Method Article

Fizyolojik Boyutta Bir Mikroakışkan Kültür Cihazında Epitel Hücre Tek Katmanlarının Hazırlanması ve Yapısal Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/64148

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan protokol, mikroakışkan dinamik kültür kanallarında ve geleneksel sabit kuyu statik kültür odalarında yapışkan hücre tabakası yapısını görselleştirmek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile falloidin bazlı filamentöz-aktin boyama tekniğinin geliştirilmesini ve kullanımını açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre katmanı akıcılığını, tek katmanlı oluşumu ve katman kalınlığı homojenliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vitro mikroakışkan deneyler, akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) ve ventilatöre bağlı akciğer hasarı (VILI) gibi durumlarda meydana gelen mikrofizyolojik fenomenler hakkında birçok içgörü ortaya çıkarmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, insan akciğerinin terminal bronşiyolleriyle fizyolojik olarak ilgili boyutlara sahip mikroakışkan kanallardaki çalışmalar, özellikle belirli bir kültür ortamında medya akış hızları da dahil olmak üzere uygun hücre kültürü koşullarının oluşturulmasındaki zorluklar nedeniyle şu anda çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır. Sunulan protokol, oksijen geçirimsiz bir mikroakışkan kanalda kültürlenmiş NCI-H441 insan akciğer epitel hücrelerinin yapısını, fizyolojik olarak insan akciğerinin terminal bronşiyolleriyle ilgili boyutlarla değerlendirmek için görüntü tabanlı bir yaklaşımı tanımlamaktadır. Phalloidin bazlı filamentli-aktin boyama kullanılarak, hücrelerin sitoiskelet yapıları konfokal lazer tarama mikroskobu ile ortaya çıkarılır ve bireysel ve katmanlı hücrelerin görselleştirilmesine izin verilir. Daha sonraki niceleme, kullanılan hücre kültürü koşullarının daha fazla deney için uygun tek tip tek katmanlar üretip üretmediğini belirler. Protokol, mikroakışkan kanallarda ve geleneksel sabit kuyu ortamlarında hücre kültürü ve katman değerlendirme yöntemlerini açıklamaktadır. Buna kanal yapımı, hücre kültürü ve gerekli koşullar, fiksasyon, geçirgenlik ve boyama, konfokal mikroskobik görüntüleme, görüntü işleme ve veri analizi dahildir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), akciğer parankiminde yaralanmanın bozulması ve yayılmasından kaynaklanan, alveollerin pulmoner ödemi, yetersiz gaz değişimi ve ardından hipoksemi ile sonuçlanan akut bir durumdur1. Bu, pro-inflamatuar sitokin salınımı, nötrofil alımı, toksik mediatör salınımı ve doku hasarı döngüsünü başlatır ve bu da daha fazla enflamatuar yanıta neden olur2. Ek olarak, hava yollarını stabilize eden ve tekrarlayan işe alım / işe alımın (Ar-Ge) neden olduğu hasarı önleyen pulmoner sürfaktan ARDS sırasında meydana gelen kimyasal işlemler tarafından inaktive edilebilir veya başka bir şekilde işlevsiz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada NCI-H441 insan epitelyal akciğer hücre hattı kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Mikroakışkan kanaldaki hücre kültürü

