Method Article

Şartlı Ölümsüzleştirilmiş Fare Glomerüler Endotel Hücrelerinin Floresan Mitokondri ile İzolasyonu

DOI:

10.3791/64147

⸱

September 13th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Nephrology, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makalede, termolabil simian virüsü 40'ı eksprese eden transgenik farelerin böbreklerinden şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerinin izole edilmesi ve foto-aktive edilebilir mitokondri, PhAMeksize edilmesi yöntemi açıklanmaktadır. Boncuklar, sindirim adımları, tohumlama ve GEC-CD31 pozitifin kültürlenmesi kullanılarak tüm böbreklerden glomerül izolasyonu prosedürünü açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glomerüler endotel hücresi (GEC) disfonksiyonu glomerüler filtrasyon bariyerinin parçalanmasını başlatabilir ve katkıda bulunabilir. Bazı glomerüler hastalıkların patogenezinde artmış mitokondriyal oksidatif stres, GEC disfonksiyonuna neden olan bir mekanizma olarak önerilmiştir. Tarihsel olarak, GEC'lerin in vivo modellerden izole edilmesi, saf kültürlerin glomerüllerden izole edilmesindeki zorluklar nedeniyle oldukça zor olmuştur. GEC'lerin in vitro karmaşık büyüme gereksinimleri ve çok sınırlı bir ömrü vardır. Burada, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş GEC'leri floresan mitokondri ile izole etme ve kültürleme prosedürünü açıklıyoruz, bu da mitokondriyal fisyon ve füzyon olaylarının izlenmesini sağlıyor. GEC'ler, termolabil SV40 TAg'yi (Immortomouse'tan) ifade eden, proliferasyonu şartlı olarak teşvik eden ve hücre farklılaşmasını baskılayan çift transgenik bir farenin böbreklerinden ve tüm mitokondrilerde foto-dönüştürülebilir bir floresan proteinden (foto-aktive edilebilir mitokondri [PhAMeksize edilmiş] fareden) izole edildi. Üretilen kararlı hücre hattı, ölümsüzleştirici SV40 TAg geninin inaktivasyonundan sonra hücre farklılaşmasına ve bir mitokondri alt kümesinin foto-aktivasyonuna izin verir ve floresanda yeşilden kırmızıya geçişe neden olur. MitoDendra2-GEC'lerin kullanımı, floresan mitokondrinin dağılımının, füzyonunun ve fisyon olaylarının hücreleri boyamadan canlı görüntülenmesini sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glomerulus, büyük moleküllerin glomerüler filtrasyon bariyeri 1,2'den geçişini kısıtlayarak kan filtrasyonu için kritik öneme sahiptir. Glomerulus dört hücre tipi içerir: parietal epitel hücreleri, podositler (viseral epitel hücreleri), glomerüler endotel hücreleri (GEC) ve mezangial hücreler3. Glomerüler endotel, büyük filtrasyon hacimleri için gerekli olan fenestra varlığına göre benzersiz bir vasküler yapı ile karakterizedir4. Glomerüler endotelin apikal yüzeyi, negatif yüklü bir glikokaliks tabakası ve endotel ile kan arasında bir boşluk yaratan endotel yüzey....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki IACUC tarafından onaylanmıştır. Jackson laboratuvarından satın alınan ve normal bir chow diyetinde tutulan üç erkek fare (foto-aktive edilebilir mitokondri [PhAM]'li H-2Kb-tsA58 transgenik fareler) kullandık.

