Method Article

Hidrojen Sülfür Üreten Bakterilerin Tespiti için Hassas Bir Görsel Yöntem

DOI:

10.3791/64201

⸱

June 27th, 2022

 , 
1Department of Microbiology, School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, 2National Experimental Teaching Demonstration Center of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bizmut sülfür (BS) çökeltmesi için kullanılan modifiye edilmiş bir protokol ile hidrojen sülfür üreten bakterileri tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemin en önemli avantajları, değerlendirilmesinin kolay olması ve özel ekipman gerektirmemesidir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrojen sülfür (H2S), insan sağlığında önemli rol oynayan kükürt içeren amino asit ve proteinlerin proteolizinde bakteriler tarafından üretilen toksik bir gazdır. H2S üretim testi, önemli bakteriyel biyokimyasal tanımlama testlerinden biridir. Geleneksel yöntemler sadece sıkıcı ve zaman alıcı değil, aynı zamanda kükürt içeren ortamdaki ağır metal tuzlarının toksik etkisi nedeniyle bakteriyel büyümenin inhibisyonuna eğilimlidir ve bu da genellikle olumsuz sonuçlara yol açar. Burada, bakterilerdeH2S'yi tespit etmek için basit ve hassas bir yöntem oluşturduk. Bu yöntem, 96 kuyucuklu şeffaf mikrotitre plakaları kullanan bizmut sülfür (BS) çökeltmesinin değiştirilmiş bir versiyonudur. Bakteri kültürü, L-sistein içeren bizmut çözeltisi ile birleştirildi ve sonunda siyah bir çökelti gözlenen 20 dakika boyunca ekildi. H2 S için görsel algılamasınırı 0,2 mM idi. Görsel renk değişimine bağlı olarak,H2S üreten bakterilerin basit, yüksek verimli ve hızlı tespiti sağlanabilir. Özetle, bu yöntem bakterilerdeH2S üretimini tanımlamak için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrojen sülfür üreten bakteriler, hidrojen sülfür (H2S) üretmek için kükürt içeren amino asitleri ve proteinleri kullanabilir. H2 S üretimigenellikle gram-negatif Enterobacteriaceae ailesi bakterilerinde ve ayrıca Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. ve Shewanella spp.1 üyelerinde görülür. Bu bakteriler, enerji elde etmek için sülfatı hidrojen sülfüre (H2S) indirgeme yeteneğine sahiptir. Hidrojen sülfür, bakteriyel ilaç direncinin gelişiminde rol oynamıştır. H2S, bakterileri reaktif oksijen türlerinin (ROS) toksisitesinden korur, böylece antibiyotiklerin antibakteriyel etkisini antagonize eder 2,3. H2S ayrıca homeostazın korunmasında önemli bir fizyolojik etkiye sahiptir. Suprafizyolojik seviyelerde,H2S'nin vücut için derinden toksik olduğu gösterilmiştir. İnsan vücudunda,H2S, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde yer alan bir gaz sinyal molekülü olarak başka bir role sahiptir. H2S, kalbin sistolik fonksiyonunu düzenleyebilir ve kan damarlarının gevşetilmesinde, vasküler yeniden şekillenmenin inhibe edilmesinde ve miyokard 4,5'in korunmasında önemli bir fizyolojik rol oynar. H2S ayrıca sinir sistemi ve sindirim sisteminin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar 6,7. Bakterilerin bakterisidal antibiyotiklere maruz kaldıklarında hücre ölümüne yol açan ölümcül reaktif oksijen türleri (ROS) ürettikleri bulunmuştur 8,9,10,11.

Mikrobiyolojik laboratuvar derslerinde yaygın bir biyokimyasal test olan hidrojen sülfür testi, bakterilerin, özellikle de Enterobacteriaceae familyasının bakterilerinin tanımlanmasında önemli bir deneydir. Şu anda, hidrojen sülfür testi genellikle test edilecek bakterilerle aşılanmış çok sayıda kükürt içeren amino asit ve kurşun asetat ortamı üzerinde gerçekleştirilmektedir. Bir inkübasyon süresinden sonra (2-3 gün), sonuçlar, kurşun asetat üretimi nedeniyle kültür ortamının veya kurşun asetat kağıt şeridinin kararıp kararmadığı gözlemlenerek değerlendirilir11. Bununla birlikte, bu geleneksel yöntemler sadece sıkıcı ve zaman alıcı değil, aynı zamanda kükürt içeren ortamdaki ağır metal tuzlarının toksik etkisi nedeniyle bakteriyel büyümenin inhibisyonuna eğilimlidir ve bu da genellikle olumsuz sonuçlara yol açar. H2S12,13'ün tespiti için bizmut tabanlı bir yöntem oluşturulmuştur. H2S, bizmut ile reaksiyona girerek siyah bizmut sülfür çökeltmesi oluşturabilir. Bu biyokimyasal test için bir reform yapmak için, bakteri büyümesi üzerinde hiçbir yan etkisi olmayan basit ve hızlı bir yöntem oluşturulması gerekmektedir. Burada, 96 delikli mikrotitre plaka formatında substrat olarak bizmut sülfür kullanılarak in vitro bir ortamda yetiştirilen hidrojen sülfür üreten bakterilerin tespiti için basit bir yöntem oluşturduk.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bakteri suşları

NOT: Bu deney için Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris ve Klebsiella pneumoniae dahil olmak üzere dokuz standart suş kullanılmıştır (Tablo 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa ve Proteus vuigaris, önceki literatür1'de belirtildiği gibiH2S üretebilir.