  1. Mikroakışkan kanalı imal edin ve aşağıdaki adımları izleyerek ön işlemi gerçekleştirin.
    1. Tek kanallı bir akış dizisi elde edin (bkz. Malzemeler Tablosu) ve üst kısmı polikarbonat taban plakasından ayırın.
    2. 60 mm x 22 mm boyutlarında #1.5 dikdörtgen bir kapak camı (kalınlık 0.17 mm) elde edin. Ultrasonik bir banyoda kapak camının yüzeylerini temizleyin ve bir tarafa 30 dakika boyunca 60 ° C'de kurumadan önce 5 dakika oda sıcaklı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan yöntem, mikroakışkan kültür kanallarında kültürlenen epitel hücre katmanlarının görselleştirilmesine izin verir ve doğrulama olarak geleneksel sabit kuyucuklu hücre kültürü ortamlarında bir gösterim kullanır. Elde edilen görüntüler bir kalite, sinyal yoğunluğu ve hücresel hedef özgüllüğü spektrumunda bulunacaktır. Başarılı görüntüler yüksek kontrast gösterecek ve sonraki istatistiksel değerlendirme için görüntü analizine ve verilerin nicelleştirilmesine izin verecektir. Başarısız görüntüler loş, bulanık, bulanık .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan protokol, NCI-H441 insan akciğer epitel hücrelerinin kültürünü, çapraz bağlama fiksasyonunu, boyanmasını, geçirgenliğini ve konfokal mikroskobik görselleştirmesini, tek kanallı bir mikroakışkan akış dizisinin dinamik ortamında ve ayrıca geleneksel sekiz kuyulu odacıklı bir kapak camının statik ortamında açıklamaktadır. Herhangi bir mikroakışkan hücre kültürü protokolünde, hücre kültürü ortamının akış koşulları çok önemlidir, çünkü yüksek oranlı akış hücreleri yıkama veya hücre tek katmanının normal montajına müda.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Alan Shepardson'a mikroakışkan kanal yapımında kullanılan 3M yapıştırıcı ve mylar levha için kesme desenini tasarladığı ve hücre kültürü ortam akış hızını ve şırınga pompası programlamasını test ettiği için teşekkür eder. Finansman NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 ve Newcomb-Tulane College Dean's Grant tarafından sağlandı.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A1R HD25 Konfokal Mikroskop SistemiNikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-mikroskoplar/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reaktifi (AlexaFluor 488 falloidin)InvitrogenR37110https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Yapışkan Transfer Bandı Çift Astarlı3M468MPhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Anten Bağlantısı  HSW Soft-Ject Tek Kullanımlık ŞırıngalarAir-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0,1 mm) Kalın Mylar LevhaBAISDYAS022https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonik  M Serisi Ultrasonik Temizleme BanyosuBranson Ultrasonik15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning  Fibronektin, İnsanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, kalsiyum, magnezyumGibco14040133https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Tek Kullanımlık Elektrot Dizileri 8 x 10 ECIS Akış DizisiUygulamalı Biyofizik1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Kurumsal Teknoloji Çözümleri UV Sterilizatör Kabini, BeyazKurumsal Teknoloji Çözümleri50-211-1163https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Değişken Hacim PipetlerThermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Kolay Okuyucu Plastik Santrifüj TüpleriFisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand  Kapak Camları: Dikdörtgenler (#1.5)Fisher Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand  Tek Kullanımlık Steril ŞırıngalarFisher Scientific14-955-458https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 OrtaGibco11875093https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fiksatif Çözelti (%4 formaldehit, metanol içermez)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ FijiImageJFijihttps://imagej.net/downloads
Daldırma Yağı F 30 ccNikonMXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Büyük Kapasiteli Erişim CO2  Kuluçka makinesi, 821 L, Cilalı Paslanmaz ÇelikThermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Serisi Brightfield Bileşik Mikroskop SistemiLaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Bağlantı Elemanı, Naylon, Düz, Erkek Luer Kilidi - Hortum Dikenli Adaptörler, 1/16" ID; 25/PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft ExcelMicrosoft0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
Ulusal Hedef Tamamen Plastik Tek Kullanımlık ŞırıngalarThermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 İnsan Epitel Akciğer HücreleriAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Altı Kanallı Programlanabilir Şırınga PompasıYeni Çağ Pompa SistemleriNE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elemanları ARNikonNIS Elemanları ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reaktifi (Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak CamıThermo Scientific155411https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Sarma FilmiFisher ScientificS37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3 Horoz, Polisülfon, Erkek/ Dişi Luer Girişi x Dişi Luer DalıPendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Fosfat Tamponlu Çözelti (PBS), pH 7.4Gibco10010023https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poli-D-LizinGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Alüminyum Kaplama FolyosuReynolds458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
SaponinMillipore Sigma (Sigma Aldrich)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Cam Yumuşak Set Antifade MountantInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Serisi Sınıf II, Tip A2 Biyolojik Güvenlik Kabini PaketiThermo Scientific13-100-752PM
https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood Tygon Transfer Borusu, BioPharm Platinle Kürlenmiş Silikon, 1/16" Kimlik x 1/8" OD; 50 FtCole-ParmerEW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18(2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MonolayerMicrofluidic Culture DeviceHuman Lung EpithelialConfocal MicroscopyPhalloidin StainingCell Layer EvaluationMicrofluidic Channel ConstructionCell Culture ConditionsActin Cytoskeleton ImagingTransepithelial Electrical Resistance

Related Articles