Yöntem makalesi

Sıcak Su Aklamanın Viral Dezenfeksiyon Etkinliğinin Belirlenmesi

3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64164

⸱

21 Haziran 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Office of Research and Development, Center for Environmental Solutions and Emergency Response, Homeland Security and Materials Management Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Jacobs Technology Inc., 3Science Systems and Applications Inc., 4CSS Inc.

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) pandemisine yanıt olarak, bez yüz kaplamalarının, pamuklu keselerin ve kot pantolonların sıcak suda yıkanmasının viral dezenfeksiyon etkinliğini test etmek için bir laboratuvar protokolü geliştirilmiştir. Phi6 virüsü (bakteriyofaj), dezenfeksiyon etkinliğini test etmek için organizma olarak kullanılmıştır.

Özet

Bu protokol, viral dezenfeksiyon hakkında veri üreten aklama çalışmaları yürütmek için bir laboratuvar süreci örneği sunmaktadır. Protokol, koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisi sırasında araştırma için geliştirilirken, diğer virüs dezenfeksiyon çalışmalarına uyarlanabilir bir çerçeve olması amaçlanırken; test virüsünün hazırlanması, test materyalinin aşılanması, aklama işlemi nedeniyle yıkanan maddelerdeki görsel ve bütünlük değişikliklerinin değerlendirilmesi ve viral yükteki azalmanın ölçülmesi için gereken adımları gösterir. Ek olarak, protokol, deneylerin kontaminasyon ve çoklu yıkama döngülerinden sonra kişisel koruyucu ekipman (KKD) öğelerinin malzeme bütünlüğünü izlemek için kaydedilmesi gereken ölçümler / gözlemler tarafından önyargılı olmamasını sağlamak için gerekli kalite kontrol örneklerini özetlemektedir. Protokolle birlikte sunulan temsili sonuçlar, pamuklu ovma, denim ve pamuklu yüz kaplama malzemelerine aşılanmış Phi6 bakteriyofajını kullanır ve sıcak su yıkama ve kurutma işleminin tüm numuneler için viral yükte 3 günlük (% 99,9) bir azalma sağladığını gösterir (3 günlük bir azalma, ABD Çevre Koruma Ajansı'nın Ürün Performans Test Kılavuzu 810.2200'deki dezenfektan performans metriğidir). Viral yükteki azalma, KKD maddeleri üzerindeki farklı yerlerde tekdüzeydi. Bu viral dezenfeksiyon etkinliği test protokolünün sonuçları, bilimsel topluluğun diğer test virüsleri ve aklama prosedürleri için evde aklamanın etkinliğini keşfetmesine yardımcı olmalıdır.

Giriş

Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisi, benzeri görülmemiş küresel tedarik zinciri bozulmasına neden oldu ve temel kişisel koruyucu ekipman (KKD) dahil olmak üzere birçok öğenin kritik bir kıtlığına yol açtı1,2,3. Yüksek riskli mesleklerde olanlar, önerilen kriz kapasitesi stratejilerini kullanarak uyum sağlamak zorunda kaldılar ve halk, öncelikle kaynak kontrolü için değil, aynı zamanda kullanıcılar için bazı solunum koruması sağlamak için kumaş malzeme yüz kaplamaları gibi özel olmayan öğelerin kullanımını benimsedi. Amerika Birleşik Devletleri'nde, özel solunum koruması (yani, N95'ler gibi filtreleyici yüz maskeleri (FFR'ler), tedarik sıkıntısı sırasında bu yüksek riskli mesleklerin bazıları (örneğin, sağlık hizmetleri) için ayrılmıştır4. Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-Cov-2) bulaşması hakkında çok az şey bilindiğinde, pandeminin başlarında bariyer koruması olarak çeşitli diğer giyim malzemeleri de düşünülmüştür5. Kullanıcının korunması için kullanılan kumaşların çeşitliliği ile birlikte, bu öğelerin kullanımı, yeniden kullanımı ve dezenfeksiyonu / dekontaminasyonu hakkında sorular ortaya çıkmıştır. Amerika Birleşik Devletleri'nde, yüz kaplamalarının ve diğer giyim eşyalarının rutin ev makinesi aklanmasının bu yüzeylerdeki virüsleri bulaşıcı hale getirdiği genel olarak kabul edilirken, bu iddiayı doğrulamak için çok az veri vardı ve test için yayınlanmış laboratuvar protokollerinin eksikliği vardı. Burada sunulan araştırma protokolünün amacı, viral dezenfeksiyon hakkında veri üreten aklama çalışmalarının yürütülmesi için bir laboratuvar süreci örneği sunmaktır. Protokol, COVID-19 pandemisi sırasında araştırmalar için geliştirilmiş olsa da, diğer virüs dezenfeksiyon çalışmalarına uyarlanabilir bir çerçeve olması amaçlanmıştır.

