktivasyon üzerine, komşu proteinleri kovalent olarak etiketlemek için oldukça reaktif biyotin radikalleri üretilir, bunlar daha sonra sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) platformları17,18,19,20,21 aracılığıyla aşağı akış aşağıdan yukarıya proteomikler için streptavidin kaplı boncuklarla zenginleştirilebilir.

Yakın zamanda i3Nöronlar22'deki dinamik lizozomal mikro ortamı yakalamak için endojen lizozomal yakınlık etiketleme proteomik yöntemi geliştirilmiştir. Mühendislik askorbat peroksidaz (APEX2), iPSC'lerde lizozomal ilişkili membran proteini 1'in (LAMP1) C-terminusuna çarptı ve daha sonra kortikal nöronlara farklılaştırıldı. LAMP1, bol miktarda lizozomal membran proteini ve klasik bir lizozomal belirteç23'tür. LAMP1 ayrıca lizozomlara olgunlaşan geç endozomlarda da ifade edilir; Bu geç endozozom-lizozomlar ve degradatif olmayan lizozomların hepsi bu protokolde lizozomlar olarak adlandırılır. Fizyolojik düzeyde eksprese edilen bu endojen LAMP1-APEX probu, LAMP1 yanlış lokalizasyonunu ve aşırı ekspresyon artefaktlarını azaltabilir. Yüzlerce lizozomal membran proteini ve lizozomal interaktör, canlı insan nöronlarında mükemmel uzamsal çözünürlükle tanımlanabilir ve ölçülebilir.

Burada, insan iPSC türevi nöronlarında proteomikleri etiketleyen lizozom yakınlığı için ayrıntılı bir protokol, yakın zamanda yayınlanan yöntem22'den daha fazla iyileştirme ile açıklanmaktadır. Genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol, hiPSC kaynaklı nöron kültürünü, nöronlarda yakınlık etiketleme aktivasyonunu, floresan mikroskobu ile APEX aktivitesinin doğrulanmasını, optimal streptavidin boncuk-giriş protein oranının belirlenmesini, biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesini, boncuk üzerinde protein sindirimini, peptid tuzunu alma ve nicelleştirmeyi, LC-MS analizini ve proteomik veri analizini içerir. Yakınlık etiketleme kalite kontrolünü ve performansını iyileştirmek için sorun giderme yönergeleri ve deneysel optimizasyonlar da tartışılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler George Washington Üniversitesi biyogüvenlik ve etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan ortam ve tampon bileşimleri Tablo 1'de verilmiştir. Burada kullanılan ticari ürün bilgileri Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. İnsan iPSC kaynaklı nöron kültürü

