Method Article

In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre Otonom Fonksiyonunun Diseksiyonu

DOI:

10.3791/64187

⸱

July 6th, 2022

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ovo elektroporasyonunu kullanarak, devre montajının ayrı dönemlerinde kırılgan X mental retardasyon proteininin hücre grubuna özgü bir nakavtını sağlamak için tavuk embriyolarındaki işitsel iç kulağı ve koklear çekirdeği seçici olarak transfekte etmek için bir yöntem geliştirdik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Frajil X mental retardasyon proteini (FMRP), lokal protein translasyonunu düzenleyen mRNA bağlayıcı bir proteindir. FMRP kaybı veya disfonksiyonu, zihinsel yetersizlik, duyusal anormallikler ve sosyal iletişim sorunları ile karakterize olan kırılgan X sendromunda (FXS) anormal nöronal ve sinaptik aktivitelere yol açar. FMRP fonksiyonu ve FXS patogenezi çalışmaları öncelikle transgenik hayvanlarda Fmr1 (FMRP'yi kodlayan gen) nakavtı ile yapılmıştır. Burada, tavuk embriyolarını kullanarak devre montajı ve sinaptik oluşum döneminde FMRP'nin hücre otonom fonksiyonunu belirlemek için in vivo bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, Fmr1 küçük saç tokası RNA'sı (shRNA) ve bir EGFP muhabiri içeren ilaca bağlı bir vektör sisteminin aşama, saha ve yöne özgü elektroporasyonunu kullanır. Bu yöntemle, işitsel ganglionda (AG) ve beyin sapı hedeflerinden biri olan çekirdek magnoselülarisinde (NM) seçici FMRP nakavtı elde ettik, böylece AG-NM devresinde bileşene özgü bir manipülasyon sağladık. Ek olarak, transfeksiyonun mozaik deseni, veri analizinde gelişmiş güvenilirlik ve duyarlılık için hayvan içi kontrollere ve komşu nöron / lif karşılaştırmalarına izin verir. İndüklenebilir vektör sistemi, biriken gelişimsel etkileri en aza indirmek için gen düzenleme başlangıcının zamansal kontrolünü sağlar. Bu stratejilerin kombinasyonu, FMRP'nin sinaptik ve devre geliştirmedeki hücre otonom işlevini incelemek için yenilikçi bir araç sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Frajil X sendromu (FXS), zihinsel yetersizlik, duyusal anormallikler ve otistik davranışlarla karakterize nörogelişimsel bir bozukluktur. Çoğu durumda, FXS, erken embriyonik aşama1'den başlayarak kırılgan X zihinsel gerilik proteininin (FMRP; Fmr1 geni tarafından kodlanmış) küresel bir kaybından kaynaklanır. FMRP, normalde beyindeki çoğu nöronda ve glial hücrede ve ayrıca duyu organlarında eksprese edilen RNA bağlayıcı bir proteindir 2,3,4. Memeli beyinlerinde, FMRP muhtemelen çeşitli sinirsel aktiviteler için önemli olan proteinleri kodlayan ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurta ve tavuk embriyoları, Jinan Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan hayvan protokollerine uygun olarak özen ve saygıyla ele alındı.

1. Yumurta ve plazmid hazırlanması

  1. Yumurta hazırlama
    1. Güney Çin Tarım Üniversitesi'nden taze döllenmiş tavuk yumurtası (Gallus gallus) alın ve kuluçkadan önce 16 ° C'de saklayın. Optimum canlılık için, tüm yumurtaları varıştan sonraki bir hafta içinde kuluçkaya koyun.
    2. Yumurtaları yatay olarak yerleştirin ve nöral tüp transfeksiyonu için Hamburger ve Hamilton (HH) evre 1225'e kadar 46-48 saat boyunca ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ovo elektroporasyonunda farklı bölgelerde ve farklı gelişim aşamalarında gerçekleştirerek, işitsel çevrede veya işitsel beyin sapında seçici FMRP nakavtı sağladık.