Giysilerin hastalık bulaşmasındaki rolü, ölçülmesi zor bir kavramdır. Uluslararası Ev Hijyeni Bilimsel Forumu, ev hijyeni uygulamalarının risk değerlendirmesi ile birlikte bulaşıcı hastalıkların yayılmasında giysilerin rolünün gözden geçirilmesini sağlayarak bu zorlu görevi denedi6. Bu çalışmaya dahil edilen, yün ve pamuk gibi farklı kumaş türlerinde farklı viral suşların hayatta kalmasını inceleyen çeşitli bilimsel çalışmaların gözden geçirilmesiydi 7,8,9,10,11. Her çalışma, vaccinia, poliovirus, respiratuar sinsityal virüs, herpes virüsü ve influenza virüsü dahil olmak üzere farklı bir virüs türüne odaklanmıştır. Kumaşlardaki farklı virüslerin hayatta kalma süreleri, virüs-malzeme kombinasyonuna bağlı olarak 30 dakika ila 5 ay arasında değişiyordu. Çalışmaların birçoğu ayrıca viral kontaminasyonun malzemeden ellere aktarıldığını göstermiştir. Yayının bir parçası olarak, etkili aklama, bulaşmayı azaltmak için önemli bir yönetim tekniği olarak tartışıldı, ancak aklamanın hastalık yükünü azaltmadaki etkisinin büyüklüğünün spesifik viral kirleticiye bağlı olduğu ve 7,8,9,10,11'i ölçmenin zor olduğu kabul edildi.

Aklama işlemi, kimyasal, fiziksel ve ısıl işlem süreçlerini kullanarak mikroorganizmaları yok eder. Örneğin, sabunlar ve deterjanlar toprakları ayırabilir ve kimyasal olarak aracılı bazı antimikrobiyal etkiler verebilir. Fiziksel olarak, seyreltme ve ajitasyon viral yüklerin azaltılmasına yardımcı olabilir. İnsan koronavirüsü HCoV-OC43'ün sıcaklık ve deterjan içeren ve içermeyen endüstriyel ve evsel yıkama döngüleri kullanılarak pamuk örnekleri üzerindeki kalıcılığını inceleyen bir çalışmada, deterjansız ısıtılmamış suda yıkama yaparken tespit edilebilir bir virüs bulunmadığı, ancak toprak yükünün varlığında (yapay tükürük), evsel yıkama döngülerinin numunelerin algılanamayan virüs yüklerine sahip olması için deterjan gerektirdiğini12. Sıcak suyun kendisi de bazı mikroorganizmaları yok etmek için etkili bir araç sağlayabilir13,14.

Mevcut çamaşırhane uygulamalarının durumunu özetleyen yakın tarihli bir yayında, kumaş bileşimi, depolama koşulları, kir yükü, yıkama sıcaklığı ve zamanı ve kurutma sıcaklığı gibi birçok faktörün küresel yıkama uygulamalarında değişen olduğu belirlenmiştir15. Aklama, nüfusun büyük bir yüzdesi için yaygın bir temizleme yöntemi olsa da, mevcut uygulamalardaki bu büyük değişiklik, bir öğenin bir virüs tarafından kirlenebileceği, zorlu ve seyrek olabileceği durumlarda, bunun güvenli ve etkili bir şekilde nasıl yapılacağına dair ayrıntılı rehberlik yapılmasını sağlar. COVID-19 salgını sırasında, Amerika Birleşik Devletleri Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC), ev sahipleri için eşyaların nasıl aklanacağına dair kılavuz yayınladı16,17. Bu aklama kılavuzunun çoğu, bakteriyel dezenfeksiyon18,19 ile ilgili birkaç eski çalışmaya dayanıyordu ve deterjanlarla suda etkisiz hale getirilmiş zarflı virüsleri bulan birkaç tezgah üstü çalışma tarafından desteklendi20,21. Kılavuz, 1) üreticinin deterjan talimatlarını takip etmek, 2) en sıcak uygun su ayarını kullanmak ve 3) tamamen kuru maddeler olarak özetlenebilir. Bu önerilerin mantığı, deterjanla mümkün olan en sıcak döngüde yıkamanın ve tamamen kurutmanın (mümkünse ısı ile) SARS-CoV-2 virüsünü öldüreceğiydi.

Aklama prosesindeki olası varyasyonların çok sayıda olması, değişkenleri izole edebilmek ve spesifik proseslerin viral dezenfeksiyon etkinliğini test edebilmek için burada sunulduğu gibi tek tip bir protokol gerektirmektedir. Bu protokolün amacı, bir eğitim videosu ile birleştiğinde, diğer araştırma çalışmalarında çoğaltma için laboratuvar tabanlı bir sıcak su aklama sürecini göstermektir. Ek olarak, bu viral dezenfeksiyon etkinliği testinin sonuçları, viral tabanlı pandemiler sırasında evde aklamanın etkinliğine tüketici güveni oluşturmalıdır.

