Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

2.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64172

⸱

16 Haziran 2022

 ,  ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2The University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Özet

İç kulak sesi algılar ve koklea ve antreyi kullanarak dengeyi korur. Bunu, saç hücresi olarak bilinen özel bir mekanosensoriyel hücre tipi kullanarak yapar. İç kulaktaki temel araştırmalar, saç hücresinin nasıl çalıştığının ve düzensizliğin işitme kaybına ve vertigoya nasıl yol açabileceğinin derinlemesine anlaşılmasını sağlamıştır. Bu araştırma için, fare önde gelen model sistemi olmuştur. Bununla birlikte, fareler, tüm memeliler gibi, saç hücrelerini değiştirme yeteneğini kaybetmişlerdir. Bu nedenle, iç kulak fonksiyonunu geri kazanmak için hücresel tedavileri anlamaya çalışırken, diğer omurgalı türlerinde tamamlayıcı çalışmalar daha fazla bilgi sağlayabilir. Kuşların işitsel epiteli olan baziler papilla (BP), destekleyici hücreler (SC'ler) tarafından interkalize edilmiş mekanosensoriyel saç hücrelerinden (HC'ler) oluşan bir epitel tabakasıdır. Baziller papilla ve memeli kokleanın anatomik mimarisi farklı olsa da, iç kulak gelişimi ve işitmenin moleküler mekanizmaları benzerdir. Bu, baziler papillayı sadece karşılaştırmalı çalışmalar için değil, aynı zamanda rejenerasyonu anlamak için de yararlı bir sistem haline getirir. Burada, tavuk iç kulağı için diseksiyon ve manipülasyon tekniklerini açıklıyoruz. Teknik, iç kulak gelişiminin moleküler mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araç sunan genetik ve küçük molekül inhibisyon yöntemlerini gösterir. Bu yazıda, CRIPSR-Cas9 delesyonları kullanılarak baziler papillayı genetik olarak bozmak için ovo elektroporasyon tekniklerini, ardından baziler papillanın diseksiyonunu tartıştık. Ayrıca epitel ve saç hücrelerinin gelişimini gözlemlemek için BP organ kültürünü ve kültür matrislerinin optimal kullanımını da gösteriyoruz.

Giriş

Tüm omurgalıların iç kulağı, otik plakod 1,2 olarak bilinen basit bir epitelden türetilmiştir. Bu, işitme ve denge algısı ile ilişkili mekanosensoriyel bilgiyi dönüştürmek için gerekli tüm yapısal elemanlara ve hücre tiplerine yol açacaktır. İç kulağın siliyer sensörü olan saç hücreleri (HC'ler), destekleyici hücrelerle (SC'ler) çevrilidir. HC'ler, sekizinci kranial sinirin nöronları aracılığıyla işitsel arka beyne bilgi iletir. Bunlar ayrıca otik placode3'ten de üretilir. Sesin birincil iletimi, işitsel HC'nin apikal yüzeyinde, mekanik olarak hassas bir saç demeti4 aracılığıyla elde edilir. Buna, stereocilia adı verilen modifiye aktin bazlı çıkıntılar aracılık eder ve bunlar derecelendirilmiş, merdiven deseni5'te düzenlenir. Ek olarak, kinocilium adı verilen modifiye edilmiş bir birincil siliyum, saç demeti oluşumunu düzenler ve en uzun stereosilia 6,7,8 sırasına bitişiktir. Stereosilia mimarisi, akustik enerjiden türetilen mekanik uyaranların elektriksel nöral sinyallere dönüştürülmesindeki bu rol için kritik öneme sahiptir9. Yaşlanma, enfeksiyon, otoakustik travma veya ototoksik şok yoluyla işitsel HC'nin hasar görmesi, memelilerde geri dönüşü olmayan kısmi veya tam işitme kaybına neden olabilir10.