  1. İnsan iPSC kültürü ve LAMP1-APEX prob entegrasyonu (7 gün)
    1. Matrigel stok çözeltisini gece boyunca 4 ° C'de bir buz kovasında çözün, çözeltinin aliquot 500 μL'sini soğuk steril tüplere dökün ve alikotları -80 ° C'de saklayın. 49,5 mL soğuk DMEM/F12 ortamına 500 μL Matrigel stoğu ekleyerek 50 mL kaplama çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Matrigel'i soğuk tutun ve polimerizasyonu önlemek için önceden soğutulmuş konik tüpler ve pipet uçları kullanın. Kaplama çözeltisi 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
    2. 10 cm'lik bir hücre kültürü kabını, 37 °C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca 4 mL kaplama çözeltisi ile kaplayın.
      NOT: Vitronectin, iPSC kültürü için 5 μg/mL konsantrasyonda ve 2 saat kaplamada alternatif bir kaplama çözümü olabilir. Vitronektin (tek protein bileşeni) Matrigel'den daha pahalıdır, ancak çok sayıda hücre dışı matriks proteini ile fare tümöründen ekstrakte edilen Matrigel'den daha az parti varyasyonuna ve daha temiz arka plan sinyallerine sahiptir. Vitronektin kaplama için işlem görmemiş doku kültürü plakasına ihtiyaç vardır. Matrigel kaplama, hem işlenmiş hem de işlenmemiş doku kültürü plakaları için çalışır.
    3. ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 8 mL Esansiyel Esansiyel E8 tam ortam (son konsantrasyon 10 μM Y-27632 veya 50 nM Chroman1) ile önceden yüklenmiş her kaplamalı 10 cm'lik çanak üzerinde 1-3 milyon hiPSC çözün ve plakalayın.
      NOT: Kök hücre kültürü ortamına ROCK inhibitörü (Y-27632 veya Chroman1) eklenmesi, bölünme ve kriyojenik korumadan sonra ayrışmaya bağlı apoptozu en aza indirir. Chroman1'in son zamanlarda hem ROCK1 hem de ROCK224'ü inhibe etmede Y-27632'den daha güçlü olduğu gösterilmiştir.
    4. iPSC'ler koloniler oluşturduktan sonra, tipik olarak 1-2 gün sonra, ROCK inhibitörü olmadan 10 mL E8 tam ortamına geçin. iPSC kültürünü E8 tam ortamda tutun ve süpernatantı her gün taze ortamla değiştirin.
    5. CRISPR genom mühendisliği ile askorbat peroksidaz (APEX2) mühendisliği ile yakınlık etiketleme enzimini, endojen LAMP1 geninin C-terminusuna entegre edin. Mühendislik kararlı bir hücre hattı oluşturmak için ayrıntılı adımlar için, daha önce yayınlanmış yönteme bakın (Frankenfield ve ark.). 22.
  2. İnsan iPSC-nöron farklılaşması (3 gün)
    1. Farklılaşmadan önce 10 cm'lik bir hücre kültürü kabını 37 °C'lik bir inkübatörde 4 mL Matrigel kaplama çözeltisi ile gece boyunca kaplayın.
    2. HiPSC'leri ~%70 birleşene kadar koruyun. Ölü hücreleri çıkarmak için hiPSC'leri fosfat tamponlu salin (PBS) 2x ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 10 cm'lik hücre kabına 3 mL Accutase ekleyin. Eşit dağılım için plakayı sallayın ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 8 dakika inkübe edin.
    3. Hücreleri plakadan yıkamak ve kaldırmak için 2 mL PBS ekleyin ve tüm hücre çözeltisini 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Hücreleri 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet edin. Plaka 2-4 × 8 mL sıcak nöron indüksiyon ortamı ile önceden yüklenmiş Matrigel kaplı bir plaka üzerine 106 hiPSC (Tablo 1). Hücreleri eşit olarak dağıtın ve 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Nöron farklılaşması, bu kararlı hiPSC hücre hattı15'te aşırı eksprese edilen bir doksisiklin ile indüklenebilir transkripsiyon faktörü olan nörogenin-2 (NGN2) tarafından yönlendirilir.
    4. Ölü hücre kalıntılarını gidermek için farklılaşmanın 1. gününde hiPSC'leri PBS ile nazikçe yıkayın. ROCK inhibitörü olmadan 10 mL sıcak indüksiyon ortamı ile değiştirin.
    5. Farklılaşmanın 3. gününe kadar her gün ROCK inhibitörü olmadan sıcak indüksiyon ortamı ile değiştirin.
      NOT: Nöronlar nöronal ortama yeniden yerleştirilmeye hazırdır.
  3. Nöronların kaplanması ve nöron kültürünün sürdürülmesi (10 gün)
    1. Borat tamponunda 0.1 mg/mL Poli-L-Ornitin (PLO) kaplama çözeltisi hazırlayın (Tablo 1).
    2. Bir hücre kültürü kabını, PLO kaplama çözeltisi ile 37 ° C'lik bir inkübatörde, 3. gün nöronlarının kaplanmasından önce en az 1 saat veya bir gecede kaplayın. Bulaşığı üç kez 4 mL steril suyla yıkayın ve biyogüvenlik kabininin içinde tamamen kurumasını bekleyin.
    3. Her 10 cm'lik çanaktan 3 mL Accutase ve plaka 8-10 milyon hücre içeren günlük 3 nöronları, sıcak kortikal nöron ortamı ile önceden yüklenmiş her 10 cm'lik FK kaplı çanağa ayırın (Tablo 1).
    4. I3 Nöronları farklılaşmadan sonraki 2 hafta içinde olgunlaşmaya ulaşana kadar sıcak nöron ortamı ile her2-3günde bir yarım orta bir değişiklik yapın.

