Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Tanı ve terapötiklerde EV araştırmalarına artan ilgi 1,2,3,4,5, bu alanın karşılaştığı zorluklarla birleştiğinde^, bu veziküllerin ölçülmesi veya karakterize edilmesi için çok çeşitli yaklaşım ve tekniklerin geliştirilmesi ve uygulanmasıyla sonuçlanmıştır. EV tanımlaması için en yaygın kullanılan yöntemler, EV'lerin kökenini doğrulamak için proteine özgü immünoblotlama ve proteomikler, yapılarını doğrulamak için iletim elektron mikroskobu (TEM) ve bir numune hacmindeki sayı ve boyut dağılımlarını ölçmek için nanopartikül izleme analizidir (NTA).

Bununla birlikte, bu tekniklerin hiçbiri kendi başlarına EV alt kümelerini karakterize etmek için gereken tüm bilgileri vermez. EV'lerin biyokimyasal ve fiziksel özelliklerindeki çeşitlilik nedeniyle doğal heterojenliği, özellikle bir karışımda (ham numune) bulunan EV'ler için güvenilir ve tekrarlanabilir küresel analizleri engellemektedir. Bu nedenle, tespit ve karakterizasyon yöntemleri, EV'ler için hem bireysel hem de genel olarak daha hızlı olan ancak seçici olmayan diğer yöntemleri tamamlamak için gereklidir⁶.

TEM (veya kriyoTEM) veya AFM ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme, nanometrik çözünürlük 7,8,9,10,11,12 olan EV'lerin morfolojisinin ve metrolojisinin belirlenmesini sağlar. Bununla birlikte, EV'ler gibi biyolojik nesneler için elektron mikroskobu kullanımının ana sınırlaması, numunenin sabitlenmesini ve dehidrasyonunu gerektiren çalışmayı yürütmek için bir vakuma duyulan ihtiyaçtır. Bu tür bir preparat, gözlemlenen yapılardan çözelti içi EV morfolojisine çevrilmesini zorlaştırır. Numunenin bu dehidrasyonunu önlemek için, kriyoTEM tekniği EV karakterizasyonu için en uygun^{olanıdır 13}. EV'lerin ultrayapısını belirlemek için yaygın olarak kullanılır. Veziküllerin biyofonksiyonelleştirilmiş altın nanopartiküller tarafından immüno-etiketlenmesi, EV'lerin spesifik alt popülasyonlarını tanımlamayı ve bunları karmaşık bir biyolojik numunede bulunan diğer parçacıklardan ayırt etmeyi de mümkün kılar. Bununla birlikte, elektronik mikroskopi ile analiz edilen düşük sayıda EV'den dolayı, karmaşık ve heterojen bir numuneyi temsil eden bir karakterizasyonu gerçekleştirmek genellikle zordur.

Bu boyut heterojenliğini ortaya çıkarmak için, Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği (ISEV), yüksek çözünürlüklü¹⁴ olan bireysel EV'leri ortaya çıkarmak için daha küçük görüntülerle birlikte yeterli sayıda geniş alan görüntüsünün analiz edilmesini önermektedir. AFM, EV'lerin incelenmesi için optik yaklaşımlara ve elektronik kırınım tekniklerine bir alternatiftir. Bu teknik, bir destek üzerinde biriken numuneyi satır satır tarayan ve uç ile bir geri besleme döngüsü aracılığıyla mevcut elemanlar arasındaki mesafeyi ayarlayan esnek bir konsol tarafından tutulan keskin bir uç kullanır. Bu, numunenin topografyasını karakterize etmeyi ve morfomekanik bilgi^{toplamayı mümkün kılar 15,16,17,18}. EV'ler, atomik olarak düz bir substrat üzerinde biriktirildikten sonra veya çeşitli alt popülasyonları karakterize etmek için antikorlar, peptitler veya aptamerler tarafından işlevselleştirilen belirli bir substrat üzerinde yakalandıktan sonra AFM tarafından taranabilir^18,19. Ön arıtma, etiketleme veya dehidrasyona gerek kalmadan karmaşık biyolojik numunelerdeki EV'lerin yapısını, biyomekaniğini ve membranöz biyomoleküler içeriğini ölçme ve eşzamanlı olarak araştırma kabiliyeti nedeniyle, AFM artık EV'leri sıcaklık ve ortamın fizyolojik koşulları altında ince ve multiparametrik bir şekilde karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır.

Bu makale, çoklanmış bir formatta (biyo) kimyasal olarak işlevselleştirilebilen çekirdek bir altın biyoçip kullanan bir metodoloji önermektedir. Bu substrat, EV alt kümelerinin yüzey plazmon rezonansı ile biyo-tespitini birleştiren güçlü bir analitik platformun temel taşıdır ve EV'ler çip üzerinde adsorbe edildiğinde / aşılandığında veya immüno-yakalandığında, AFM, EV'lerin metrolojik ve morfomekanik karakterizasyonunu sağlar. Çip üzerinde yakalanan EV alt kümelerinin Raman imzası ile birleştiğinde, bu analitik platform, biyolojik numunelerde bulunan EV'lerin etiketsiz bir şekilde ve ön analitik adımlara gerek kalmadan kalifikasyonunu sağlar. Bu makale, substrat hazırlama ve veri toplamada son derece titiz bir metodoloji ile desteklenen güçlü tekniklerin kombinasyonunun, EV analizini derin, kesin ve sağlam hale getirdiğini göstermektedir.

Önerilen yaklaşımın prensibi, bir altın substrat hazırlamak, EV alt tiplerini adsorbe / greft veya yakalamak ve her bir EV alt kümesinin boyutunu ve morfolojisini tahmin etmek için bunları AFM ile taramaktır. Ek olarak, bu adsorbe edilen EV'ler Raman spektroskopisi ile analiz edilir. Bu substrat, aslında, artan karmaşıklığa sahip üç tür arayüz sunabilir: çıplak, kimyasal olarak işlevselleştirilmiş veya ligand mikrodizileri. Protokolün farklı adımlarını tanımlamadan önce, okuyucular, yüzey plazmon rezonans görüntüleme (SPRi), AFM ve spektroskopiyi birleştiren Şekil 1'deki nanobiyoanalitik platform (NBA) yaklaşımının şematik sunumuna atıfta bulunulur.