Bu tür hasarları onarabilecek hücresel replasman tedavileri önerilmiştir11,12. Bu araştırmanın yaklaşımı, memeli kıl hücresinin normal gelişimini anlamak ve iç kulakta bulunabilecek progenitör benzeri hücrelerde gelişim programlarının yeniden başlatılıp başlatılamayacağını sormak olmuştur13. İkinci bir yaklaşım, memelilerin dışına, kuşlar gibi işitsel saç hücrelerinin sağlam bir şekilde yenilenmesinin gerçekleştiği memeli olmayan omurgalılara bakmak olmuştur14,15. Kuşlarda, saç hücresi rejenerasyonu ağırlıklı olarak destekleyici bir hücrenin progenitör benzeri bir duruma farklılaşması yoluyla gerçekleşir, bunu bir saç hücresi ve destekleyici hücre16 oluşturmak için asimetrik mitotik bölünme izler. Ek olarak, bir saç hücresi oluşturmak için bir destekleyici hücrenin doğrudan farklılaşması da gözlenmiştir17.

Kuş işitsel gelişim mekanizmaları memelilerinkiyle önemli benzerlikler gösterirken, farklılıklar vardır18. Civciv BP'deki HC ve SC farklılaşması, embriyonik gün (E) 7'den belirgindir ve zamanla daha belirgin hale gelir. E12 ile iyi desenli ve iyi polarize olmuş bir baziler papilla (BP) görselleştirilebilir ve E17 ile iyi gelişmiş saç hücreleri görülebilir19. Bu zaman noktaları, saç hücresi olgunlaşmasının yanı sıra farklılaşma, modelleme ve polarite mekanizmalarına pencereler sağlar. Bu tür mekanizmaların korunmuş mu yoksa farklı mı olduğunu anlamak, mekanosensoriyel saç hücrelerinin kökenlerinin derin homolojisine dair içgörüler sağladıkları için önemlidir.

Burada, iç kulak organının gelişimi boyunca proliferasyon, kader spesifikasyonu, farklılaşma, modelleme ve bakım gibi hücresel süreçleri incelemek için erken ve geç embriyonik aşamalarda gerçekleştirilen bir dizi tekniği gösteriyoruz. Bu, eksplant kültüründe iç kulak gelişimini anlamaya yönelik diğer protokolleri tamamlar20,21,22. İlk olarak, ovo elektroporasyonunda kullanılan E3.5 otokist içindeki BP öncüllerine eksojen DNA veya RNA'nın sokulması tartışılmıştır. Genetik manipülasyonlar değerli bilgiler sağlayabilse de, bu şekilde üretilen fenotipler pleiotropik ve sonuç olarak kafa karıştırıcı olabilir. Bu, özellikle hücre iskeleti yeniden şekillenmesi gibi temel süreçlerin hücre bölünmesi, doku morfogenezi ve hücresel uzmanlaşmada çoklu rol oynadığı daha sonraki iç kulak gelişimi sırasında geçerlidir. Kültürlü eksplantlarda farmakolojik inhibisyon için protokoller sunuyoruz, bu da dozaj ve tedavi zamanlamasını ve süresini kontrol etmede avantajlar sunuyor ve gelişimsel mekanizmaların hassas mekansal zamansal manipülasyonunu sunuyor.

Küçük inhibitörlerin tedavi süresine bağlı olarak farklı organ kültürü yöntemleri kullanılabilir. Burada, epitelyal morfogenez ve hücresel uzmanlaşma hakkında fikir sahibi olmayı sağlayan iki organ kültürü yöntemi gösterilmektedir. Koklear kanalı kültürlemek için bir matris olarak kollajen kullanan 3D kültür için bir yöntem, gelişmekte olan BP'nin sağlam kültürlenmesini ve canlı görselleştirilmesini sağlar. Stereosilia oluşumunu anlamak için, epitel dokusunun aktin çıkıntılarının serbestçe büyümesini sağlayan sert bir matris üzerinde kültürlendiği bir membran kültürü yöntemi sunuyoruz. Her iki yöntem de canlı hücre görüntüleme, immünohistokimya, taramalı elektron mikroskobu (SEM), hücre kaydı vb. gibi aşağı akış işlemlerine izin verir. Bu teknikler, kuş işitsel epitelinin gelişimini, olgunlaşmasını ve yenilenmesini anlamak ve manipüle etmek için civcivin model bir sistem olarak etkili kullanımı için bir yol haritası sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Döllenmiş tavuk yumurtası ve yumurtadan çıkmamış embriyoların tedariki, kültürü ve kullanımını içeren protokoller, Bengaluru, Karnataka Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Civciv işitsel öncüllerinin ovo elektroporasyonunda