2. In situ yakınlık etiketleme ve nöron lizisi (2 saat)

  1. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 500 mM biyotin-fenol (BP) stok çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. Yakınlık etiketleme gününde, BP stok çözeltisini ılık nöron ortamı ile seyreltin ve nöronları 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca 500 μM'lik son bir konsantrasyonda tedavi edin.
    NOT: Doksisiklin nöron ortamına eklenir, bu da APEX enzim ekspresyonunu aktive eder. Doxcycline'ın yakınlık etiketleme deneyinden en az 24 saat önce eklenmesi gerekir.
  2. Nöron kültürüne 1 mM'likson konsantrasyondaH2 O 2 ekleyerek etiketleme reaksiyonunu başlatın ve tam olarak 1 dakika boyunca inkübe edin. Ortamı hemen aspire edin ve söndürme tamponu ile 3 kez durulayın (Tablo 1).
    NOT: H2O2 çözeltisi, etiketleme reaksiyonundan önce taze yapılmalıdır. Deneyselvaryasyonu azaltmak ve uzun süreli H2 O2 tedavisinin neden olduğu oksidatif stresi en aza indirmek içinH2 O2aktivasyonunun tam olarak 1 dakika olması gerekir.
  3. Tüm kalan tamponu aspire etmek için plakayı eğin. Buz gibi soğuk hücre lizis tamponunu (Tablo 1) doğrudan nöron plakasına ekleyin. 1 milyon nöron başına 100 μL hücre lizis tamponu kullanın. Yeterli hücre lizisi için plakayı döndürün ve buzun üzerine yerleştirin.
  4. Hücre lizatlarını soğuk 1.5 mL tüplere kazıyın. Alternatif 40 s açık, 20 s kapalı döngüleri ile 15 dakika boyunca bir banyo sonicator (>100 W) kullanarak buz gibi soğuk bir su banyosunda sonicate.
    NOT: Yeterince lize protein çözeltisi, pelet veya aşırı kabarcıklar olmadan berrak olmalıdır. Hücre lizatının yeterli sonikasyonu, nükleik asitleri kesmek ve aşağı akış prosedürlerinde spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için hücre lizatının yapışkanlığını azaltmak için çok önemlidir. Daha güçlü ve daha hızlı hücre lizisi sağlamak için bir prob sonicator da kullanılabilir, ancak çapraz kontaminasyonu ve numune kaybını en aza indirmek için probun numuneler arasında yıkanması gerekir.
  5. Numuneye 4 kat hacimli lizis tamponunda soğuk aseton (-20 °C) ekleyin. Vorteks kısaca ve 3 saat boyunca -20 ° C'de kuluçkaya yatırın.
  6. 2 °C'de 10 dakika boyunca 16.500 × g'da santrifüj. Protein peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Peleti 1 mL -20 °C aseton 2x ile yıkayın ve santrifüjlemeden sonra süpernatantı çıkarın.
  7. Protein peletini 1 dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcı ile kurutun. Peletin tamamen çözülmesi için hücre lizis tamponu ekleyin. Gerekirse kısaca sonikate. Numuneleri -80 °C'de saklayın.
    NOT: Aseton çökeltmesi, numunedeki kalıntı biyotin-fenolünü giderebilir ve bu da biyotinile proteinlerin aşağı yönde zenginleşmesine müdahale edebilir.

3. APEX lokalizasyonunu ve aktivitesini doğrulamak için floresan mikroskobu (1.5 gün)

  1. EndojenLAMP1-APEX'i eksprese eden i 3 Nöronlarını 500 μM BP ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Biyotin bulutunun difüzyonunu sınırlamak için etiketlemeyi sadece 1 s için 1 mMH2 O2 işlemi ile etkinleştirin.
  2. Hücreleri derhal söndürme tamponunda% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve PBS ile 3x'i nazikçe yıkayın.
    NOT: 10 cm'lik bir tabak için, yeterli bir yıkama için 4-6 mL gereklidir.
  3. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca PBS'de% 3 eşek serumu ve% 0.1 saponin kullanarak hücreleri bloke edin ve geçirgenleştirin.
  4. Hücreleri primer anti-LAMP1 antikoru (fare monoklonal H3A4, 1:1.000) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  5. Nöronları PBS ile 3 x yavaşça yıkayın. RT'de 1 saat boyunca anti-fare AF561 sekonder antikoru (1:1.000) ve Streptavidin-680 (1:1.000) ile nöronları inkübe edin.
  6. PBS ile 2x yıkayın ve RT'de 10 dakika boyunca Hoechst veya 4',4-diamidino-2-fenilindol (DAPI) nükleer belirteci ile inkübe edin.
  7. Sabit nöronları floresan mikroskobu altında görselleştirin. APEX aktivitesinin doğru yerini doğrulamak için streptavidin ile boyanmış ve çekirdeğin dışındaki LAMP1 boyama ile kolokalize biyotinile proteinleri gözlemleyin.