1. Çalışma koşulları ve hazırlıklar

  1. Laminer akış davlumbazının içindeki çalışma alanını %70 etanol ve UV-C ışığı kullanarak temizleyin.
  2. Boncuk yıkama tamponlarını hazırlayın. pH 7.4-8.0'da 0.1 M sodyum fosfat kullanarak tampon-1'i, %0.1 sığır serum antijeni (BSA), 3 mM EDTA, pH 7.4 ile desteklenmiş kalsiyum ve magnez....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerinin stabil floresan mitokondri (mitoDendra2-GEC'ler) ile izolasyonu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır (Şekil 1). 6-10 haftalık genç farelerin kullanımı, önemli sayıda sağlıklı hücre elde etmek için gereklidir. 3 günlük kültürden sonra, hücreler Şekil 3G'de gösterildiği gibi izole glomerüllerden yavaşça büyümeye başlar. 7 gün sonra, hücreler heterojendir ve podositler, parietal epi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, hücresel metabolizma, homeostaz ve stres yanıtları için kritik öneme sahiptir ve işlev bozuklukları böbrek hastalığı da dahil olmak üzere birçok hastalıkla bağlantılıdır. Mitokondri, aşırı reaktif oksijen türlerinin (ROS) patolojik oluşumunda, hücre içi kalsiyum düzeylerinin düzenlenmesinde, hücre ölüm yolaklarında ve sitoiskelet dinamiklerinde rol oynamaktadır21,22,23.

Murin GEC'lerin izo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan etmek için rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, farelerin endotel hücre izolasyonu konusundaki görüşleri için Profesör Cijiang He ve Dr. Fu Jia'ya teşekkür ediyor ve PhAMeksize edilmiş fareleri ve değerli tartışmaları sağladığı için Profesör Mone Zaidi'ye teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki Mikroskopi CORE'a ve aldığımız rehberlik için personele teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01DK097253 ve Savunma Bakanlığı CDMRP hibesi E01 W81XWH2010836'dan I.S.D.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 ve mikro; m hücreli süzgeçFisher22-363-549
1ml İnsülin ŞırıngalarıBD329424
25G kelebekBD367298
3 mm kesici kenar makasıFST15000-00
30ml şırıngaBD Biooscience309650
40 & mikro; m hücreli süzgeçFisher22-363-547
40 & m naylon örgü
Bonn MakasFST14184-09
Sığır serum albüminiFisherBP1600-100
CD31abcamab7388
Kollajenaz tip ICorning354236
Kollajenaz tip IISIGMAC6885125CDU/mg
Kollajen tip IVSIGMAC5533-5M
Dnase-IQiagen79254
Dynabeads 450Thermofisher Scientific14013
endotel hücreleri büyüme ortamıLonzacc-3156
Ekstra ince graefe forsepsFST11150-10
FBSGemini100-106Isı ile inaktive
edilmiş FibronektinThermofisher33016015
İnce forsepsFST DumontE6511
HBSSGIBCO14065-056
IFNgHücre BilimiCRI001B
ImmortomouseJackson laboratuvarı32619Tg (H2-K1-tsA58) 6Kio / LicrmJ
L-Glutamin 100xThermofisher Bilimsel25030081
Manyetik parçacık yoğunlaştırıcıThermofisher Scientific12320D
mitotrackerThermofisher ScientificM7512
PBS 1XCorning46-013-CM
penesilin streptomisin 100xThermofisher Scientific10378016
PhaM fareleriJackson laboratuvarı18397B6; 129S-Gt (ROSA) 26Sortm1.1 (CAG-COX8A / Dendra2) Dcc / J
Proteaz (10 mg / ml)SIGMAP6911
RPMIGIBCO3945
Sodyum Piruvat 100mMThermofisher Bilimsel11360070
Standart desen forseps  F.S.T11000-12
Cerrahi Makas - Keskin-KörFST14008-14
sinaptopodinSanta Cruzsc-515842
Tripsin %0.05Thermofisher Scientific25300054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
  2. Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glomerular Endothelial CellsFluorescent MitochondriaMitochondrial FissionMitochondrial FusionCell IsolationMagnetic Bead SeparationCollagen IV CoatingEndothelial Cell CultureCD31 Antibody SelectionLive Cell Imaging

Related Articles