Protokol

Phi6, bir işbirlikçi laboratuvardan ~ 1 mL dondurulmuş aliquot olarak alındı ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklandı. Başlangıçta, daha sonra kullanıma kadar -80 ° C'de depolanan daha fazla virüs stokunu yaymak için kullanıldı. Phi6, gösteri virüsü olarak seçildi, çünkü yaygın olarak model zarflı bir virüs olarak kullanılıyor, yüksek titrelere yayılabiliyor ve22,23,24 testini gerçekleştirmek için düşük biyogüvenlik seviyesinde bir laboratuvar gerektiriyor.

1. Virüs stok çözümü hazırlayın

  1. Bakteriyofaj Phi6'yı bakteriyel konakçı Pseudomonas şırıngasında aşağıda açıklandığı gibi modifiye edilmiş bir Triptik Soya Agar media preparasyonu ve yumuşak agar kaplama yöntemi kullanarak çoğaltın.
    1. Modifiye Triptik Soya Agar'ı, Tablo 1'deki malzemeleri deiyonize suda tartarak ve karıştırarak hazırlayın.
    2. 0,9 ila 1,5 arasında optik yoğunluğa (OD 600) sahip 1 mL'lik bir P. şırıngası aliquot'u, 100 mL modifiye Triptik Soya Suyu (Tablo 1) ekleyerek ve oda sıcaklığında (20-26 ° C) ~ 260 rpm'de çalkalayıcı bir inkübatörde inkübe ederek bir gecelik P. syringae kültürü hazırlayın.
    3. Modifiye Triptik Soya Agarını (~ 6 mL) test tüplerine yerleştirerek ve otoklavlanabilir bir kapakla kaplayarak yumuşak agar tüpleri hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın. Agar'ı eritmek için 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yumuşak agar tüpleri. Kaplamaya kadar 48 °C'de tutun. 48 ° C'de denge önemlidir, aksi takdirde virüs tahlilde inaktive edilebilir.
    4. Yumuşak agar'a 1 mL seyreltilmemiş konsantre virüs aliquot ve bir log fazının 100 μL'sini (OD 600 0.9 ila 1.5 arasında) P. şırınga kültürüne ekleyin. Katılaşmış 100 mm çapında modifiye edilmiş bir Triptik Soya agar plakasının yüzeyine yumuşak agar dökün. Kabarcıkları ve / veya dökülmeyi önlemek için, yumuşak agar'ı katı agar yüzeyine eşit olarak dağıtmak ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek için plakaları yavaşça döndürün.
    5. Üç plakanın içeriğini25 steril hücre yayıcı ile 15 mL SM tamponu içeren steril 50 mL konik bir tüpe nazikçe kazıyın. Agar'ı parçalamak için 1-2 dakika boyunca maksimum ayarda vorteks tüpleri ve daha sonra 15 dakika boyunca 7.000 x g'de santrifüj.
    6. Süpernatantı çıkarın ve 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün. Kullanana kadar kriyovyallerde 1 mL alikot -80 °C'de saklayın.

2. KKD öğesinin ön test görsel değerlendirmesini yapın

  1. Her KKD öğesini temiz, pürüzsüz bir yüzeye yerleştirin (örneğin, tek kullanımlık kağıt astarı ile kaplı bir laboratuvar tezgahı). Her KKD öğesini üçlü olarak değerlendirin.
  2. KKD muayenesi sırasında uygun aydınlatmayı sağlayın. Çeşitli yerlerde yıkanmamış öğelerin uzunluğunu ve genişliğini ölçün ve kaydedin (Şekil 1).

figure-protocol-1
Şekil 1. KKD ön test değerlendirme ölçüm yerleri. Denim, fırçalama ve yüz kaplama yerleri, yıkama işleminden kaynaklanan malzeme değişikliklerini izlemek için uzunluğun kaydedildiği yerler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Kupon hazırlayın

  1. KKD'yi keserek 2 cm x 4 cm test kuponları yapın, yüz örtüsü başına iki kupon hazırlayın (üç yüz kaplaması test edildi), denim pantolon başına beş kupon (üç kot pantolon test edildi) ve fırçalama gömleği başına üç kupon (üç fırçalama test edildi).
  2. Aşılanmayacak ancak yıkanacak her malzeme türü için 2 cm x 4 cm prosedürel boş kupon seti (bir tam boyutlu KKD öğesi için bir set) hazırlayın. Yüz örtme deneylerinin her günü için iki kupon, her kot deneyi günü için beş kupon ve fırçalama deneylerinin her günü için üç kupon hazırlayın.
  3. Aşılanacak, ancak yıkanmayacak 2 cm x 4 cm pozitif kontrol kuponu seti hazırlayın. Yüz kaplama deneylerinin her günü için iki kupon hazırlayın (üç yüz kaplaması test edildi), her gün denim deneyleri için beş kupon (üç denim pantolon test edildi) ve her gün fırçalama deneyleri için üç kupon (üç fırçalama test edildi) ve üç paslanmaz çelik kupon.
    NOT: Öğenin boyutuna bağlı olarak farklı sayıda çoğaltma seçilmiştir. Örneğin, yüz kaplamasına beş kupon yapıştırmak fiziksel olarak zordur ve iki kupon kot pantolonun sınırlı bir alanını temsil eder. Konumlar, kapsama alanını en üst düzeye çıkarmak için ve aklama sırasında katlanabilecek ve temizlenmesi daha zor olabilecek bölgelerde seçildi.