  1. CRISPR/Cas9 gen nakavtı için sgRNA tasarımı ve klonlama
    1. Gen nakavtları oluşturmak için, DNA'ları genin ekzon bölgelerini, tercihen kodlama bölgesinin 5' ucuna daha yakın olacak şekilde bozmak için kılavuz haline getirin.
    2. Bir web aracı CRISPOR23 kullanarak potansiyel kılavuz RNA'ları seçin. Tarayıcı verilerini Gallus gallus'a ve protospacer bitişik motif (PAM) dizisini 5'- NGG -3' olarak ayarlayın. Program, giriş dizisinden kılavuz RNA'ları belirler ve hedef içi ve hedef dışı aktiviteye göre farklı puanlar atar. Daha ileri çalışmalar için en iyi dört kılavuzu seçin.
    3. Kılavuz (g)RNA üretimi için şablona özgü oligoların tasarımı için, gRNA tasarım aracı çıktısından PAM dizisini (5′- NGG -3′) çıkarın. Bu, hedefleme için gerekli değildir, ancak Cas9 bölünme tanıma sırasını içerir. Her potansiyel gRNA için her iki ucunda BsmBI kısıtlama bölgesi olan iki HPLC saflaştırılmış tamamlayıcı oligo sentezleyin.
    4. Kılavuz dizisini, seçilen bir vektörün tracrRNA iskelesi ile çerçevede klonlayın (burada, pcU6_1sgRNA vektör kullanıldı24).
    5. SgRNA oligonükleotidlerini DNaz / RNaz içermeyen suda 100 μM konsantrasyonda çözün. Aşağıdaki parametrelere sahip bir termosikler kullanarak iki duyu ve antisens oligo kılavuzunun tavlanmasını gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 95 ° C, daha sonra 15 dakika boyunca 37 ° C ve ardından 4 ° C'ye düşürün.
    6. 25'te açıklandığı gibi standart moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak, tavlanmış oligoların kısıtlama sindirimini ve pcU6_1sgRNA klonlama vektörünü bir gecede BsmBI enzimi ile ayarlayın. Jel saflaştırılmış lineer BsmBI sindirilmiş pcU6_1sgRNA vektörü ve sindirilmiş sgRNA oligoları ile ligasyonu kurun. DH5-alfa yetkin bir hücreye dönüştürün ve sekans elde edilen klonu onaylayın.
  2. Yumurta taşıma ve pencereleme
    1. Taze serilmiş yumurtaları tedarik edin ve kontaminasyonu önlemek için% 70 etanol ile silerek temizleyin. 37-38 ° C'de, 3.5-4 gün boyunca% 45 nem ile inkübe edin.
    2. Kuluçkadan sonra, yumurtayı açmadan önce en az 5 dakika yan tarafına yerleştirin. Bu, embriyonun yumurta sarısının tepesine yeniden konumlandırılmasını sağlar. Yumurtanın üst kısmında ve kör ucunda küçük delikler açmak için forseps kullanın, böylece 21G iğnesi geçebilir.
    3. Pencereleme sırasında hasarı önlemek için, embriyoyu kabuktan uzaklaştırmak için albümini çıkarın. Bunu yapmak için, yumurtanın künt ucundaki bir delikten 2 mL albümini dikkatlice çekmek için 5 mL'lik bir şırınga ve 21G iğne kullanın. Kör uçtaki deliği kapatmak için şeffaf bant kullanın.