4. Streptavidin boncuk-girdi protein oranının belirlenmesi (1.5 gün)

  1. Hücre lizatlarındaki toplam protein konsantrasyonlarını belirlemek için deterjanla uyumlu protein testi (DCA) yapın
    1. Sığır serum albümini (BSA) protein standardını hücre lizis tamponunda 4 mg/mL konsantrasyonda çözün. Hücre lizis tamponunu kullanarak bir dizi BSA protein standart çözeltisi (0.2-2 mg / mL, 5 seyreltme) hazırlayın.
    2. Her protein örneğinden 5 μL, BSA protein standart çözeltisi ve boş hücre lizis tamponunu 96 delikli bir plakadaki her bir kuyucuğa üçlü olarak aktarın.
    3. A' reaktifini elde etmek için 1 mL reaktif A başına 2 μL reaktif S ekleyin. Her bir oyuğa 25 μL reaktif A' ekleyin. Her bir oyuğa 200 μL reaktif B ekleyin. Varsa baloncukları karıştırın ve patlatın.
    4. RT'deki 96 kuyucuklu plakayı 15 dakika boyunca inkübe edin, bir mikroplaka okuyucuda 750 nm'deki absorbansı okuyun ve BSA standart eğrisine dayanarak protein numunelerinin konsantrasyonlarını ölçün.
  2. Boncuk titrasyonu nokta leke testi (1,5 gün)
    1. Bir dizi streptavidin manyetik boncuk bulamacını (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) PCR şerit tüplerine aktarın. PCR şerit tüplerini manyetik bir rafa koyun, boncukları 100 μL% 2 SDS tamponuyla 3x yıkayın ve manyetik raftayken yıkama tamponunu tamamen çıkarın.
    2. Her tüpe 50 μg protein örneği ekleyin. Toplam 80 μL'lik hacme daha fazla lizis tamponu ekleyin. her tüpü sıkıca kapatın ve gece boyunca 4 ° C'de döndürün.
    3. PCR şerit tüplerini tezgah üstü bir mikrosantrifüj üzerinde kısaca santrifüj yapın. PCR şerit tüplerini 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Her tüpten 2 μL süpernatant lekesini kuru bir nitroselüloz membran üzerine yerleştirin ve membranın tamamen kurumasını sağlayın.
      NOT: Sinyal yoğunluğu düşükse, membran üzerinde 2 μL'den fazla tespit edilebilir. Membran her seferinde hava ile kurutulduktan sonra aynı noktada birkaç kez lekelenerek hacim arttırılabilir. Bir Bio-Dot Aparatı da kullanılabilir.
    4. Membranı bloke edici tamponda (TBS) 1 saat boyunca inkübe edin. Membranı Streptavidin Alexa Fluor 680 konjugatında (bloke edici tamponda 1:1.000) 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra membranı TBS-T (Tablo 1) 5x ile yıkayın.
      NOT: Nokta lekesi testine bir alternatif, streptavidin antikoru kullanılarak batı lekelenmesidir.
    5. Membran üzerindeki her bir noktanın floresan sinyalini 680 nm dalga boyunun altında ölçün ve boncukların hacmi üzerinde floresan sinyalli bir dağılım grafiği oluşturun. Eğrinin üstel bozunumunun nerede bittiğine bağlı olarak 50 μg giriş proteini numunesi için gereken en uygun boncuk hacmini seçin.
      NOT: Floresan yoğunluğu, süpernatanttaki biyotinile proteinlerin bolluğunu temsil eder ve bu da artan miktarda boncukla azalması gerekir.

5. Biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesi ve boncuk üzerinde sindirim (3 gün)

  1. Protein lizat örneklerini -80 ° C'den aktarın ve çözeltileri hızlı bir şekilde çözmek için numuneleri bir banyo sonikatöründe 30 s boyunca 1.5 mL tüplerde sonikleştirin. Vorteks yapın ve numune tüplerini buzun üzerine yerleştirin.
  2. Her 1,5 mL tüpe 250 μL streptavidin (SA) manyetik boncuk bulamacını aktarın. Tüpleri manyetik bir rafa koyun, boncukları 1 mL Yıkama Tamponu A (% 2 SDS) ile 3x yıkayın ve kalan tamponu çıkarın.
  3. Nokta lekesi testi ve DC protein testinin sonuçlarına dayanarak, streptavidin manyetik boncuk bulamacının 250 μL'si için gereken protein numunesi (μg) miktarını hesaplayın.
    NOT: Endojen olarak eksprese edilen bu LAMP1-APEX probunda, 50 μg giriş proteini için 5 μL boncuk gereklidir. Bu nedenle, 250 μL boncuklara 2.5 mg toplam protein eklenir. Sınırlı giriş numune malzemesi için 250 μL'den az SA boncuk kullanılabilir.
  4. Manyetik boncuk-lizat karışımını içeren tüpe hücre lizis tamponunu toplam 1 mL hacme ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de döndürün.
    NOT: Farklı gruplardan veya replikalardan alınan numuneler, deneysel varyasyonları azaltmak için aynı protein konsantrasyonuna, hacmine ve boncuk miktarına normalleştirilmelidir.
  5. Tüm tüpleri bir tezgah üstü mikrosantrifüj üzerinde kısaca döndürün ve tüpleri 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Manyetik raftayken süpernatantı çıkarın.
    NOT: Numune tüplerini manyetik rafa her seferinde yerleştirdikten sonra 1 dakika beklemek çok önemlidir. Bu, çözeltideki mıknatısa doğru hareket eden görünmez az miktarda boncuk nedeniyle boncuk kaybını en aza indirebilir.
  6. Boncukları RT'de 1 mL Yıkama Tamponu A ile 2 kat yıkayın (her seferinde 5 dakika dönüş). İşlemi her yıkama tamponu ile 4 °C'de sırayla 2 kat tekrarlayın. (Arabellek B, Arabellek C ve Arabellek D; Tablo 1).
    NOT: Yüksek konsantrasyonda bir SDS çözeltisi soğuk sıcaklıklarda çökelebilir. İlk yıkama RT'de yapılmalıdır.
  7. Tüpleri manyetik rafa koyun. Artık deterjanı tamamen çıkarmak için boncukları Buffer D ile 2 kat yıkayın. Boncukları 100 μL 50 mM Tris tamponunda yeniden askıya alın ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıda 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe etmek için 5 mM TCEP (son konsantrasyon) ekleyin, 1.200 rpm'de sallayın.
  8. Her tüpe 15 mM iyodoasetamid (IAA, son konsantrasyon) ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıda 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, karanlıkta 1.200 rpm'de sallayın (karıştırıcı kapağı açık).
    NOT: IAA ışığa duyarlıdır ve bu adımdan 5 dakika önce taze yapılmalıdır.
  9. Fazla IAA'yı söndürmek için 5 mM TCEP (son konsantrasyon) ekleyin. 1.200 rpm'de sallanan sıcaklık kontrollü bir mikserde 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin (mikser kapağı kapalı).
  10. Numune tüplerini kısaca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarmak için 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Boncukları yeniden askıya almak için 50 mM Tris tamponuna 200 μL 5 mM TCEP ekleyin. Numuneye 1 μg Tripsin/Lys-C karışımı ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıda 1.200 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de 14 saat boyunca inkübe edin.
  11. Ek 0.2 μg Tripsin / Lys-C karışımı ekleyin ve 3 saat boyunca sindirin.
  12. Numune tüplerini kısaca döndürün ve tüpleri 1 dakika boyunca manyetik bir rafa koyun. Manyetik bir raftayken tüpleri temizlemek için peptid süpernatantını aktarın. Boncukları 50 μL 50 mM Tris tamponu ile yıkayın (5 dakika çalkalayın) ve peptid süpernatantlarını birleştirin.
  13. pH <3 elde etmek için peptid süpernatant içeren tüpe 30 μL% 10 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.

6. Peptit tuzdan arındırma ve fraksiyonasyon (2 saat)

  1. Ters fazlı katı faz ekstraksiyon plakasını (sadece kullanım için kuyucuklar) vakum manifoldu üzerinde 200 μL HPLC sınıfı metanol (MeOH) 3x ile ıslatın. Plakayı dengelemek için HPLC sınıfı suya 3x'te 200 μL% 1 TFA ekleyin.
  2. Peptit numunelerini plakaya yükleyin, numune kaybını en aza indirmek için vakumu yavaşça açarak 3 damlacık/sn'den daha düşük bir akış hızı elde edin.
  3. Ekstraksiyon plakasını 200 μL% 1 TFA ile 3x yıkayın. Ekstraksiyon plakasını% 2 MeOH (v / v) içeren 200 μL% 1 TFA ile tekrar yıkayın. Akış hızını 3 damlacık/sn'den düşük tutun.
  4. Toplama plakasını 96 delikli bir toplama plakasıyla değiştirin. Fraksiyonasyona gerek yoksa, peptid numunelerini% 80 MeOH içeren 100 μL% 1 TFA ile 3x elden çıkarın ve yeni bir numune tüpünde birleştirin. Peptit numunelerini ısı olmadan bir vakum yoğunlaştırıcısında kurutun.
    NOT: Fraksiyonasyon istenirse, peptid numuneleri daha sonra farklı bir toplama plakasında sırasıyla% 15,% 35,% 50 ve% 90 MeOH içeren 200 μL% 1 TFA kullanılarak 4 fraksiyona salınabilir.