4. Aşılama yapın

  1. Toplam 10 mL 1x fosfat tamponlu salin hacminde 1 g sığır eti ekstraktını çözerek% 10'luk bir sığır eti özü çözeltisi hazırlayın. Filtre, 0,2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak tüm hacmi sterilize eder.
  2. Bölüm 1'de hazırlanan virüs stok çözeltisini oda sıcaklığında çözün. Kullanım gününde,% 10 sığır eti ekstraktı çözeltisinin 900 μL'sine çözülmüş Phi6 stoğunun 100 μL'sini ekleyin.
  3. Test kuponlarını ve pozitif kontrol kuponlarını ~107 PFU/numune ile KKD maddesine 10 μL'lik bir damlacık çözelti pipetleyerek ve pipetin ucunu kullanarak damlacığı yayarak aşılayın. KKD malzemesine bağlı olarak, damlacıklar farklı şekilde ayrılacak ve yeniden toplanacaktır.
  4. Aşılanmış kuponların bir biyogüvenlik kabininde kurumasına izin verin. Özel malzemeleriniz için gözlem yoluyla belirlenen kuruma süreleri. Burada sunulan sonuçlar için aşağıdaki süreler kullanılmıştır: ovma = 30 dakika kuruma süresi; yüz örtüsü = 60 dakika kuruma süresi; denim = 30 dakika kuruma süresi; paslanmaz çelik = 120 dakika kuruma süresi.
  5. Güvenlik pimleri ve aseptik teknikler kullanarak Şekil 2'ye göre tam boyutlu KKD öğelerine aşılanmış kuponlar ekleyin.

figure-protocol-2
Şekil 2. Kupon konumlarını denim, keseler ve yüz kaplamaları üzerinde test edin. A-D harfleri, tüm aklama deneyleri için benzersiz kupon tanımlayıcılarına karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Aklama işlemi gerçekleştirin

  1. Aklama deterjanını aşağıdaki gibi hazırlayın.
    1. Çamaşır makinesinde kullanılacak musluk suyunu sterilize edin ve sterilite kontrolü için 10 mL otoklavlanmış su toplayın. Bu protokol için, 60 dakikalık bir sıvı döngüsünde 7 L musluk suyunu otoklav edin.
    2. Üreticinin seyreltme talimatlarına göre yıkama çözeltisi hazırlayın. Bu protokol için, 1.54 mL deterjanı 3.5 L steril musluk suyunda çözün. Bir sıcak plaka ve karıştırma çubuğu kullanarak yıkama solüsyonunu 50 °C'ye ısıtın. Yıkama çözeltisinin pH ve sıcaklığını ölçün ve kaydedin. Sterilite kontrolü için 10 mL çözelti toplayın.
  2. Aklama solüsyonunu sterilize edilmiş bir yıkayıcıya (3.25 L) dökün. Testler arasında 250 ppm-4 saatlik buharlı hidrojen peroksit döngüsü kullanarak yıkayıcıları önceden sterilize edin.
  3. KKD ürünlerini sterilize edilmiş bir yıkayıcıya yerleştirin. Yıkayıcı başına bir kot pantolon ve bir ovma gömlek ekleyin. Yıkayıcı başına bir aşılanmış yüz örtüsü ve dört kirlenmemiş dolgu maskesi ekleyin; Maskeleri doldurmak için kupon takılı değildi.
  4. KKD öğesini 18 dakika boyunca yıkayın (normal ajitasyonla iki adet 9 dakikalık yıkama döngüsü). Köpüğü çıkarmak için yıkayıcıyı boşaltın ve oda sıcaklığında musluk suyuyla (her seferinde 5 L) üçlü durulayın. Oda sıcaklığında sterilize edilmiş musluk suyunu yıkayıcıya (3,25 L) ekleyin ve 9 dakika uzunluğunda bir durulama döngüsü gerçekleştirin.
  5. KKD öğelerini/eşyalarını yıkayıcının sıkma tarafına taşıyın ve 5 dakika boyunca döndürün. KKD ürünlerini kurutucuya taşıyın ve yüksek ısı ayarında (93 °C) 80 dakika kurutun.
  6. KKD'yi kurutucudan steril çalışma alanına taşıyın ve kuponları her bir öğeden aseptik olarak çıkarın ve konik tüplere yerleştirin. Tüpleri 10 mL% 10 Dey-Engley et suyu ekstraksiyon tamponu ile önceden doldurun ve alüminyum folyo ile örtün.