    4. Yumurta penceresini yapmak için, yumurta kabuğunun üstüne şeffaf bant yapıştırın. Yaylı yay makası kullanarak yaklaşık 2 cm uzunluğunda ve 1,5 cm genişliğinde bir pencere açın ve embriyoyu ortaya çıkarın. Embriyonun üzerindeki koryonik zarları açmak için forseps kullanın ve embriyoya erişime izin verin.
  3. Mikroenjeksiyon plazmidleri
    1. Gen nakavt deneyi için iki çözüm hazırlayın: SpCas9 proteini ve kılavuz plazmid içeren knock-down karışımı - pcU6_1sgRNA ve T2K-eGFP'nin izleyici plazmid karışımı (bu, Tol2'nin transpozon bölgeleriyle çevrili GFP kasetini süren bir civciv ß-aktin promotörüdür) ve T2TP (Tol2'de klonlanan Tol2 transpozazı yapı26,27). İzleyici, elektroporasyon verimliliğini izlemek için kullanılır.
    2. Birden fazla plazmidi elektroporize ederken, DNA'nın nihai konsantrasyonunun en az 4 μg / μL olduğundan emin olun. Üç yapıyı, kılavuz plazmidi - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP ve T2TP'yi, 1 μg SpCas9 proteini,% 30 sakkaroz ve% 0.1 Hızlı Yeşil boya ile 10 μL'lik son bir hacimde 1: 1 oranında karıştırın.
    3. Dikey pipet çektirme makinesi kullanarak standart cam kılcal damarlardan (uzunluk 3 inç, OD 1,0 mm) mikroenjeksiyon için iğneler çekin. Konik bir uçla yaklaşık 50 μm'lik bir uç çapı elde etmek için çektikten sonra kılcal ucu kırmak için ince forseps kullanın.
    4. Embriyoları E3.5'te sol taraflarında, baş sağa bakacak şekilde yerleştirin. Bu şekilde mikro enjeksiyon için sadece doğru otik vezikül erişilebilir. Knock-down karışımını otik veziküle mikro enjekte edin. Otik vezikülü doldurmak için yaklaşık 200 nL hacimli bir DNA çözeltisi karışımı enjekte edin.
    5. Bir T7 endonükleaz testi28 kullanarak kılavuz verimliliğini belirleyin.
  4. Elektroporasyon
    1. Elektrik direncini düşürmek ve embriyonun aşırı ısınmasını önlemek için elektroporasyondan önce embriyonun üzerine birkaç damla% 0.719 salin ekleyin.
    2. Albümin çıkarıldığında pozitif elektrotu yumurtanın künt tarafında yapılan delikten geçirin. Elektrotu yumurta sarısının altında olacak şekilde manevra yapın. Negatif elektrodu doldurulmuş otokistin üzerine yerleştirin.
    3. Plazmidleri embriyonun hücrelerine transfekte etmek için elektroporasyon kullanın. Bir kare darbe üreteci kullanın ve her biri 50 ms arayla 25 V ve 100 ms süreli beş darbe uygulayın. Bireysel bir elektroporasyon kurulumuna dayanarak koşulları ampirik olarak belirleyin.
    4. Elektroporasyondan sonra embriyoyu% 0.719 salin birkaç damla ekleyerek nemlendirin. Denatüre albümini elektrotların yüzeyinden temizlemek için, damıtılmış suyla iyice durulayın. Yumurtayı şeffaf bantla tekrar kapatın ve daha fazla inkübasyon için nemlendirilmiş inkübatöre 37-38 ° C'de geri dönün.
      NOT: Embriyolar elektroporasyondan sonra yumurtadan çıkana kadar kültürlenebilir, ancak canlılıkta dik bir azalma vardır.