NM'de FMRP nakavtı
Tavuk Fmr1'e karşı küçük saç tokası RNA'sı (shRNA), daha önce20'de açıklandığı gibi Tet-On vektör sistemine tasarlanmış ve klonlanmıştır. In ovo elektroporasyon için kurulum Şekil 1A'da gösterilmiştir. Hızlı yeşil .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FMRP'nin hücre özerk işlevini belirlemek için, ekspresyonunu bireysel hücre gruplarında veya hücre tiplerinde manipüle etmek gerekir. FMRP'nin ana işlevlerinden biri sinaptik oluşumu ve plastisiteyi düzenlemek olduğundan, belirli bir devrenin her bir sinaptik bileşenini seçici olarak manipüle etmek, sinaptik iletişimde FMRP mekanizmasının tam olarak anlaşılması için ön koşuldur. Tavuk embriyolarının ovo elektroporasyonunda kullanarak, AG-NM devresinde, presinaptik AG nöronlarında.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma şu kişiler tarafından desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibesi (No. 32000697); Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (202102080139); Guangdong Doğa Bilimleri Vakfı (2019A1515110625, 2021A1515010619); Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (11620324); Rejeneratif Tıp Anahtar Laboratuvarı Araştırma Bursu, Eğitim Bakanlığı, Jinan Üniversitesi (No. ZSYXM202107); Çin Merkez Üniversiteleri için Temel Araştırma Fonları (21621054); ve Çin'in Guangdong Eyaleti Tıbbi Bilimsel Araştırma Vakfı (20191118142729581). Jinan Üniversitesi tıbbi deney merkezine teşekkür ederiz. Dr. Terra Bradley'e yazının dikkatli bir şekilde düzenlenmesi için teşekk....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< güçlü > Yumurta kuluçka < / güçlü >
16 derece C buzdolabıMAGATDöllenmiş yumurta depolaması için kullanılır.
Yumurta kuluçka makinesiSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
Döllenmiş yumurtalarGüney Çin Ziraat ÜniversitesiOptimum canlılık için yumurtalar bir hafta içinde kullanılmalıdır.
Plazmid hazırlama< / güçlü>
SantrifüjSigma10016
Hızlı yeşilSolarbioG1661Damıtılmış su ve otoklavda% 0.1 çalışma çözeltisi yapın.
Plazmid Maxi-hazırlık kitiQIAGEN12162Plazmit DNA'yı Tris-EDTA (TE) tamponunda çözün; endotoksin içermeyen hazırlama kiti
Sodyum AsetatSigma-AldrichS2889Nükleaz içermeyen suda 7.5M çalışma çözeltisi yapın.
Elektroporasyon ve Doksisiklin Uygulaması< / güçlü>
ElektroporatörBTXECM399
1 mL / 5 mL ŞırıngaGUANGZHOU KANGFULAI
Diseksiyon mikroskobuCNOPTECSZM-42
DoxcyclineSigma-AldrichD9891Her doz için taze alikotlar kullanın ve -20 ° C'de saklayın derece;C.
Cam kılcalBEIBOBOMEIRD09100.9-1.1 mm * 100 mm
Laboratuvar parafilmiPARAFILMPM996şeffaf film
Pipet çektirmeCHENGDU ENSTRÜMAN FABRİKASIWD-2Çekme koşulu: 500 ve derece; C 15 s
Platin elktrodlariçin Ev yapımı0,5 mm çap, 1,5 mm aralıklı.
Kauçuk tüpSigma-AldrichA5177
< güçlü > Doku Diseksiyonu ve Fiksasyonu < / güçlü >
ForsepsRWDF11020-11Uç boyutu: 0,05 * 0,01 mm
Diğer cerrahi aletlerRWD
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127Fosfat tamponlu tuzlu su içinde taze yapılmış% 4 PFA çözeltisi 4 ° C'de saklanabilir; 1 haftaya kadar C.
SYLGARD 184 Silikon Elastomer KitiDOW01673921Siyah arka plan plakaları için gıda sınıfı karbon tozu uygulanır.
Kesit alma
KriyostatLEICACM1850
JelatinSigma-AldrichG9391Sığır derisinden.
Kayar mikrotomLEICASM2010
İmmün boyama
Alexa Fluor 488 keçi anti-FareAbcamab1501131:500 seyreltme, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 keçi anti-tavşanAbcamab1500781:500 seyreltme, RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000 seyreltme
Fluoromount-G montaj ortamıGüney  BiyoteknolojiSb-0100-01
FMRP antikoruY. Wang, Florida Eyalet Üniversitesi82631:1000 seyreltme, RRID: AB_2861242
Islet-1 antikoruDSHB39.3F71:100 seyreltme, RRID: AB_1157901
Netwell plakasıCorning3478
Nörofilament antikoruSigma-AldrichN41421:1000 seyreltme, RRID: AB_477272
Parvalbumin antikoruSigma-AldrichP30881:10000 seyreltme, RRID: AB_477329
SNAP25 antikoruAbcamab660661:1000 seyreltme, RRID:
AB_2192052Görüntüleme
Adobe photoshopADOBEgörüntü düzenleme yazılımı
Konfokal mikroskopLEICASP8
Floresan stereomikroskopOLYMPUSMVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0OlYMPUSticari görüntü işleme yazılım paketi
Çiftliği #

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fragile X SyndromeFMRP KnockdownIn Ovo ElectroporationAuditory CircuitChicken EmbryoSmall Hairpin RNAEGFP ReporterAuditory GanglionNucleus MagnocellularisNeural Tube Transfection

Related Articles