6. Kuponlardaki viral yükleri ayıklayın ve numaralandırın

  1. Kuponları, ekipmanınızın maksimum ayarında 2 dakika boyunca vorteks yaparak 10 mL% 10 Dey-Engley nötralize et suyunu çıkarın.
  2. Geleneksel bir yumuşak üst agar kaplama yöntemi kullanılarak plaka ekstraktları26.
    1. Bölüm 1'de açıklandığı gibi yumuşak modifiye Triptik Soya Agar tüpleri ve bir P. şırınga kültürü hazırlayın. Test gününde, agar'ı eritmek için yumuşak agar tüplerini 121 ° C'de 15 dakika boyunca otoklav yapın. Yumuşak agar'ı kaplamaya kadar 48 ° C'de tutun. 48 ° C'de denge önemlidir, aksi takdirde virüs tahlilde termal olarak inaktive edilebilir.
    2. Aklama çalışmasında kullanılan her test örneği için 1x fosfat tamponlu salin içinde on kat seyreltme serisi hazırlayın. Kaplama için hem seri olarak seyreltilmiş (100 μL) hem de seyreltilmemiş (1 mL ve 100 μL) alikotlar kullanın.
    3. 6 mL yumuşak agar ve log fazı P. şırınga kültürünün 100 μL'sini içeren yumuşak agar tüpüne test numunesi aliquots ekleyin (OD600 0.9-1.5 arasında). Yumuşak agar'ı katılaşmış modifiye edilmiş bir Triptik Soya agar plakasının yüzeyine dökün. Plakayı döndürerek yumuşak agar'ı katı agar yüzeyine eşit olarak dağıtın.
    4. Plakaları oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin ve her plakadaki plak oluşturan birimleri sayarak ertesi gün manuel olarak numaralandırın.

7. KKD ürün(ler)inin test sonrası görsel değerlendirmesini yapın

  1. Test için kullanılan çeşitli KKD öğelerinde aşağıdakileri belgeleyin: solma, renk değişikliği ve / veya hasar belirtileri (örneğin, yırtılma, gerilme); Koku; küçük delikler, kesikler veya gözyaşları (hasar aramak için küçük bir el feneri kullanın); katmanların ayrılması, eksik iplikler, bağlanmanın zarar gördüğü alanlar; dikişlere veya fermuarlara hasar; elastiğin gerilmesini ölçün ve kaydedin.

Sonuçlar

Bu protokolün tamamlanmasından sonra birkaç farklı kalite kontrol verisi ve sonucu üretilir. Plak şekillendirme ünitesi (PFU) plaka sayımları, ekstrakte edilen numune hacmi ile birlikte test kuponu başına PFU sayısının hesaplanmasını sağlar. Tablo 2 , seri seyreltme/kaplama sonuçları için bir veri kayıt sayfası örneğidir. Tablo 1'deki seyreltme faktörünü, numune hacmini ve plaka sayısını kullanarak, Tablo 3 , bir yüz kaplama testi için temsili viral iyileşme sonuçlarını göstermektedir. Bu verilerin, test kuponlarını ve inokülum, kuponlar ve yıkama suyu (deterjanlı ve deterjansız) için kalite kontrol numunelerini içerdiğini unutmayın. Prosedürel boş ve sterilite kalite kontrol numuneleri, su çözeltilerinin ve KKD malzemelerinin Phi6 ile kontamine olmadığını doğrulamak için önemlidir. Kontaminasyonun belirtilmesi, dezenfeksiyon etkinliğinin hatalı hesaplanmasına neden olur ve testin tekrarlanmasını gerektirir. Pozitif kontrol örnekleri, virüs stok çözeltisinin deneyler sırasında çevresel / doğal olarak bozulmadığını doğrulamayı ve böylece aklama işleminin viral yük azaltmadaki etkisini şişirmeyi amaçlamaktadır. Bu örnekler, test kuponu sonuçlarını kabul etmek için inokülum kontrollerinin 1 log PFU'su içinde kalmalıdır. Pozitif kontrol numunelerinin PPU'sundaki büyük bir azalma, analistin protokolü uygun pipetleme ve yayma teknikleriyle yürüttüğünden emin olmak için kupon aşılamasının tüm adımlarının dikkatlice gözden geçirilmesi gerektiğini de göstermektedir.

Bu protokol aynı zamanda aklama nedeniyle giyim eşyalarının malzeme özelliklerinde meydana gelen değişikliklerin değerlendirilmesi ve protokole ilişkin kalite kontrol bilgileri için de bilgi sağlamaktadır (Tablo 4 ve Şekil 3). Bu veriler çeşitli nedenlerle yararlıdır. KKD maddelerinin ölçümlerindeki eğilimlerin kaydedilmesi, üretim hatası olan bir öğenin tanımlanmasına izin verir. Bu tanımlama, aykırı mikrobiyal verileri açıklamaya ve ürün davranışındaki varyasyonu bağlamsallaştırmaya yardımcı olabilir. Koku veya hasarın not alınması, yıkayıcının veya kurutucunun bir deney sırasında optimum düzeyde çalışıp çalışmadığını ve testlerin tekrarlanması veya ekipmana servis yapılması gerekip gerekmediğini de gösterebilir. Ek olarak, test planı aynı KKD öğesinin birden fazla aklama döngüsünü gerektiriyorsa, veriler KKD öğelerinin aklama sırasında kullanım için bütünlüklerini ne kadar süre koruduklarını belirlemeye yardımcı olabilir. Deterjan çözeltisinin pH'ının kaydını tutmak, su kaynağındaki veya deterjan ürünündeki değişikliklere karşı bir uyarı sağlar. Yıkama adımlarının zaman günlüğünün tutulması, yıkayıcı ve kurutucudaki zamanlayıcının deneysel protokolde değişikliklere neden olmamasını sağlar.