2. Bariler papilla diseksiyonu

  1. Ameliyat masasını, mikroskop aşamasını ve çevresini dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın. Isı veya alkol, minimal yaylı yaylı makas, mikro küret ve iki çift ince forseps içeren mikrodiseksiyon ekipmanını sterilize eder.
  2. Aşağıdaki diseksiyon plakalarını hazırlayın: siyah silikon tabanlı bir cam Petri kabı, 90 mm plastik Petri kabı ve 60 mm Petri kabı. Diseksiyonlar için fosfat tamponlu salin (PBS) veya Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) soğutulur.
  3. Yumurtayı yavaşça 90 mm'lik Petri kabına kırın. Civcivin dış kulağını tanımlayın. Makas kullanarak boynu alt çene seviyesinin hemen altında keserek embriyonun başını kesin. Kafayı buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
  4. Embriyoyu, gaganın üst kısmı deneyciye bakacak şekilde yönlendirin ve gagayı #5 forsepslerden birini kullanarak tutun. İkinci #5 forseps'i kullanarak gözleri çıkarın. Rostralden kaudal'a giderek, kafatasını orta çizgisi boyunca kesin. Beyni dışarı çıkarın.
  5. Daha fazla buz gibi PBS veya HBSS ekleyin ve pinna seviyesine yakın iki parlak yapıyı bulun. Bunlar koklear kanalın sonundaki lagena'nın otolitleridir ve orta hatta yakın bulunurlar.
  6. İki iç kulağı izole etmek için kabaca iki lagena arasında ve bu bölgenin çok üstünde ve altında kesin. Eğik aydınlatma altında, iç kulağın ana hatlarını görselleştirin. Yabancı dokuyu ve antreyi çıkarın.
  7. İzole kokleanı buz gibi soğuk PBS'li siyah silikon taban plakasına aktarın. #5 forseps kullanarak, koklear kanalı elde etmek için kıkırdaklı koklear kapsülü soyun. Koklear kanalın dalgalı tabakasını (tegmentum) bulun ve BP'yi açığa çıkarmak için #55 forseps kullanarak çıkarın. #55 forseps kullanarak, HC'leri ve SC'leri açığa çıkarmak için tektoryal membranı çıkarın.

3. Bazil papilla eksplantlarının kültürü

  1. BP'nin membran kültürü
    1. Altı delikli bir doku kültürü plakası alın ve kuyucuk başına bir kültür membran eki yerleştirin.
    2. Disseke edilmiş baziler papillayı (eksplant) 1x HBSS tamponlu 200 μL'lik bir pipette toplayın ve bir membrana aktarın. Dokunun pipetin duvarına yapışmasını önlemek için, dokuyu aspire etmeden önce bir miktar ortam çekin.
    3. Eksplantı, baziler papilla yukarı bakacak şekilde yönlendirin, böylece saç ve destek hücreleri üst29'dan görülebilir. Eksplant yerleştirildikten sonra, HBSS tamponunu kültür membranı yüzeyinden yavaşça aspire edin. Bu işlemde, eksplant kültür membranına bağlanacaktır.
    4. Altı delikli plakanın kuyularını doldurmak için membran eki ile kuyu duvarı arasına 1,2 mL Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle medium (DMEM) kültür ortamını ekleyin. Tek bir 30 mm'lik kültür membranı üzerinde altı adede kadar eksplant kültürlenebilir.
  2. Koklear kanalın kollajen kültürü
    1. Bir doku kültürü başlığına 400 μL 3 mg / mL sıçan kuyruğu kollajeni, 50 μL 10x DMEM, 30 μL% 7.5 NaHCO3 ve 5 μL HEPES ekleyerek kollajen karışımı hazırlayın.
    2. Dört delikli bir tabak alın ve her bir oyuğa üç damla kollajen karışımı ekleyin. Disseke koklear kanalı her kollajen damlasına aktarın. Kollajen matrisini iyileştirmek için plakayı 37 ° C'de 10 dakika, % 5 CO2 olarak inkübe edin.
  3. Kültürlerin küçük moleküllü tedavisi
    1. Kültür ortamını (DMEM, N-2 takviyesi, Penisilin) farmakolojik modülatör veya çözücüsü ile tek başına (kontrol olarak kullanılmak üzere) hazırlayın. Kültür ortamını, inhibitör ile desteklenmiş 700 μL ortam ile değiştirin. Eksplantları bir inkübatörde 37 ° C'de,% 5 CO2'de kültürleyin.
    2. Kültür medyasının %50'sini her gün değiştirin. Uygun inkübasyon süresinden sonra, kültür ortamını çıkarın ve eksplantları aşağı akış analizleri için kullanın.