7. Kolorimetrik peptid niceleme testi (isteğe bağlı) (1 saat)

  1. Peptit örneklerini 50 μL LC-MS dereceli suda yeniden askıya alın ve peptid testini gerçekleştirmek için 20 μL alikot alın.
    NOT: Bu adım büyük miktarda peptid numunesi tüketir, ancak LC-MS analizinden önce peptid konsantrasyonunun doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayabilir. Bu genellikle büyük ölçekli numune hazırlamadan önce test için numune tipi başına yalnızca bir kez gerçekleştirilir.
  2. LC-MS sınıfı suda peptid standart çözeltilerinin (kolorimetrik tahlil kitinde sağlanan) seri seyreltmelerini hazırlayın. % 50 Reaktif A,% 48 Reaktif B ve% 2 Reaktif C'yi karıştırarak çalışma reaktifini hazırlayın.
  3. Her peptid standart çözeltisinin 20 μL'sini (üç kopya) ve bilinmeyen peptid örneğini 96 delikli bir mikro plakaya aktarın. Her bir oyuğa 180 μL çalışma reaktifi ekleyin, iyice karıştırın ve plakayı RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Bir mikroplaka okuyucuda 480 nm'deki absorbansı okuyun ve peptid standart eğrisine dayanarak peptid numunelerinin konsantrasyonlarını ölçün.

8. LC-MS analizi

  1. Peptit örneklerini LC Tampon A'da yeniden askıya alın (%2 asetonitril ve %0,1 formik asit, LC-MS sınıfı). Olası partiküllerden kurtulmak için 16.500 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj yapın.
  2. Supernatantı LC-MS şişelere aktarın. Bir nanoLC-MS cihazı kullanarak örnekleri analiz edin.
    NOT: Ayrıntılı LC-MS/MS parametreleri cihaza bağlıdır ve daha önce22,25,26 olarak tanımlanmıştır.
  3. 5 ppm kütle doğruluğu 22 ile streptavidin ve tripsin gibi oldukça bol miktarda kirletici peptid pikleri için bir dizi tutma süresine sahip özel bir LC-MS dışlama listesi oluşturun (örneğin, yaygın streptavidin peptid zirveleri m/z 402.5435 [şarj 3], m/z 603.3117 [şarj 2], m/z 654.9733 [şarj 3], m/z 678.6812 [şarj 3], m/z 1017.5182 [şarj 2], ve saire.; yaygın tripsin peptid pikleri m / z 421.7584 [şarj 2], m / z 523.2855 [şarj 2] ve m / z 737.7062 [şarj 3]).