Nihayetinde, bu veriler sıcak su aklama prosedürünün viral patojenler için bir vekil kişiye karşı dezenfeksiyon etkinliğini bildirmek için kullanılır. Aklama dezenfeksiyon etkinliği (Eqn. 1), KKD test kuponundan ortalama log 10 virüs geri kazanımının KKD pozitif kontrol sonuçlarından ortalama log10 virüs geri kazanımından çıkarılmasıyla hesaplanır (Şekil 4). Algılanamayan test kuponu sonuçları için, dezenfeksiyon etkinliği hesaplamasında algılama sınırının log10'u kullanılır. Dezenfeksiyon etkinliğinin diğer viral dezenfeksiyon teknikleri ve standartları ile karşılaştırılması için log değerleri olarak bildirilmesi yaygındır.

Dezenfeksiyon Etkinliği = Ortalama log 10 (Pozitif Kontroller) - Ortalama log10 (Test Kuponları) (Eqn. 1)

figure-results-1
Şekil 3. KKD boyutlarında konuma göre değişiklik. Δ = Ön test ölçümü - test sonrası ölçüm. Negatif bir Δ değeri, öğenin belirtilen konumda gerilmesine karşılık gelir ve pozitif bir değer büzülmeye karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4. Phi6'dan yüz kaplamaları, denim ve ovma KKD malzemelerinin dezenfekte edilmesinde sıcak su yıkamanın etkinliği. Yıldızlar tam dezenfeksiyonun gerçekleştiğini gösterir (test kuponlarında algılanmaz). Hata çubukları standart sapmayı gösterir (n = 3). Konum harfleri, Şekil 2'de gösterilen yerleşime karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Çözüm tarifleri. Triptik soya agar, triptik soya suyu ve sığır eti özü çözeltileri hazırlamak için gerekli malzemeler ve miktarlar. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2. Seri seyreltme/kaplama sonuç sayfasının örnek bir kısmı. Ham mikrobiyal verileri raporlamak için şablon. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3. Yüz koruyucu mikrobiyal sonuçlar. İşlenmiş plak şekillendirme birimi (PFU) verileri için örnek özet sayfası. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4. Kalite kontrol ve malzeme değerlendirme günlüğünü temizler. pH probunun kalibrasyonunu, deterjan çözeltisinin pH'ını, yıkama öncesi ve sonrası ölçümleri ve yıkama çevrim sürelerini raporlamak için şablon. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Bu protokol, tam boyutlu KKD/giyim eşyalarından viral dezenfeksiyonun aklama etkinliğini değerlendirmek için sistematik laboratuvar testleri yapmak üzere geliştirilmiştir. Prosedürler, virüsün hazırlanması, test materyalinin aşılanması, aklama işlemi nedeniyle maddelerdeki değişikliklerin değerlendirilmesi ve aklama (makine yıkama ve kurutma) işleminin bir sonucu olarak viral yükteki azalmanın ölçülmesi için kritik adımları özetlemektedir. Ek olarak, protokol, deneylerin kontaminasyondan ve çoklu yıkama döngülerinden sonra KKD öğelerinin malzeme bütünlüğünü izlemek için kaydedilmesi gereken ölçümler / gözlemler tarafından önyargılı olmamasını sağlamak için gerekli kalite kontrol örneklerini özetlemektedir. Phi6 kullanan sonuçlar, bu protokolde kullanılan sıcak su yıkama işleminin, tüm numuneler (yüz kaplama, ovma ve denim pantolonlar) için viral yükte 3 kütükten daha büyük bir azalma sağladığını göstermektedir. Viral yük azaltma, KKD / giyim eşyalarındaki farklı yerlerde de tekdüzeydi. 3 günlük azalmayı göstermek için, bu protokol yüksek bir viral yükün ve tüm durumlar için toprak yükünü temsil etmeyebilecek bir stabilize edici ajanın (sığır eti ekstraktı) kullanılmasını gerektirir.

Mini yıkayıcılar ve kompakt kurutucular, alanın kısıtlı olduğu bir ortamda gerçekleştirilebilecek replika deneylerinin sayısını optimize etmek ve deneyler sırasında kullanılan ekipman ve su hacminin sterilizasyonunu laboratuvar personeli için yönetilebilir tutmak için seçildi. Mini yıkayıcının kullanılmasının bir sonucu olarak, durulama adımları, tamamen otomatik olan çoğu ev yıkama uygulamasına kıyasla manueldi. Makine yıkamanın gelişmiş ülkelerde baskın olduğunu hatırlamak da önemlidir, ancak el yıkama hala tüm dünyada uygulanmaktadır15. Ek olarak, bazıları yıkama için sıcak suya erişemeyebilir ve diğerleri makinede kurutma yerine giysileri manuel olarak kurutabilir. Aklama uygulamalarındaki bu farklılıklar bu mevcut protokolde ele alınmamıştır, ancak yıkama ve kurutma adımlarının bir kova ve yakın bir çizgi kullanılarak değiştirilmesi gibi küçük değişikliklerle kolayca araştırılabilir.