  1. Bakteri kültürünün hazırlanması
    1. Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 ve Klebsiella pneumoniae'nin bir bakteri kolonisini bir Luria-Bertani (LB) agar plakasından 100 mL LB ortamına ve kültürüne 12-16 saat boyunca 37 ° C'de bakteri konsantrasyonu yaklaşık 1 x 109 hücre / mL olana kadar (OD600 = 1 ile gösterildiği gibi) aktarın.
    2. Fusobacterium nucleatum ve Proteus vuigaris'in bir bakteri kolonisini, triptikaz soya suyu (TSB) agar plakalarından, bakteri konsantrasyonu yaklaşık 1 x 109 hücre / mL olana kadar 24 saat boyunca anaerobik olarak 37 ° C'de 100 mL TSB ortamına ve kültürüne aktarın (OD600 = 1 ile gösterildiği gibi).

2. H2S tespit testi

  1. Hidrojen sülfür üretim testi
    1. 100 μL bakteri kültürünü, 100 μL yeni hazırlanmış bizmut çözeltisi (pH 8.0; 10 mM bizmut (III) klorür, 0.4 M trietanolamin-HCl, 20 mM piridoksal 5-fosfat monohidrat, 20 mM EDTA ve 40 mM L-sistein) ile 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarında ve kültüründe 37 °C'de 20 dakika boyunca karıştırın. Her bakteri suşu için, analizi üçlü olarak gerçekleştirin.
    2. 20 dakika sonra renk değişikliği olup olmadığını kontrol edin. Çözeltinin rengi açık sarıdan siyaha değişirse, bu bakterilerinH2S üretebildiğini gösterir.
  2. Yöntemin hassasiyeti
    1. Farklı konsantrasyonlarda sodyum hidrosülfür (NaHS) kullanarak yöntemin duyarlılığını belirleyin: BS çözeltisi 14 ile karıştırılmış 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM ve 0 mM.
    2. Siyah bir BS çökeltisinin oluşumunu gözlemleyerek HS−/S2− varlığını belirleyin. Renk üretimi yok (-) ile en koyu siyah renk üretimine (+++++++) kadar görsel bir ölçek kullanarak kuyuların rengini puanlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrojen sülfür üreten bakterilerin tespiti
H2 S testininperformansı, Tablo 1'de listelendiği gibi, seçilmiş bakteri suşlarının saf kültürleri kullanılarak araştırılmıştır. Sonuçlar, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa ve Proteus vuigaris'in siyah BS çökeltisi ileH2S üretebildiğini, Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrojen sülfür üretim testi, bakteri suşlarının tanımlanması ve farklılaştırılması için geleneksel fenotipik testlerden biridir. Birçok bakteri türü, su suyu gibi doğal ortamlarında hidrojen sülfür üretebilir. Bu bakteri türleri arasında Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., bazı Klebsiella sp., Escherichia coli suşları ve bazı anaerobik Clostridia türleri15,16 bulunur. Bununla birlik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) ve Çin Eczacılık Üniversitesi Öğretim Reformu Araştırma Projesi (2019XJYB18) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bizmut (III) klorürŞangay Macklin Biyokimya Co, Ltd7787-60-2
EDTANanjing Kimyasal Reaktif Co, Ltd60-00-4
Enterococcus faecalis ve nbsp; ATCC 19433
Fusobacterium  çekirdek  ATCC 25586
Klebsiella pneumoniae  ATCC 43816
L-sisteinAmresco52-90-4
Proteus  vuigaris  CMCC 49027
Salmonella paratyphi< / em> ACMCC50001
Salmonella paratyphi< / em> BCMCC50094
Staphylococcus ve nbsp; aureus ATCC 25923
Trietanolamin-HClŞanghay Aladdin Biyokimyasal Technology Co., Ltd.637-39-8

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
  2. Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
  3. Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
  4. Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167(2015).
  5. Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
  6. Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
  7. Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908(2015).
  8. Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
  9. Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
  10. Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
  11. Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
  12. Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
  13. Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166(2015).
  14. Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
  15. Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
  16. Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
  17. Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
  18. Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogen Sulfide DetectionH2S Producing BacteriaBismuth Sulfide PrecipitationVisual Detection MethodMicrotiter Plate AssayBacterial Biochemical IdentificationSulfur Amino Acid MetabolismBlack Precipitate FormationHigh Throughput ScreeningBacterial Culture Assay

Related Articles