4. Görüntüleme ve analiz

  1. İmmünofloresan analizi
    1. Kültür ortamını kuyulardan çıkarın ve eksplantları 1x HBSS ile iki kez yıkayın. Bir pipet kullanarak, kuyuya 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
    2. PFA'yı çıkarın ve eksplantları oda sıcaklığında 1x PBS ile üç kez yıkayın. Eksplantları kültür zarından toplamak için, küçük yaylı yay makası kullanarak doku parçasını içeren zarın etrafında küçük bir kesim yapın ve dokuyu zarla birlikte forseps kullanarak 48 delikli bir kültür plakasına aktarın.
      NOT: Fiksasyondan sonra dokular yüzüyorsa, 200 μL'lik bir pipetle aspire edin ve daha sonraki işlemler için 48 delikli plakalara aktarın. Dokunun zardan zorla ayrılmasını önleyin.
    3. Kollajen damlacık kültürü için, tüm kollajen damlasını bir silikon plakaya aktarmak için forseps kullanın. 200 μL 1x PBS ekleyin ve forseps yardımıyla kollajeni çıkarın ve ardından dokuyu 48 delikli bir kültür plakasına aktarın.
    4. Eksplantları, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0,3 Tween-20 (PBST) ile desteklenmiş 1 mL 1x PBS ile geçirgenleştirin. Eksplantları oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 μL bloke tampon (PBST'de %10 keçi serumu + %1 sığır serumu albümini) ile inkübe edin.
    5. Eksplantları gece boyunca 4 °C'de 200 μL birincil antikor çözeltisi (1:300, bloke edici tamponda) ile inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve eksplantları PBST ile 5 x 20 dakika iyice yıkayın.
    6. Eksplantları karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 μL falloidin ve ikincil antikor çözeltisi (bloke edici tamponda) ile inkübe edin. Falloidin ve ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve eksplantları PBST ile 5 x 20 dakika iyice yıkayın.
      NOT: Her bir görüntüleme uygulaması için ikincil antikor konsantrasyonu ve yıkama uzunluğu belirlenmelidir. Süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak görüntüleme için, tipik olarak ikincil antikorun konsantrasyonunu 1:500'den 1:200'e çıkarırız ve falloidin konsantrasyonunu 1:400'den 1:200'e çıkarırız.
    7. Eksplantları oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir DAPI çözeltisi (PBST'de 1:1000) ile inkübe edin. DAPI çözeltisini çıkarın ve eksplantları PBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    8. Eksplantları BP yukarı doğru bakacak şekilde (kapak kaymasına karşı) bir kızağa monte etmek için montaj ortamını kullanın. Konfokal görüntüleme için antifade montaj ortamı kullanın. Montaj ortamının karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca kurumasını bekleyin. Doğrudan görüntü alın veya görüntülemeye kadar slaytları 4 °C'de saklayın.
  2. SEM analizi için OTOTO fiksasyonu