Bilimsel literatürde viral olarak kontamine olmuş yüz kaplamalarının ve sokak kıyafetlerinin tam ölçekte temizlenmesi / dezenfekte edilmesine çok az odaklanılmıştır. Daha yaygın olarak, çalışmalar tekrarlanan yıkama ve kurutma sonrası yüz kaplamalarının filtrasyon performansını değerlendirir, ancak viral dezenfeksiyon etkinliğini değerlendirmez27,28. Örneğin, Clapp ve ark. bez maskelerin ve modifiye prosedür maskelerinin takılı filtrasyon verimliliğini değerlendirmiş ve daha fazla uyum ve filtrasyon verimliliği sağlayan basit modifikasyonlarla performansta geniş farklılıklar bulmuşlardır29. Başka bir çalışma, farklı malzemelerden dört bez maskenin filtrasyon verimliliğine baktı30, yine kaynak kontrolüne veya kişisel korumaya odaklandı. Bunun nedeni, aynı laboratuvarda hem mikrobiyal kısım hem de mekanik testler için uzmanlık eksikliği olabilir. Burada sunulan protokol, dezenfeksiyon etkinliğinin yanı sıra malzeme bozulmasının bir değerlendirmesini sağlar.

Son zamanlarda bilimsel literatürde31,32,33 yayınlanan tek kullanımlık solunum koruması için bir dizi dekontaminasyon / dezenfeksiyon yöntemi (öncelikle N95'ler) bulunmaktadır. FFR'lere (örneğin, N95'ler) birincil odaklanma, sağlık çalışanları ve diğer ön saflardaki meslekler için sağladıkları kritik solunum korumasından kaynaklanmaktadır. Solunum cihazı dekontaminasyonu için birincil teknolojiler, buharlaştırılmış hidrojen peroksit (VHP), ultraviyole mikrop öldürücü radyasyon (UVGI) ve virüs inaktivasyonu için nemli ısıyı (buhar) içeriyordu. Viscusi ve ark. FFR ve UVGI için beş dekontaminasyon yöntemini değerlendirdi; etilen oksit ve VHP'nin en umut verici dekontaminasyon yöntemleri olduğu bulunmuştur31. Fischer ve ark. SARS-CoV-2 ile kontaminasyonu azaltma yetenekleri ve N95 solunum cihazı fonksiyonu üzerindeki etkileri nedeniyle dört farklı dekontaminasyon yöntemini (UV ışığı, kuru ısı,% 70 etanol ve VHP) değerlendirdiler32. FFR'ler için etkili dekontaminasyon teknolojileri ile ilgili 2020 yılında özetlenen ve yayınlanan birçok ek çalışma bulunmaktadır33. Bununla birlikte, bu özel yöntemlere erişilemez veya ortalama bir ev veya küçük işletme sahibi tarafından güvenle kullanılmak üzere tasarlanmamıştır.

Bu protokol, SARS-CoV-2'ye benzer, başak proteinlerine sahip ve tüm testler için benzer büyüklükte (80-100 nm)34 olan zarflı bir bakteriyofaj olan Phi6 kullanılarak geliştirilmiştir. Phi6 bilinen bir patojen olmadığından, genel bir mikrobiyolojik Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL-1) laboratuvarında manipüle edilebilir. Phi6'ya karşı etkinlik, diğer zarflı virüslerin etkinliğini gösterebilir, ancak ilgilenilen her virüs için ampirik doğrulama gereklidir35. Benzer, patojenik olmayan bir viral ajan kullanılarak, bu protokolün başka bir yerde tekrarlanabileceği ve gelecekteki viral salgınları / pandemileri incelemek için kullanılabileceği umulmaktadır. Gelecekteki araştırmalar, deterjanlara ek olarak dezenfektanların (örneğin ağartıcı) kullanımını ve el yıkama ve hat kurutma için standartlaştırılmış bir protokolü içerebilir.