Resim 1: NanoBioAnalytical platformu. Yaklaşım, (A) yüzey plazmon rezonans görüntülemeyi, (B) atomik kuvvet mikroskobu ve kızılötesi / Raman (nano) spektroskopisini birleştirir, hepsi aynı substrat üzerinde çalışır - çoklanmış bir altın çip. Kısaltmalar: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi = yüzey plazmon rezonans görüntüleme; AFM = atomik kuvvet mikroskobu; EV = hücre dışı vezikül. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çekirdek altın biyoçip, platformun kalbini oluşturur, çünkü tüm etiketsiz karakterizasyon teknikleri bu biyoçip üzerinde gerçekleştirilir. EV karakterizasyonunun ihtiyaçlarına (küresel/toplam EV'ler veya EV alt kümeleri) ve kullanılan yöntemlerin sınırlamalarına/taleplerine göre, üç tip altın biyoçip yüzeyi geliştirilmiştir: ya "çıplak", kimyasal olarak işlevselleştirilmiş "C11/C16" ya da "ligand" altın yüzey olarak adlandırılan ligand-biyoişlevselleştirilmiş.

" Çıplak" olarak adlandırılan çıplak biyoçip, EV'lerin altın üzerinde basit adsorpsiyonunu sağlar. Kullanılan tamponu seçmek ve bu adsorpsiyonu pasif bir şekilde (inkübasyon ve daha sonra durulama adımları) veya akış altında (SPRi'de) izlemek mümkündür. Dahası, bu pasif adsorpsiyon ya tüm çip üzerinde (makrodizi olarak) gerçekleştirilebilir ya da bir mikropipet gözcüsü kullanılarak mikrodizilerde lokalize edilebilir. "Akış altındaki prosedür", araştırmacıların kinetiği ve EV adsorpsiyon seviyesini takip etmelerini sağlar. Çıplak altın substrat üzerindeki bu yaklaşım, kimyasal tabaka arayüzü analitik yönteme müdahale edebildiğinde (örneğin, Raman spektroskopisi için) benimsenir.

"C11 / C16" olarak adlandırılan kimyasal olarak işlevselleştirilmiş biyoçip, amaç EV örneğinin küresel bir görünümüne sahip olmak olduğunda, tiyolatlar ile birincil amid bağları oluşturarak altın yüzeyde kovalent olarak bağlanmış EV'lerin yoğun ve sağlam bir "halısı" oluşturmak için kullanılır. Aslında, bu durumda, altın, merkapto-1-undekanol (11-MUOH: "C11") ve merkapto-1-hekzadekanoik asidin (16-MHA: "C16") tiyolat karışımı ile işlevselleştirilir ve tiyolatların bir kısmı, hedeflerle kovalent bağlanma oluşturmak için kimyasal olarak aktive edilir. Yine, bu strateji ya pasif olarak (inkübasyon ve daha sonra durulama adımları, ya "makrodizi" de ya da bir mikropipet gözcüsü kullanarak birden fazla mikrodizide) ya da altın yüzeydeki kinetiği ve EV aşılama seviyesini takip etmek için akış hızlarının altında (SPRi'de) gerçekleştirilebilir.

" Ligandlar" olarak adlandırılan ligand-biyoişlevselleştirilmiş biyoçip , biyolojik numunede bir arada bulunan farklı EV alt kümelerini seçici olarak (afinite ile) yakalamak için farklı ligandları (örneğin, antikorlar, reseptörler) kovalent olarak aşılamak için kimyasal olarak aktive edilir.

1. Altın substrat hazırlama

NOT: Altın yongalar üzerinde üç tip yüzey üretilir: 1) çıplak yüzey, 2) kimyasal olarak işlevselleştirilmiş ve 3) biyoişlevselleştirilmiş (C11C16 tabakasına aşılanmış ligandlar). Bu noktadan itibaren sırasıyla "çıplak", "C11C16" ve "ligandlar" olarak adlandırılacaklar.