    1. Tüm çözümleri taze olarak hazırlayın ve yerel güvenlik kurallarına göre işleyin. Membran kültürlü eksplantları (adım 4.1.4'ten itibaren) 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,3) %2,5 glutaraldehit içinde 3 mM CaCl2 ile sabitleyin. Her 24 saatte bir fiksatif değişimi ile 24 ila 72 saat boyunca 4 ° C'de sabitleme gerçekleştirin.
    2. Fiksatifi çıkarın ve dokuyu oda sıcaklığında 3 x 5 dakika 0.1 M sodyum kakodilat ile yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 OsO 4 (0,1 M sodyum kakodilat tamponu kullanılarak %4 OsO4 stoğundan seyreltilmiş) ile ikincil düzeltme. Bunu ve sonraki adımları bir duman davlumbazındaki dehidrasyona kadar gerçekleştirin.
    3. Oda sıcaklığında 0,1 M sodyum kakodilat tamponu 3 x 5 dakika kullanarak durulayın. Daha sonra oda sıcaklığında çift damıtılmış veya ultra saf suda 3 x 5 dakika durulayın.
    4. Ultra saf suda% 0.5'lik bir tiyokarbohidrazit (TCH) çözeltisi hazırlayın. 75 °C'de 10 dakika karıştırın ve oda sıcaklığına soğuduğunda çözeltiyi filtreleyin.
      NOT: TCH son derece tehlikelidir. Kullanım yerel güvenlik komitesi tarafından onaylanmalı ve kullanım sırasında dikkatli olunmalıdır.
    5. Ultra saf suyu numuneden çıkarın ve damla damla% 0,5 TCH ekleyin. Çözelti kahverengiye dönerse,% 0.5 TCH çözeltisini dikkatlice eklemeden önce numuneyi ultra saf suyla durdurun ve durulayın. Çözelti temizlendikten sonra,% 0,5 TCH ile değiştirin. Oda sıcaklığında 20 dk30,31 kuluçkaya yatırın.
    6. Numuneyi oda sıcaklığında 3 x 5 dakika ultra saf suyla durulayın. 4.2.2, 4.2.3 ve 4.2.5 adımlarını OsO4 inkübasyonu ve ardından durulama ile biten iki kez daha tekrarlayın.
    7. Bir etanol serisindeki numuneleri %100 susuz etanol (EtOH) olarak dehidre edin. İlk önce 10 dakika boyunca% 25 ETOH'da, daha sonra% 10 dakika için% 50 ETOH, 10 dakika için% 75 EtOH, 10 dakika için% 95 ETOH'da, her biri% 100 ETOH'da her biri 10 dakika boyunca toplam 3x kuluçkaya yatmadan önce inkübe edin.
    8. Sıvı CO 2 kullanarak kritik noktada kurutmagerçekleştirin. Numuneleri hemen çift taraflı karbon yapışkan bantlı bir SEM saplamasına monte edin. 5-10 nm kaplama sağlamak için püskürtme kaplamasına geçin. Hemen görüntüleme yapılmazsa, numuneleri vakum altında bir kurutucuda saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Elektroporasyon kurulumunda, elektrot konumlandırma transfeksiyon alanında rol oynayabilir. Pozitif elektrot yumurta sarısının altına, negatif ise embriyonun üstüne yerleştirilir (Şekil 1A). Bu, iç kulağın çoğunda ve hem vestibüler organlarda (Şekil 1B) hem de işitsel baziler papillada (Şekil 1C, D) daha yüksek GFP ekspresyonuna neden olur ve transfeksiyonu doğrular.