9. Proteomik veri analizi

  1. LC-MS ham verilerini Proteome Discoverer, MaxQuant27 veya MS-Fragger28 gibi proteomik veri analiz yazılımlarıyla analiz edin. Veri analizi için iki FASTA kütüphanesi ekleyin: 1) bir Swissprot Homo Sapiens referans veritabanı; 2) proteomik tanımlamayı geliştirdiği ve yanlış keşifleri azalttığı kanıtlanan yeni üretilen evrensel bir kirletici FASTA kütüphanesi (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib)29.
  2. Proteomik veri analizi parametrelerini, protein ve peptid spektral eşleştirme (PSM) tanımlamaları için% 1'lik bir yanlış keşif oranı (FDR) kesimi ile ayarlayın. En fazla üç kaçırılmış bölünme, sistein karbamidometilasyonun sabit bir modifikasyonu ve metiyonin oksidasyonu ve protein N-terminal asetilasyonunun değişken bir modifikasyonu ile tripsin sindirimini seçin. Etiketsiz niceleme için peptid MS1 tepe yoğunluklarını kullanın. Daha önce açıklandığı gibi yakınlık etiketleme varyasyonlarını azaltmak için peptid yoğunluklarını endojen biyotinile karboksilaz, propiyonil-CoA karboksilaz (PCCA) olarak normalleştirin22.
    NOT: PCCA normalizasyonu, Proteome Discoverer yazılımında bir PCCA protein dizisi FASTA dosyası eklenerek seçilebilir. Alternatif olarak, PCCA normalizasyonu aşağı akış veri analizinde gerçekleştirilebilir.
  3. Proteomik yazılımdan protein seviyesi sonuçlarını dışa aktarın. İstatistiksel analizden önce kirletici proteinleri çıkarın29. Sadece 1 PSM olan veya nicelleştirme sonucu olmayan proteinleri çıkarın. Enrichr30 ile protein gen ontolojisi (GO) terimi analizi ve STRING31 ile protein ağı analizi yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu lizozom yakınlık etiketleme proteomik çalışması, canlı nöronlarda dinamik lizozomal mikro ortamı in situ olarak yakalamak için insan iPSC türevi nöronlarında gerçekleştirildi. Farklı zaman noktalarındaki hiPSC'lerin ve hiPSC türevi nöronların hücre morfolojileri Şekil 2A'da gösterilmiştir. İnsan iPSC'leri E8 ortamındaki kolonilerde büyür. Farklılaşma, iPSC'lerin doksisiklin içeren nöron indüksiyon ortamına kaplanmasıyla başlatılır. Nörit uzantıları, 3 günlük farklılaşma sırasında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu LAMP1-APEX probu kullanarak, lizozomal membran üzerindeki ve yakınındaki proteinler biyotinile edilir ve zenginleştirilir. 100-1.200 nm'lik tipik lizozom çapı göz önüne alındığında, bu yöntem 10-20 nm etiketleme yarıçapı ile mükemmel hücre içi çözünürlük sağlar. LAMP1, bol miktarda lizozomal membran proteini ve lizozomlar için klasik bir belirteçtir ve endojen ekspresyon seviyesinde lizozomal APEX etiketlemesi için mükemmel bir yem proteini görevi görür. Bununla birlikte, lizozomları hedeflemek için LAMP1 kullanıldığı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibesi (R01NS121608) tarafından desteklenmektedir. A.M.F., ARCS-Metro Washington Bölüm Bursu ve Bourbon F. Scribner Bağış Bursu'nu kabul eder. Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü'ndeki (NINDS) Michael Ward laboratuvarına moleküler biyoloji desteği ve i3Nöron teknolojisi gelişimi için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 (a/h) Saponin çözeltisiAcros Organics419231000Floresan Mikroskobu
AccutaseLife TechnologiesA1110501hücre ayrılma solüsyonu, Hücre Kültürü
B27 TakviyesiFisher Scientific17504044Hücre Kültürü, Kortikal Nöron Ortamı
BDNFPeproTech450-02Hücre Kültürü, Kortikal Nöron Ortamı
Borik asitSigma-AldrichB6768Hücre Kültürü, Borat Tamponu
Sığır Serumu AlbüminMillipore SigmaA8806Toplam protein konsantrasyonlarını ölçmek için standart çözeltiler yapmak
Brainphys nöronal ortamKÖK HÜCRE Teknolojileri5790Hücre Kültürü, Kortikal Nöron Ortamı
CD45R (B220) Antikoru Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Floresan Mikroskobu
Chroman1 ROCK inhibitörüTocris716310Hücre Kültürü
cOmplete mini Proteaz İnhibitörüRoche4693123001Lizis Tamponunda kokteyl inhibitörü
DC Protein Test Kiti IIBio-Rad5000112Hücre lizatının toplam protein konsantrasyonlarını belirlemek için
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418Yakınlık etiketleme Reaksiyonu
DMEM/F12 ortamıThermo Fisher Scientific11320082Hücre Kültürü,
HEPES ile Çanak Kaplama DMEM/F12 ortamıThermo Fisher Scientific11330057Hücre Kültürü, İndüksiyon Ortamı
Eşek serumuSigma-AldrichD9663Floresan Mikroskobu
Doksisiklin hiclate, vb; %98 (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1GHücre Kültürü, İndüksiyon Ortamı
