İnfluenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu, konakçı ve viral proteinleri parçalayan kaspazları aktive eder ve bunlar da pro- ve antiviral fonksiyonlara sahiptir. İnhibitörler, RNA girişimi, bölgeye yönelik mutagenez ve batı lekelenme ve RT-qPCR teknikleri kullanılarak, konakçı kortaktin ve histon deasetilazları parçalayan enfekte memeli hücrelerinde kaspazlar tanımlandı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnfluenza A Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Proteinleri Parçalayan Kaspasların ve Motiflerinin Belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Sistein proteazlarının bir ailesi olan kaspazlar, mikrobiyal enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt olarak programlanmış hücre ölümünü düzenler. Başlangıçta apoptoz ile ortaya çıktığı tanımlanan programlanmış hücre ölümünün şimdi birbirine bağlı üç yolu kapsadığı bilinmektedir: pirotoz, apoptoz ve nekroptoz, birlikte tek bir süreç olarak adlandırılan PANoptoz. Etki Bir virüs (IAV) enfeksiyonu, farklı kaspazların aktivasyonunu indükleyerek memeli hücrelerinde PANoptozu indükler, bu da çeşitli konakçıların yanı sıra viral proteinleri de parçalara ayırır ve konakçının doğuştan gelen antiviral yanıtının aktivasyonu veya antagonistik konakçı proteinlerinin bozulması gibi süreçlere yol açar. Bu bağlamda, IAV enfeksiyonuna yanıt olarak hem hayvan hem de insan epitel hücrelerinde konakçı kortaktin, histon deasetilaz 4 (HDAC4) ve histon deasetilaz 6'nın (HDAC6) kaspaz 3 aracılı bölünmesi keşfedilmiştir. Bunu göstermek için, inhibitörler, RNA girişimi ve bölgeye yönelik mutagenez kullanıldı ve daha sonra, bölünmeye karşı bölünme veya direnç ve kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin geri kazanımı batı lekelenmesi ile ölçüldü. Bu yöntemler, RT-qPCR ile birlikte, IAV veya diğer insan ve hayvan virüslerinin enfeksiyonu sırasında kaspaz aracılı bölünmeye maruz kalan viral proteinlerin yanı sıra konakçıyı tanımlamak için basit ama etkili bir strateji oluşturur. Mevcut protokol, bu stratejinin temsili sonuçlarını detaylandırmakta ve daha etkili hale getirmenin yolları da tartışılmaktadır.
Giriş
İnfluenza A virüsü (IAV), Orthomyxoviridae ailesinin prototipik üyesidir ve küresel salgınlara ve öngörülemeyen pandemilere neden olduğu bilinmektedir. IAV, genellikle "grip" olarak bilinen insan solunum yolu hastalığına, influenzaya neden olur. Grip, konakçı pro- ve anti-inflamatuar doğuştan gelen immün yanıtların indüksiyonu ve insan solunum yollarında epitel hücrelerinin ölümü ile sonuçlanan akut bir hastalıktır. Her iki süreç de programlanmış hücre ölümü1 adı verilen bir fenomen tarafından yönetilir. Programlanmış hücre ölümü için sinyalizasyon, çeşitli patojen tanıma reseptörleri konakçı hücrelerde gelen virüs parçacıklarını algıl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
IAV ve memeli hücreleriyle çalışmak için Otago Üniversitesi Kurumsal Biyolojik Güvenlik Komitesi'nden düzenleyici onaylar alındı. Bu çalışmada Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) veya insan akciğer alveoler epitel A549 hücreleri ve IAV H1N1 alt tipleri kullanılmıştır. IAV, başka bir yerde açıklandığı gibi tavuk yumurtasında yetiştirildi17. Memeli hücreleriyle çalışmak için steril ve aseptik koşullar kullanıldı ve IAV alt tipleriyle çalışmak için bir Biyogüvenlik Seviye 2 (veya Fiziksel Muhafaza 2) tesisi ve Sınıf II biyogüvenlik kabini kullanıldı.
1. IAV ile enfekte olmuş hücrelerdeki proteinlerin kaspazlar tarafı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kaspaz 3 inhibitörü ile tedavi
Konakçı kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin hem köpek (MDCK) hem de insan (A549, NHBE) hücrelerinde IAV enfeksiyonuna yanıt olarak bozulmaya uğradığı keşfedilmiştir 7,8,9. Yukarıdaki yaklaşımlar kullanılarak, IAV kaynaklı konak kaspazlarının, özellikle kaspaz 3'ün, 7,8,9 oranınd.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Virüslerin konakçı faktörleri ve yolları kendi yararlarına göre uyarladıkları tespit edilmiştir. Buna karşılık, konakçı hücreler çeşitli stratejiler kullanarak buna direnirler. Bu stratejilerden biri, konakçı hücrelerin virüs enfeksiyonlarına karşı antiviral bir strateji olarak kullandıkları PANoptozdur. Bununla birlikte, IAV gibi virüsler, PANoptoza karşı koymak ve onu kendi avantajlarına göre kullanmak için kendi stratejilerini geliştirmiştir 1,3,6
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarın açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazar, Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Kaynakları (NIAID), Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi, Maurice ve Phyllis Paykel Vakfı (Yeni Zelanda), HS ve J.C. Anderson Trust (Dunedin) ve Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü ve Biyomedikal Bilimler Okulu'nu (Otago Üniversitesi) kabul ediyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| A549 hücreleri | ATCC | CRM-CCL-185 | İnsan, epitel, akciğer |
| Amonyum klorür | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Kaspaz 3 İnhibitörü | Sigma-Aldrich | 264156-M | 'Çözelti İçi Kaspaz-3 İnhibitörü II - Calbiochem'cOmplete |
| , Mini Proteaz İnhibitörü Kokteyli | Roche | 11836153001 | |
| Keçi anti-NP olarak da bilinir Richard | Hediyesi (St Jude Children' s Araştırma Hastanesi, Memphis, ABD) - MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfeksiyon Reaktifi | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK hücreleri | ATCC | CCL-34 | Köpek, epitel, böbrek |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Temel Orta (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Gerektiği gibi L-glutamin, antibiyotik veya diğer takviyeleri ekleyin |
| MİSYON siRNA Evrensel Negatif Kontrol #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc görüntüleyici, Image Studio Lite yazılımı 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc, Odyssey XF ile değiştirildi ve Image Studio Lite yazılımı, Empiria Studio yazılımı ile değiştirildi. | |
| Pierce BCA Protein Test Kiti | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| İnsan kortaktin-GFP füzyonunu eksprese eden Plazmid | Addgene | 50728 | Kenneth Yamada'dan Addgene'ye Hediye |
| Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID'ye | önceden tasarlanmış küçük enterferans yapan RNA (siRNA): |
| Kaspaz'a önceden tasarlanmış küçük enterferans yapan RNA 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Kaspaz'a önceden tasarlanmış küçük enterferans yapan RNA 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Önceden tasarlanmış SYBR Green RT-qPCR Primer çiftleri | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Çifti Kimlikleri: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitroselüloz membran | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Tavşan anti-aktin antikoru | Abcam | ab8227 | |
| Tavşan anti-kortaktin antikoru | Hücre Sinyali | 3502 | |
| Tavşan anti-GFP antikoru | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Önceden Boyanmış Protein Standardı | ThermoFisher Bilimsel | LC5625 | |
| Transfeksiyon ortamı, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodyum Deoksikolat, Triton X-100 | Merck | ||
| Tripsin, TPCK ile Tedavi Edilmiş | Sigma-Aldrich | 4370285 |
Kaynaklar
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