Açıklamalar

Açıklanacak bilinen bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA), Araştırma ve Geliştirme Ofisi aracılığıyla, burada EP-C-15-008 kapsamında açıklanan araştırmayı Jacobs Technology Inc. ile birlikte yönetmiştir. Ajans tarafından gözden geçirilmiştir, ancak Ajansın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. Resmi bir onay alınmamalıdır. EPA, herhangi bir ticari ürün veya hizmetin satın alınmasını veya satılmasını onaylamaz. Yazarlar, EPA RTP mikrobiyolojisinin gözetimi için EPA yüklenicileri Denise Aslett'e, EPA RTP mikrobiyoloji laboratuvarında bu proje üzerindeki çalışmaları için Brian Ford, Rachael Baartmans ve Lesley Mendez Sandoval'a, EPA kalite güvence incelemesini sağladığı için Ramona Sherman'a ve EPA teknik incelemeleri sağladığı için Worth Calfee ve Shannon Serre'ye teşekkür etmek istiyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  Dondurucu (- 80 ° C; C)ThermoFisher BilimselFDE30086FA
  Sıcak PlakaVWR97042-714
  Çengelli Pimler (çelik)Singer319921
  Çalkalayıcı LaboratuvarHattı Aletleri A.Ş.3525
  SM tamponTeknova,  Hollister, CAS0249
  Şırınga filtresi (0.2 & mu; m)Corning, Corning, NYPES şırınga filtreleri, 431229
1X Fosfat Tamponlu Tuzlu SuTeknova, Hollister, CAP0196, 10X PBS çözeltisi
AgarBecton Dickinson214010
Otoklavlanabilir kapaklarDWK Yaşam Bilimleri, Millville, NJKIM-KAP Kapakları, 73663-18
OtoklavSterisAMSCO 250LS Buharlı Sterilizatör Modeli 20VS
Sığır ÖzüSigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, ABDP / N B4888-100g
Kalsiyum klorürSigma-Aldrich793639
Hücre yayıcılarBusse Hastanesi Tek Kullanımlık Malzemeler23600894
SantrifüjThermoFisher Scientific75004271Heraeus MegaFuge 16R Santrifüj
Sertifikalı Zamanlayıcıhttps://nist.time.gov/Uygulanamaz Konik
tüpler (50 mL)Corning Yaşam Bilimleri352098Falcon 50 mL yüksek berraklıkta polipropilen konik santrifüj tüpleri
CryovialsThermo Fisher Scientific, Waltham, MAAY509X33
DenimWranglerRustler Regular Fit Düz Paça Jean Dört Cepli Kepçe Ön Cepli Jean, PN:87619PW
DeterjanProctor and GambleTide Orijinal Koku Sıvı Çamaşır Deterjanı Ürün Numarası (PN): 003700023068
DekstrozFisherBP350
Dey-Engley nötralize edici et suyuBecton DickinsonDF0819172
KurutucuMagic ChefMCSDRY15W
Yüz KaplamalarıFelinaYeniden Kullanılabilir Organik Pamuklu Yüz Maskeleri, PN: 990121P4
Kuluçka makinesi (üst agar)Senfoni414004-596
Laboratuvar DefteriBilimsel Defter Şirketi2001
Magnezyum klorürSigma-AldrichM9272
Medya sterilizasyon ve dağıtım sistemiIntegraMedia Clave/Media Jet
Petri Kapları (100 mm)VWR25384-342
pH MetreOrion/OaktonSTARA1110/EW-35634-35
pH ProbuOrion8157BNUMD
pH StandartlarıOakton00654-(00/04/08)
Phi 6 ve Pseudomonas syringaeBattelle Memorial Institute, Columbus, OHUygulanamaz
Pipet & UçlarRainin(Pipetler) 17014391, 17002921; (Pipet Uçları) 30389239, 17014382
BuzdolabıGerçek İmalat A.Ş.GDM-33
ScrubsGogreen coolPN: WS19100PT
Sodyum klorürSigma-Aldrich57656
Karıştırma ÇubuğuFisherbrand16-800-512
Şerit MetreLufkinPS3425
Yumuşak agar için Test Tüpleri (14 mL)Corning, Corning, NY352059
TermometreFisherbrand14-983-19B
TriptonSigma-AldrichT9410
Buharlı hidrojen peroksit sterilizasyon torbalarıSTERIS62020TW
Vorteks (kaplama işlemi sırasında)Daigger Scientific, Inc3030AVortex Genie 2
Vorteks (numune ekstraksiyonu için)Branson Ultrasonics58816-115Çok Tüplü vortekser
YıkayıcıKuklaKP1040600A
Yıkayıcı SterilizasyonSterisSTERIS VHP ED1000 jeneratör
Maya özüGibco212750

Kaynaklar

  1. Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
  2. Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263(2020).
  3. Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
  4. Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
  5. Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
  6. Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
  7. Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
  8. Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
  9. Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
  10. Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
  11. Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
  12. Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
  13. Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
  14. Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958(2020).
  15. Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220(2021).
  16. COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
  17. COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
  18. Walter, W. G., Schillinger, J. E. Bacterial survival in laundered fabrics. Applied Microbiology. 29 (3), 368-373 (1975).
  19. Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
  20. Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111(2016).
  21. Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
  22. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
  23. Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
  24. Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
  25. Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
  26. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
  27. Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117(2021).
  28. Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
  29. Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
  30. Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
  31. Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
  32. Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253(2020).
  33. Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117(2020).
  34. Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Yıkama EtkinliğiKişisel Koruyucu EkipmanPhi6 BakteriyofajıPlak Sayım YöntemiMateryal BütünlüğüAseptik TeknikViral Yük AzalmasıKalite Kontrol Örnekleri
Sıcak Su Aklamanın Viral Dezenfeksiyon Etkinliğinin Belirlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.