Esansiyel 8 OrtaThermo Fisher ScientificA1517001Hücre Kültürü
Esansiyel 8 Takviyesi (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Hücre Kültürü
Ekstraksiyon plakası vakum manifoldu kitiPeptit tuzdan arındırma içinSularWAT097944
Formik Asit (FA)LC-MS analizi içinA11750
GDNFPeproTech450-10Hücre Kültürü, Kortikal Nöron Orta
Hoechst boyaThermo Fisher Scientific62239Floresan Mikroskobu
HPLC sınıfı metanolPeptit tuzdan arındırma içinFisher ScientificA452
HPLC sınıfı suFisher ScientificW5Peptit için tuzdan arındırma
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerCorriell EnstitüsüGM25256Hücre
Kültürü Hidrojen peroksit, ACS, %29-32 w/w aq. soln., bıçak.Thermo Fisher ScientificAA33323ADYakınlık etiketleme Reaksiyonu
İyodoasetamid (IAA)Protein Sindirimi içinMillipore SigmaI6125
Laminin Fisher Scientific23017015Hücre Kültürü, Kortikal Nöron Ortamı
LC-MS sınıfı AsetonitrilFisher ScientificA955LC-MS
analizi için LC-MS sınıfı suFisher ScientificW64LC-MS analizi için
L-glutaminFisher Scientific25-030-081Hücre Kültürü, İndüksiyon Ortamı
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552bazal membran matrisi, Hücre Kültürü, Çanak Kaplama
Fare anti-insan LAMP1 monoklonal antikorGelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankasıh4a3Floresan Mikroskobu
N-2 Takviyesi ( 100x)Fisher Scientific17-502-048Hücre Kültürü, İndüksiyon Ortamı
Nitroselüloz Membran, Önceden Kesilmiş, 0.45 ve mikro; m, 7 x 8,5 cmBio-Rad1620145Boncuk titrasyonu için nokta leke tahlili yapmak için
Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Hücre Kültürü, İndüksiyon Ortamı
NT-3PeproTech450-03Hücre Kültürü, Kortikal Nöron Ortamı
Oasis HLB 96 oyuklu katı faz ekstraksiyon plakasıPeptit tuzdan arındırma
için Sular 186000309Odyssey Engelleme Tamponu (TBS)LI-COR Biosciences927-50000Boncuk titrasyonu için nokta leke tahlili yapmak için
ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710Floresan Mikroskobu
Fenol Biotin (1.000x stok)Adipogen41994-02-9Yakınlık etiketleme Reaksiyonu
Kalsiyum veya magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco10010049Hücre Kültürü, Yakınlık Etiketleme Reaksiyonu, Floresan Mikroskobu
Pierce Kantitatif Kolorimetrik PeptitThermo Fisher23275Peptit Konsantrasyon Testi
Poli-L-Ornitin (PLO)Millipore SigmaP3655Hücre Kültürü, Bulaşık Kaplama
Sodyum AskorbatSigma-AldrichA4034Yakınlık Etiketleme Söndürme Tamponu, Lizis Tamponu
Sodyum azidSigma-AldrichS8032Yakın Etiketleme Söndürme Tamponu, Lizis Tamponu, Floresan Mikroskobu
Sodyum klorürThermo Fisher ScientificS271500Hücre Kültürü, Borat Tamponu
Sodyum dodesil sülfat (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Lizis Tamponu, Nokta leke tahlil tamponu, Boncuk yıkama tamponu
Sodyum hidroksitSigma-Aldrich415413Hücre Kültürü, Borat Tampon
Sodyum tetraboratSigma-Aldrich221732Hücre Kültürü, Borat Tampon
SpeedVac yoğunlaştırıcıvakum yoğunlaştırıcı
Streptavidin Manyetik Sefaroz BoncukCytiva (resmi GE)28-9857-99Zenginleştirilmiş biyotinile proteinleri
Streptavidin, Alexa Fluor 680 KonjugeThermo Fisher ScientificS32358Boncuk titrasyonu için nokta leke tahlili yapmak için
Thermomixersıcaklık kontrollü karıştırıcı
Trifluoasetik asit (TFA)Peptit tuzdan arındırma içinMillipore Sigma302031
Tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP)ProteinSindirimi için
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Lizis Tamponu, Nokta leke tahlil tamponu, Boncuk yıkama tamponu
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Boncuk yıkama tamponu
TROLOXSigma-Aldrich648471Yakınlık Etiketleme Söndürme Tamponu, Lizis Tamponu
Tripsin / Lys-C Karışımı, ProteinSindirimi İçinPromegaV5073
TWEEN  20Millipore SigmaP1379Nokta leke tahlil tamponu
ÜreThermo Fisher ScientificBP169500Boncuk yıkama ve Boncuk Üstü Sindirim Tamponu
VitronektinSTEMCELL Teknolojileri7180Hücre Kültürü, Çanak Kaplama
Y-27632 ROCK inhibitörüSelleckS1049Hücre Kültürü
Fisher Scientific Testi : Kütle Spesifikasyon Sınıfı

Kaynaklar

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635(2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Proteomik AnalizNöronal LizozomlariPSC Kaynaklı NöronlarLizozomal Membran ProteinleriBiyotinillenmiş Protein ZenginleştirmeLC-MS AnaliziFloresan MikroskopiBoncuk Üzerinde Sindirim
Nöronal lizozom interaktomunun yakınlık etiketleme proteomikleri ile karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.