1. Altın substrat hazırlığı:
   NOT: Bu protokol için, altın biyoçipler temiz odada şirket içinde üretilmiştir. Ev yapımı biyoçipler, krom (2 nm Cr) ve altın (48 nm Au) kaplamalı cam slaytlardan (SF11) oluşuyordu. Biyoçipin uzunluğu 28 mm, genişliği 12.5 mm ve kalınlığı 0.5 mm²⁰ idi.
   1. Slaytları fiziksel buhar biriktirme (PVD) ile kaplamak için DC magnetron püskürtme^15'i kullanın.
2. Kimyasal işlevsellik:
   1. Çıplak yongaları, mutlak etanolde, ajitasyon altında ve oda sıcaklığında 1 mM'de merkapto-1-undekanol (11-MUOH: C11) ve merkapto-1-hekzadekanoik asit (16-MHA: C16) köstebek karışımı ile% 90 / % 10'luk bir gece boyunca inkübe ederek işlevselleştirin.
      NOT: Bu adım, ligandların aşılanmasında yararlı olan kararlı, kendinden montajlı bir tek katmanlı (SAM) oluşturacaktır.
   2. Biyoçipi mutlak etanol ve ultra saf suyla temizleyin (nazikçe yıkayın), azot altında kurutun ve temiz oda koşullarında saklayın.
   3. Kimyasal olarak işlevselleştirilmiş biyoçipin aktivasyonu:
      NOT: Bu adımdan itibaren, deneyler analitik bir laboratuvarda yapılmalıdır.
      1. Biyoçipi nazikçe yıkayarak ultra saf suyla temizleyin ve ardından çipi nazik hava akımı altında kurutun. C16 karboksilik gruplarını aktive etmek için, biyoçipi oda sıcaklığında karanlıkta en az 30 dakika boyunca 200 mM etil (dimetilaminopropil) karbodiimid / N-hidroksissüksinamid (EDC) ve 50 mmol / L N-hidroksissüksinamid (Sulfo-NHS) karışımında inkübe edin. Daha sonra aşılama deneylerinden önce su ile durulayın.
3. İşlevselleştirilmiş biyoçip üzerindeki ligandların aşılanması:
   NOT: Ligandların (veya bazı deneyler için EV'lerin) çip üzerindeki immobilizasyonu, SPRi cihazının dışında pasif olarak (aktif çip üzerindeki bir damlanın inkübasyonu) veya SPRi cihazına dinamik olarak akış altında yapılabilir. Bu, EV veya ligand modifiye çipleri oluşturur. Şekil 2 , her biri 300 nL'lik 16 ligand damlacığı ile tespit edildikten sonra altın biyoçipi, mikropipet gözcüsünü ve biyoçipi göstermektedir.
   1. Ligand aşılaması için, antikorlar (örneğin, immünoglobulinler-antiCD41 [ N-PEV olarak adlandırılan doğal kan trombositlerinden türetilen EV'lere özgü], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 ve antiOVA [ovalbümine karşı kontrol antikoru]) gibi moleküller kullanın ve Ek V. bunları asidik bir çözelti içinde 200 μg / mL'de seyreltin (ligand aktivitesi veya fonksiyonu için optimal pH'a bağlı olarak pH 4.5'ten 6'ya kadar).
      NOT: Aşılama antikorları için optimum pH, daha önce ligand greftleme için optimal pH'ın belirlenmesi için bir SPR cihazı üzerinde yapılan ön konsantrasyon deneyleri ile belirlenmiştir (bkz. Şekil 3). Kullanılan antikorların klonları ile aşılama koşulları değiştikçe, SPRi deneylerine devam etmeden önce bu koşulların belirlenmesi önerilir.
   2. Greftleme prosedürü için, gözcüyü kullanarak 300 nL EV/ligand çözeltisi ekleyin.
      NOT: Suya batırılmış bir kağıt parçası, damlacıkların buharlaşmasını önlemek için hem sol hem de sağ kuyucuklarda tutulmalıdır. Bu adım, EV'leri / ligandları stabilite ve işlevsellik için optimum koşullarında tutmak için önemlidir.
   3. Tespit ettikten sonra, biyoçipi 30 dakikalık bir inkübasyon için sonik bir banyo (frekans: 37 kHz, güç: % 30) altında tutun. Biyoçipi üstten ultra saf suyla yıkayın ve biyoçiple aynı kırılma indisine (RI) sahip bir prizmaya yavaşça yerleştirin. Prizmanın üstündeki biyoçipi ayarlarken, biyoçip ve prizma arasında tekdüze, ince bir tabaka oluşturmak için prizma ile aynı RI ile bir damlacık (~ 2.3 μL) yağ ekleyin.
      NOT: Bu adım, optik yolda aynı RI'nın sürekli bir ortamını sağlar. Bu adımda yağ tabakasına herhangi bir kabarcık eklemekten kaçınmak önemlidir, çünkü bu, yoldaki optik özellikleri değiştirecek ve daha fazla analizi engelleyecektir.

Resim 2: Biyoçip ve manuel gözcü. Altın biyoçip (solda), mikropipet gözcüsü (ortada) ve her biri 300 nL'lik ligand damlacıkları ile lekelendikten sonra biyoçip (sağda). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ligand aşılaması için en uygun pH'ı belirlemek için ön konsantrasyon testleri. Sensorgram, etkileşim seviyesini, yüzeyde 2 dakika boyunca aynı konsantrasyonda rastgele (farklı pH değerlerinde) enjekte edilen bir ligand için zamanın bir fonksiyonu olarak sunar. OG, her enjeksiyon arasında taban çizgisinin geri kazanılmasını sağlayan deterjandır. Burada, sensorgram, pH 6'nın 1091 RU'luk bir SPRi sinyaliyle en fazla ligand aşılamasına izin verdiğini göstermektedir. Kısaltmalar: OG = oktil glukozit; RU = yanıt birimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Yüzey plazmon rezonans görüntüleme