CRISPR-knockdown'ları...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Civciv, bir laboratuvarın iç kulağı araştırmak için kullanabileceği model organizmalara uygun maliyetli ve kullanışlı bir ektir. Burada açıklanan yöntemler laboratuvarımızda rutin olarak kullanılmaktadır ve memeli iç kulağında devam eden araştırmaları tamamlamaktadır. Ovo'da elektroporasyon, civciv genomuna genetik manipülasyonlar sokmak için kullanılır. Elektroporasyon, belirli organellere veya hücre altı yapılara hedeflenen floresan proteinleri kodlayan yapıları tanıtmak için de kullanılabilir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmek için rakip çıkarları yoktur.

Teşekkürler

NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB ve Royal National Institute for the Deaf'ın desteğini minnetle kabul ediyoruz. Merkezi Kanatlı Geliştirme Organizasyonu ve Eğitim Enstitüsü, Hesaraghatta, Bengaluru'ya teşekkür ederiz. NCBS'deki CIFF ve EM tesisine ve laboratuvar desteğine minnettarız. Tol2-eGFP ve T2TP yapıları için Yoshiko Takahashi ve Koichi Kawakami'ye, HCA ve G19 Pcdh15 antikoru için Guy Richardson'a teşekkür ederiz. Earlab üyelerine protokol hakkındaki sürekli destekleri ve değerli geri bildirimleri için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287
Alt-R SP HiFi Cas9 Nükleaz V3Entegre DNA Teknolojileri1081061Yüksek kaliteli Cas9 proteini
Anti-GFP antikoruAbcamab290Tavşan poliklonal - GFP
Sığır Serumu AlbüminSigma-AldrichA9647
Kalsiyum Klorür DihidratThermo Fisher ScientificQ12135
Kollajen I, sıçan kuyruğuThermo Fisher ScientificA1048301
Kritik Nokta Kurutucu Leica EM CPD300Leica
CUY-21 ElektroporatörNepagene
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DM5000B Geniş Alan MikroskobuLeica
DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi, piruvatThermo Fisher Bilimsel10569010
Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-20
Dumont #55 ForsepsGüzel Bilim Araçları11255-20
Hızlı Yeşil FCF (Örf)Sigma-AldrichF7252
FluoroshieldSigma-AldrichF6182
FLUOVIEW 3000 Lazer Tarama MikroskobuOlympus
Gluteraldehit (%25)Sigma-Aldrich340855
Keçi Anti-Fare IgG İkincil Antikoru, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
Keçi Anti-Fare IgG İkincil Antikor, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
Keçi anti-Tavşan IgG İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
Keçi Serumu Steril filtreliHiMediaRM10701Isı ile inaktive edilmiş
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025092
LSM980 Airyscan MikroskopZeiss
Millicell Hücre Kültürü Eki, 30 mm, hidrofilik PTFE, 0.4 & mSigma-AldrichPICM03050
MVX10 Stereo MikroskopOlympus
MYO7A antikoruDSHB138-1Fare monoklonal - Geleneksel olmayan miyozin-VIIa
MZ16 Diseksiyon mikroskobuLeica
N-2 Takviyesi (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
Noyes Makas, 14cm (5.5' ')Dünya Hassas Aletler501237
Osmiyum tetroksit (% 4)Sigma-Aldrich75632
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127
PC-10 ÇektirmeNarishige pcU6_1sgRNA
Addgene92395Modifiye tavuk U6 promotörü ile mini vektör
Penisilin G sodyum tuzuSigma-AldrichP3032
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Altın Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
SMZ1500 Diseksiyon mikroskobuNikon
Sodyum Kakodilat Tamponu, 0.2MElektron Mikroskobu Bilimleri11652
Sodyum klorürHiMediaGRM853
Sputtre Kaplayıcı K550XEmitech
Standart Cam Kılcal Damarlar 3 inç, OD 1.0 mm, Filament YokDünya Hassas Aletler1B100-3
SükrozSigma-Aldrich84097
MERLIN Kompakt VPZeiss
TiyokarbohidrazidAlfa AesarL01205
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379

Kaynaklar

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142(2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
  6. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
  7. Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
  8. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1(2012).
  9. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833(2016).
  10. Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
  11. Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
  12. Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
  13. Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
  14. Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
  15. Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
  16. Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
  17. Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
  18. Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
  19. Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
  20. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
  21. Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
  22. Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994(2020).
  23. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  24. Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
  26. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
  27. Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
  28. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
  29. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).
  30. Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
  31. Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
  32. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  33. Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
  34. Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
  35. Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
  36. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
  37. Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
  38. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
  39. Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Baziler PapillaT y H cresi RejenerasyonuIn Ovo ElektroporasyonEx Ovo K lt rCivciv Embriyosu DiseksiyonuCRISPR Cas9 NakavtOrgan K lt rS per z n rl kl MikroskopiDestek H creleri
Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.