1. Biyoçipi SPRi sistemine monte edin. PBS arabelleğinin (çalışan arabellek) akış hızını 50 μL/dak'da tutun.
   NOT: Herhangi bir kabarcık varsa, akış hızını 500-1.000 μL / dak'ya kadar artırın ve mümkün olan en kısa sürede çıkarmak için sık sık 40 mM oktil glukozid (OG) enjekte edin.
2. SPRi cihazındaki altın biyoçipin şartlandırılması: Çalışma açılarının seçimi
   1. Yazılımın sol tarafındaki açılır menüye tıklayın ve deneysel verilerin kaydedileceği klasörü tanımlamak için çalışma dizinine tıklayın. Daha sonra, Plasmon | Görüntü alımı.
   2. Farklı noktaların görülebildiği görüntüyü (Şekil 4A'da gösterildiği gibi) bulun ve bu görüntüyü seçmek için tıklatın. İlgi bölgesini (ROI) tanımlamak için, Şekil 4'te gösterildiği gibi, noktaların içindeki otomatik algılamaya veya manuel tanıma (Şekil 4B) veya noktalar olmadan bile belirli bir konuma başvurmak için çip üzerine tıklayın (Şekil 4C),.
   3. Çoklanmış biyoçipler kullanıldığında, ligand ailelerinin adını yazın ve ardından ilgili noktalara tıklayın.
      NOT: Bir ligand ailesi, aynı ligand ile işlevselleştirilmiş birkaç noktaya karşılık gelir. Genellikle, çip her ligandın en azından kopyalarını ve hatta sıklıkla üçlüsünü sunar.
   4. Tür tanımını bitir'e tıklayın ve elde edilen plazmon eğrilerini içeren pencereye yönlendirilmeyi bekleyin.
   5. Bir çalışma açısı seçin. Siyah çizgiyi imleçle optimum çalışma açısına sürükleyin ve Aynayı çalışma açısına taşı'ya tıklayın.
      NOT: Plazmon eğrisi, açıya karşı yansıtıcılığın (%) değerinden oluşur ve yazılım, açıya karşı eğim (%) değeri ile başka bir eğri verir. İyi bir çalışma açısı seçmek için, eğimin en yüksek değerine sahip açıyı seçin.
      1. Aparatın içinde gerçekleştirilen bir pasifleştirici adım (albümin nedeniyle) durumunda, yüzeye karşı optimum hassasiyeti elde etmek için bir çalışma açısı seçin, böylece yüzey reaktivitesinin kalite kontrolünü sağlayın.
         NOT: Bu pasivasyon adımı, çip, numune ile biyoçip yüzeyi arasındaki spesifik olmayan etkileşimleri azaltmak için afinite/yakalama biyoalgılaması için hazırlandığında önemlidir.
3. Gerçek zamanlı kinetik izlemeyi başlatmak için Kinetik'e tıklayın. Yazılım kullanıcıdan negatif kontrolü tanımlamasını istediğinde, bu noktada negatif kontrol seçmeyin (çünkü bu, negatif kontrol noktalarında kinetiğin gözlemlenmesine izin verecektir).
   1. Sıçan serum albüminini (RSA, 200 μg / mL, asetat tamponunda hazırlanmış, pH 4.5) 50 μL / dak'da 4 dakika boyunca lekelerin etrafındaki yüzeyi pasifleştirmek ve muhtemelen ligand lekelerinin içindeki boşlukları doldurmak için enjekte edin.
      NOT: RSA, herhangi bir ligand'a bağlı olmayan biyoçipi örtmek için enjekte edilir.
   2. Yüzeyde hala mevcut ve reaktif olan karboksilik grupları devre dışı bırakmak için 10 dakika boyunca 20 μL / dak'da etanolamin (1 M) enjekte edin.
   3. Biyoçipi 4 dakika boyunca 50 μL/dk'da 40 mM OG enjekte ederek yıkayın.
      NOT: Pasivasyon adımından sonra, çalışma açısı (numune enjeksiyonundan önce yeni bir temel belirleme olarak) ilgili noktalarda en yüksek hassasiyette olacak şekilde ayarlanır.
4. Örnek enjeksiyon:
   1. Pasivasyondan sonra plazmon eğrilerini yeniden tanımlayın ve bu sefer ligandına göre çalışma açısını seçin.
   2. Kinetik izlemede, akış hızını 20 μL / dak'ya düşürün ve taban çizgisinin sabit olmasını bekleyin.
   3. Numuneyi seçilen bir konsantrasyonda enjekte edin (EV'ler ve aşılanmış ligandlar arasındaki afiniteye bağlı olarak 1 x 10 8 EV / mL'den^{1 x 10 10} EV / mL'ye) ve manuel enjeksiyona veya otomatik enjeksiyona tıklayın. Manuel enjeksiyon durumunda, numunenin 200 μL'sini enjekte ettikten sonra, enjeksiyonu durdur'a tıklayın. Enjeksiyonun süresi genellikle 10 dakika olduğundan, etkileşimin kinetiğini takip etmeye başlayın ve kinetik izleme sırasında gözlenen enjeksiyonun başlangıcı ile bitişi arasındaki yansıtıcılık farkını hesaplayarak yansıtıcılık varyasyonunu ölçün (Şekil 5).
      NOT: Enjekte edilen farklı numuneler temsili sonuçlar bölümünde açıklanmıştır.
5. Örnek enjeksiyondan sonra, SPRi deneyini bitirmek için aşağıdaki iki yaklaşımdan birini izleyin:
   1. Sabit olmayan / sıvı içi yaklaşımda, biyoçipi SPRi cihazından çıkarın, üzerine bir sıvı damlası ekleyin ve yüzeyin sıvı içinde daha fazla AFM karakterizasyonu için devam edin.
   2. Sabit yaklaşımda, biyoçip üzerinde yakalanan molekülleri sabitlemek için 10 dakika boyunca 20 μL / dak'da suda seyreltilmiş glutaraldehit (% 0.5) enjekte edin. Yüzeyi durulamak için su enjekte edin, biyoçipi çıkarın, damıtılmış suyla çok nazikçe yıkayın ve AFM altında daha fazla analiz edilmek üzere havayla kurutun.

Resim 4: Biyoçipin SPRi CCD görüntüsü. (A,B) Albümin pasivasyonundan sonra çoklanmış biyoçip. (A) Varsayılan değeri olmayan bir çip; (B) çip üzerinde ortaya çıkan bazı kusurlar: lekelerin füzyonu (i), zayıf aşılama (ii) veya toz veya "kirleticiler" (iii). Lekelerdeki renkli ROI'ler (ligand ailesi başına bir renk), bu "kirleticileri" önlemek için seçildi. Lekeler birleştiğinde, not edildi ve ya göz ardı edildi ya da "ligand 1 ve 2'nin karışımı" olarak adlandırıldı. (C) EV'lerin altın üzerindeki adsorpsiyonunu inceleyen deney için mikrodizileri olmayan çıplak altın çip. Mavi ok akış yönünü gösterir. Bu çip lekeler sunmadı ve ROI'ler, örnek enjeksiyonu sırasında satır 1'den (L1, kırmızı daireler) satır 4'e (L4, mor daireler) yansıtıcılık sinyalini kaydetmek için seçildi. Ölçek çubuğu = üç görüntü için de 1 mm. Kısaltmalar: SPRi = yüzey plazmon rezonans görüntüleme; CCD = şarj bağlantılı cihaz; ROI'ler = ilgilenilen bölgeler; EV'ler = hücre dışı veziküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Bir biyoçip üzerine EV enjeksiyonunun SPRi deneyleri . (A) Farklı ligandların yansıtıcılık sinyallerini gösteren çoklanmış bir biyoçip üzerinde yakalama deneyi. Burada, farklı ligandlar için sinyal-gürültü oranı çok iyiydi (ve özellikle antiCD41 noktalarında), negatif kontrolün cevabı ihmal edilebilir düzeydeydi. (B) Çıplak bir biyoçip üzerinde EV'lerin adsorpsiyon deneyi. Çipin koşullandırılmasını iki tampon yıkama ve OG temizleme (1), EV numune enjeksiyonu (2) ve EV etkileşiminden sonra yansıtıcılık sinyali (3) ile sunar. Bu biyoçipte negatif bir kontrol yoktu, ancak yansıtıcılık sinyali (kinetiği, enjeksiyondan sonraki stabilitesi) yüksekti, bu da bu EV'lerin altın çip üzerinde adsorbe edilebildiği ve sabit kalabildiği anlamına geliyordu. Kısaltmalar: EV = hücre dışı vezikül; OG = oktil glukozit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Atomik kuvvet mikroskobu

1. Biyoçipi havada taramak için temas modunu ve biyoçipi sıvı koşullarda taramak için kantitatif görüntüleme modunu kullanın.
2. İlgili mikrospotların biyoçip üzerindeki konumunu belirlemek için maskenin üstündeki biyoçipi cam slayt üzerinde (laboratuvarda geliştirilen) hizalayın (Şekil 6A).
   NOT: Maske, kullanılan gözcüye göre ligandların lekelerinin konumlarına karşılık gelen lekelerin işaretlerini içerir. Bu maske, üzerine iki dik kamaların çipin yerleştirilmesini sağladığı bir cam slayttan oluşur. Ayrıca, cam slayt, çip üzerindeki nokta lokalizasyonuna karşılık gelen 16 keçe noktası ile işaretlenmiştir, bu da şeffaflık yoluyla, lekelerin yerini belirlemeye ve istenen alanı taramaya izin verir.
3. Ucun konumlandırılması:
   1. Konsolları taranması gereken doğru noktaya yerleştirmek için AFM'nin üstünde bir CCD kamera kullanın. Bu protokolü takip etmek için, 200 μm uzunluğunda, 28 μm genişliğinde ve 0,08 N / m'lik bir yay sabitine sahip üçgen konsollar kullanın.
4. Lazeri, konsol üst kısmında, geri besleme kontrol mekanizmasında optimum tepki verecek bir konumda hizalayın.
5. Tarama:
   1. Biyoçip yüzeyi ile etkileşime girdikten ve temas ettikten sonra, AFM alımını temas modunda veya kantitatif görüntüleme modunda üç ila beş büyük alandan (tipik olarak 10 × 10 μm²) küçük alanlara (1 x 1 μm²) kadar başlatın.
      NOT: Taranabilecek farklı alanların bir temsili Şekil 6B'de gösterilmiştir. AFM karakterizasyonunun tüm mm² noktasını temsil ettiğinden ve sağlam bir analiz için yeterli EV'nin iyi bir çözünürlükte görselleştirildiğinden emin olun (her koşul için en az 300 EV, sayılır ve analiz edilir) ve metroloji ve morfoloji ölçümlerini gerçekleştirin.
6. AFM görüntü tedavisi:
   1. Önce yükseklik kanalını seçerek AFM görüntülerini JPK veri işleme yazılımıyla işleyin.
   2. Düzleştirilmiş tarama çizgileri elde etmek için her çizgiden çıkarılacak bir polinom uyumu seçin.
   3. Yüzeyin pürüzlülüğünü ortadan kaldırmak için altın taneleri üzerindeki yükseklik eşiğini seçin. Başvurulan yazılımda ( Malzeme Tablosuna bakınız), tane ekstraksiyon modülünde, 8,5 nm'de bir yükseklik eşik değeri kullanarak taneleri işaretleyin. Taneler filtrelendikten sonra, tane sayısı görünür.
      NOT: Genellikle, kaba altın substrat (RMS'nin ~3 nm) ve kimyasal ve ligand katmanlarının varlığı, eşiğin 8,5 nm olarak ayarlanmasını gerektirir.
   4. İşaretli taneciklerin yükseklik, hacim ve çap gibi çeşitli özelliklerini ayıklamak için görüntüyü başvurulan yazılımda açın ve veri işlemeyi seçin | Tahıllar | Eşiğe göre işaretleyin.
   5. Özellikler işlevinde filtre taneciklerini seçin. Yeni bir pencere göründüğünde, aşağıdaki parametreleri seçin: Değer = maksimum z-max, Yüzey = yansıtılan yüzey A_0. Ardından, A VE B ölçütlerini seçin.
   6. Açık tahıl dağılımı; görüntülenen pencerede, değer (maksimum), hacim (taban: sıfır) ve sınır (uzunluk) seçeneklerini belirleyin. Görüntü başına ayarlanan eşikte algılanan tüm tanecikler için yükseklik, hacim ve çap değerlerine sahip üç sütun sunan görüntülenen tabloyu (.txt biçimde) gözlemleyin.
   7. Yükseklik, h ve çap, D'den, denklem (1)^8'i kullanarak her EV'nin eğrilik yarıçapını, Rc'yi hesaplayın ve ardından denklem (2) kullanarak hacim, V'yi hesaplayın:
      (1)
      (2)
   8. V'den, denklemi (3) kullanarak her EV'nin (aynı hacme sahip bir kürenin çapı) etkin çapını, d _eff'yi hesaplayın:
      (3)
   9. EV'lerin boyutlarını (ölçülen yükseklik, ölçülen çap ve hesaplanan etkili çap) gösteren grafikler çizin, her parçacık bir nokta ile temsil edilir.
      NOT: Böylece, karakterizasyonun sonunda, NBA platformu, biyoalgılama sinyalinin ve ardından fenotiplemenin, EV alt kümelerinin sayıları ve boyutları ile korelasyonunu sağlar.

Şekil 6: AFM ile biyoçip karakterizasyonu. SPRi deneyinden sonra, çip AFM karakterizasyonu için ya sabitlendi ve kurutuldu ya da sıvı içinde tutuldu. (A) İşlenmiş cam slayt (resimde "w" ile gösterilen iki dikey konumlandırma kama ile), 16 biyoçip mikrodizisinin lokalizasyonuna uyan bir maske sunar. Işık pozlaması ve saydamlık ile, AFM karakterizasyonu için monte edildikten sonra, cam slayt, AFM ucunun karakterize edilmesi için istenen noktaya yerleştirilmesini sağlar. (B) Sıvı koşullarda taramak için "maske" sürgüsüne ve bir damla tamponun altına monte edilen biyoçip. (C) 16 mikrodizinin SPRi görüntüsü. (D) 920 nm çapında biyofonksiyonel kalibrasyon nanopartiküllerinin immüno-yakalanmasından sonra optik mikroskopi ile görüntülenen bir mikrodizi. Beyaz kareler, AFM karakterizasyonunu sağlam hale getirmek için ilgilenilen her noktada AFM tarafından taranan farklı alanların örneklenmesini gösterir. Ölçek çubukları = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; SPRi = yüzey plazmon rezonans görüntüleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Raman spektroskopisi

NOT: Raman spektroskopisi için, substrat olarak kullanılan cam slaytı, ihmal edilebilir Raman imzasına sahip bir CaF₂ slaytı ile değiştirin.

1. Satın alma için optik koşullar:
   1. Raman görüntüleme mikroskobu için aşağıdaki koşulları ayarlayın: mikroskop hedefi: 50x; lazer dalga boyu: 532 nm; lazer gücü: 10 mW; maruz kalma süresi: 500 ms; birikim sayısı: 140; spektral aralık: 450 cm⁻¹ila 3.200 ^cm-1.
      NOT: Çok fazla güç ve/veya çok uzun bir elde etme süresi kullanmak, numunenin zarar görmesine neden olabilir ve bu da zaman içinde kararsız spektrumlarla kanıtlanır. Düşük miktarda enerji ile başlayın ve sinyal çok zayıfsa bunu artırın. Raman ölçümlerine zarar veren floresanı azaltmak için daha yüksek lazer dalga boyları (633 nm, 785 nm) kullanılabilir. Bununla birlikte, dalga boyunun dördüncü gücü ile yoğunluk azalır ve kameranın spektral hassasiyeti dikkate alınmalıdır.
2. Raman görüntüleme:
   1. İlk olarak, en iyi sinyal-gürültü oranına sahip alanı bulmak için canlı spektrumları azaltılmış sayıda birikimle (10) gözlemleyin.
      NOT: Yüksek frekanslı bölgedeki (2.800-3.000 cm⁻¹) güçlü bir sinyal, daha önce gösterildiği gibi düşük pozlama süreleriyle yüzeydeki EV'lerin algılanmasını kolaylaştırabilir¹⁰.
   2. Yatırım getirisi seçildikten sonra, satın alma için uygun süreye göre uzamsal çözünürlüğü seçin.
      NOT: Uzamsal çözünürlük kırınım sınırı (~500 nm) ile sınırlıdır.
   3. Raman eşleme alımını başlatın.
3. Veri ön işleme:
   1. Python entegre geliştirme ortamı (IDE) kullanarak (örneğin, Spyder), spektrumları içeren dosyayı açın.
   2. Olası floresandan paraziti düzeltmek için spektrumun taban çizgisini çıkarın. Örneğin, "irfpy"²³ paketindeki "arpls" işlevini kullanın. En iyi taban çizgisi düzeltmesini veren parametreyi bulmak için "lam" parametresinin farklı değerlerini test edin (genellikle 10³ ile 10⁷ arasında).
   3. Örneğin, bir spektrumun tüm yoğunluklarını 2.900 cm^−1'deki yoğunluğuna bölerek veya spektrumun ortalamasını çıkarıp standart sapmasına bölerek ("standart normal varyasyon" normalizasyonu") spektrumu normalleştirin.
      NOT: Bu adım, EV'lerin göreceli moleküler bileşimini karşılaştırmak için gereklidir.

Ligand greftleme için optimum pH koşullarının belirlenmesi
Biyoçipleri hazırlamak için kullanılan farklı ligandlar, pH'ın bir fonksiyonu ve tiyolat kimyasal tabakası ile etkileşime girme mevcudiyeti olarak test edilir (Şekil 3). Ligandlar, farklı pH değerlerinde asetat tamponunda seyreltilir ve bir C11C16 tabakası ile kimyasal olarak işlevselleştirilmiş biyoçip üzerine enjekte edilir. Çözeltiler yüzeye rastgele enjekte edilir ve taban çizgisini geri kazanmak için her ligand enjeksiyonundan sonra bir deterjan (40 mM'de OG) enjekte edilir. Bu ön konsantrasyon testi, her ligand aşılaması için optimum pH'ın belirlenmesini sağlar. Şekil 3'te sunulan örnekte, eğim ve ligand aşılama seviyesi açısından en iyi pH olarak 6 pH seçilmiştir.

SPRi CCD görüntüleri
SPRi makinesine yerleştirildikten sonra biyoçip üzerinde kayıtlı SPRi CCD görüntüleri (çıplak, kimyasal olarak işlevselleştirilmiş veya mikrodiziler sunan) Şekil 4'te sunulmuştur. Mikroarray sunan biyoçip durumunda, görüntü yüzeyin albümin pasivasyonundan sonra alınmıştır. Noktaların kopyaları veya üçlüleri çip üzerinde sistematik olarak gerçekleştirildi ve çip üzerinde otomatik olarak negatif bir kontrol de mevcuttu. Negatif kontrol esas olarak alakasız bir antikordan oluşuyordu. SPRi'de, biyoçip lekelenmeden kullanıldığında - çıplak altın üzerinde adsorpsiyon için veya EV'leri kimyasal olarak işlevselleştirilmiş bir biyoçip üzerinde doğrudan aşılamak için - ROI'ler algılama alanında keyfi olarak seçildi. Örnek olarak, Şekil 4C, EV'lerin enjeksiyonundan önce çıplak bir altın çip üzerinde seçilen yatırım getirilerini göstermektedir.

Bu SPRi CCD görüntüsü sayesinde, aşılama sırasında bu tür problemler ortaya çıkarsa belirli noktaları görmezden gelmek mümkündür. SPRi CCD görüntüsü ayrıca noktanın içindeki aşılamanın homojenliğinin tahmin edilmesine izin verir, aynı ligandın farklı noktaları arasındaki aşılamanın tekrarlanabilirliğini sağlar ve son olarak, EV biyo-algılamasının yüzey yoğunluğu açısından eşdeğer diziler üzerinde ilerlemesini sağlar.

SPRi sonuçları
Yatırım getirileri seçildiğinde, taban çizgisi sabittir, yani numune enjekte edilebilir. Şekil 5 , çoklanmış bir biyoçip üzerinde elde edilen farklı sonuçları göstermektedir ve bazı immünodiziler için yüksek bir sinyal-gürültü oranı ortaya koymaktadır (yansıtıcılık sinyali% 0.02'lik negatif kontroldeki yanıta kıyasla, antiCD41'de% 1.4'tür). Şekil 5B , EV numunesinin çıplak altın bir çip üzerine enjekte edilmesinden sonra elde edilen EV adsorpsiyonu için sonuçları sunmaktadır. N-PEV örneği trombositlerden alınmıştır. Çözelti, 22 ° C'de 15 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüj edildi; süpernatant daha sonra 22 ° C'de 15 dakika boyunca 20.000 × g'de tekrar santrifüj edildi. Elde edilen pelet tamponda yeniden askıya alındı. İmmün olarak yakalanan N-PEV'lerde elde edilen SPRi sonuçları, batı lekesi (WB) sonuçları ile karşılaştırıldı. Dünya Bankası, bu örneklerde CD41, CD62P ve CD9'un güçlü bir ekspresyonunu ortaya koyarak, SPRi sonuçlarıyla iyi bir korelasyon olduğunu vurguladı (Ek Şekil S1).

Şekil 5B , EV örneğinin insan birincil meme epitel hücrelerinden (HMEC'ler) çıplak bir altın çip üzerine enjekte edilmesinden sonra elde edilen EV adsorpsiyonu sonuçlarını sunmaktadır. HMEC hücre kültürü 10 dakika boyunca 3.650 × g'de santrifüj edildi ve daha sonra süpernatant 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 × g'de tekrar santrifüj edildi. Elde edilen pelet yıkamak için 1x PBS tamponunda yeniden askıya alındı ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 × g'da tekrar santrifüjleme yapıldı. Son olarak, pelet 1x PBS tamponunda askıya alındı.

AFM karakterizasyonu
SPRi deneylerinden ve biyoçiplere EV yüklendikten sonra (adsorpsiyon, aşılama veya afinite yakalama yoluyla), AFM, büyük taramaları (10 x 10 μm²) ve daha sonra (~ 10 en az) daha küçük olanları (birkaç μm²) taramak için metodoloji izlenerek gerçekleştirildi. Şekil 7 , biyoçipler üzerindeki EV'lerin büyük ölçekli ve küçük ölçekli AFM görüntülerine örnekler göstermektedir.

Şekil 7: Bir biyoçip üzerindeki EV'lerin AFM karakterizasyonu. Kurutulmuş bir numunenin temas modunda elde edilen görüntüler. (A) Çip üzerindeki mm² yatırım getirisinin temsili bir görünümünü vermek için geniş bir tarama alanına bir örnek. Bu sonuç, EV'lerin kimyasal olarak modifiye edilmiş bir yüzeye kovalent greftlenmesinden sonra elde edildi. (B) İmmün diziler üzerinde EV'lerin yakalanmasından sonra elde edilen geniş bir tarama alanının bir başka örneği. (C) Yüksek çözünürlük elde etmek ve EV'lerin metrolojisini (yükseklik ve çap olarak) etkinleştirmek için nesnelerin daha yakından görünümü. (D) 3D eğimli görüntü ile (A)'daki görüntüdeki biyoçipin daha yakından görünümü. (E) Eğik bir 3D görüntüde çıplak altın bir biyoçip üzerinde adsorbe edilmiş büyük bir EV'nin yakınlaştırılmış görünümü. Z ölçeği (A, B) 30 nm ve (C) 20 nm'dir. Ölçek çubukları = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Kısaltmalar: AFM = Atomik Kuvvet Mikroskobu; EV'ler = hücre dışı veziküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Gwyddion analizi
Gwyddion yazılımı, AFM görüntülerinin her partisinde görselleştirilen her vezikülün verilerini işlemek için kullanıldı. İlk olarak, çip üzerindeki mm² ROI'nin temsili bir görünümünü gösteren geniş bir alan (10 x 10 μm² aralığında) tarandı. Şekil 7A'daki görüntü, yüzeyin yoğun bir şekilde nesnelerle kaplı olduğunu göstermektedir. Bu durumda, EV'ler (sığır sütünden) aktif bir tiol işlevselleştirilmiş çip üzerine 2.5 × 1010 / mL'de enjekte edildi. Kazeini numuneden çıkardıktan sonra, peynir altı suyu süpernatantları, Amicon 100 kDa santrifüj filtre üniteleri kullanılarak 4.000 × g ve 20 °C'de santrifüjleme ile konsantre edildi ve EV'ler sakkaroz gradyanı ultrasantrifüjleme yaklaşımı kullanılarak izole edildi. Bu sonuç, kimyasal olarak modifiye edilmiş bir yüzeyde kovalent olarak aşılanmış EV'lere karşılık gelir. Şekil 7B, immünodiziler üzerinde EV'lerin yakalanmasından sonra elde edilen geniş bir tarama alanının başka bir örneğini göstermektedir. Burada da, yüzeyde nesneler mevcuttu, ancak EV'lerin çip üzerine kovalent olarak aşılanmasından daha az yoğun bir kapsama alanı gösterdi. Şekil 7C'de, ROI'nin çeşitli yerlerinde daha yakından bakıldığında, EV'lerin yüksek çözünürlüğü ve metrolojisi (yükseklik ve çap olarak) mümkün olmaktadır. Şekil 7A'da gösterilen biyoçipin bir başka daha yakın görünümü (Şekil 7D), 3D eğimli bir görüntüyle, vezikül olan ancak aynı zamanda filamentli (sol üstte) nesneleri ortaya çıkarmaktadır. Gerçekten de, immünoçipler EV alt kümelerinin seçici ve diferansiyel yakalanmasını sağlarken, kovalent greftleme, numunede bulunan serbest amin gruplarına sahip tüm nesneleri greftler. Şekil 7E'de AFM, çıplak altın üzerine adsorbe edilmiş HMEC kültüründen tek bir büyük EV'yi ortaya koymaktadır. Böylece, AFM küçükten büyüğe EV'leri ortaya çıkarabilir ve ölçebilir ve her EV'nin görselleştirilmesine izin vererek mm² başına nesne sayısını saymaya yardımcı olur.

Her EV'nin ölçülen yüksekliği ve çapı, etkili çapın elde edildiği belirlendi. EV yükseklikleri, ortalama 15 nm ile 10 nm ila 50 nm arasında bir aralığı kapsıyordu; ölçülen EV çapları, ortalama 100 nm ile 50 nm ila 300 nm arasında bir aralığı kapsıyordu. EV'lerin etkili çapının 30 nm ila 300 nm arasında değiştiğini, büyük çoğunluğunun 60 nm civarında olduğunu gözlemledik (Şekil 8A). Bu ölçümler sıvı olarak veya fiksasyon ve kurutmadan sonra gerçekleştirildi. Şekil 8B , bu iki koşulda elde edilen sonuçların karşılaştırılabilir olduğunu ortaya koymaktadır.

Şekil 8: Bir biyoçip üzerinde EV'lerin AFM karakterizasyonu ile üretilen sonuçlar. (A) EV'lerin bir noktadaki metrolojisi (antiCD41 immünodizi), 8.5 nm eşik ile ve bir EV örneğinin 2.5 × 1010 / mL'de enjeksiyonundan sonra belirlenir. "Etkili hesaplanmış çap" sunulur ve her nokta AFM görüntülerinde görselleştirilen bir parçacığa karşılık gelir. (B) EV'lerin etkin çapının dağılımını gösteren (A) içindeki verilerden oluşturulan histogram. Elde edilen sonuçlar havada (kırmızı: sabit ve kurutulmuş numune) ve sıvı olarak (mavi: sabit olmayan) elde edilir. Kısaltmalar: AFM = atomik kuvvet mikroskobu; EV'ler = hücre dışı veziküller . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

AFM ile yapılan N-PEV analizi NTA sonuçları ile karşılaştırıldı. NTA tarafından elde edilen bu son "çözüm içi" sonuçlar, EV çaplarının 32 nm ila 650 nm arasında bir dağılımını gösterdi ve büyük çoğunluğu 90 nm ile 250 nm arasında bir çapa sahipti. Bu nedenle, NTA'nın küçük boyutlar için (50 nm'ye yakın) duyarlı olmadığı göz önüne alındığında, bu AFM ölçümleri bu sonuçlarla iyi bir korelasyon göstermektedir (Ek Şekil S2).

Çıplak bir çip üzerinde adsorbe edilen EV'ler üzerinde gerçekleştirilen Raman deneyleri, cesaret verici sonuçlar ortaya koydu; spesifik olarak, EV'lerin net bir spektrumu elde edildi (Şekil 9). Raman spektrumları üç farklı aralığa ayrılabilir: moleküle özgü desenler oluşturan zirveleri içeren ve bu nedenle tanımlama amacıyla en önemli kısım olan "parmak izi" bölgesi (1.800 cm−1'in altında); zirve içermediği için biyolojik örnekleri incelerken genellikle atılan "biyo-sessiz" bölge (1.800-2.800 cm−1); ve esas olarak lipitler hakkında bilgi içeren ve genellikle spektrumun en yoğun kısmı olan ancak daha az spesifik olan "yüksek frekanslar" bölgesi. Spektrum, esas olarak CH2 titreşimlerine (2.853 cm-1, 1.444 cm-1 ve 130 cm-1) karşılık gelen zirveleri gösterir ve bunlar EV zarının lipitleri ve fenilalanin amino asidi21'e karşılık gelen bir tepe noktası ile ilişkilidir. EV'lerde bulunan ortak moleküllerin bir Raman tepe atama tablosu, Penders ve ark.22 tarafından makalede bulunabilir.

Şekil 9: Bir biyoçip üzerindeki EV'lerin Raman spektroskopisi karakterizasyonu. Burada, EV örneği bir HMECkültüründen türetildi ve 20.000 × g'da santrifüjleme ile geri kazanıldı. (A) Çıplak bir biyoçip (ortalama yoğunluk) üzerine adsorbe edilen EV'lerin Raman görüntüsünün bir örneği, parlak bir alan görüntüsü üzerine bindirilmiştir. (B) EV'lerin ölçülen Raman spektrumlarına örnek. Noktalı çizgiler tanımlanan titreşimlere karşılık gelir. α, makaslama; τ, büküm; υ, germe (s, simetrik; as, asimetrik). Ölçek çubuğu = (A) 50 μm. Kısaltmalar: EV'ler = hücre dışı veziküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: N-PEV'lerin nanopartikül izleme analizi (NTA) ölçümleri. EV'ler PBS'de seyreltildi; deneyler bir MALVERN cihazı NS300 kullanılarak üçlü olarak yapıldı. Ortalama çap = 137,5 nm ± 1,3 nm; mod çapı = 104,9 nm ± 13,3 nm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: N-PEV'lerin Batı leke tahlilleri. N-PEV'ler (1) ve (2), iki trombosit konsantresi cebinden hazırlanan iki N-PEV partisine karşılık gelir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.