Yöntem makalesi

Fare Adipozundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerden Yaşlı Fare Oositlerine Mitokondriyal Transfer

DOI:

10.3791/64217

⸱

6 Ocak 2023

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fare adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden mitokondri izolasyonunu açıklıyoruz ve daha sonra oositlerin kalitesini artırmak için mitokondriyi yaşlı fare oositlerine aktarıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşa bağlı olarak oositlerin miktar ve kalitesindeki düşüş nedeniyle, 35 yaşın üzerindeki kadınların doğurganlığı keskin bir şekilde azalmıştır. Oosit kalitesini koruyan moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır, bu nedenle şu anda 35 yaşın üzerindeki kadınların doğum oranını artırmak zordur. Oositler, vücuttaki herhangi bir hücre tipinden daha fazla mitokondri içerir ve herhangi bir mitokondriyal disfonksiyon, oosit kalitesinin düşmesine neden olabilir. 1990'larda, oosit sitoplazmik transferi insan üremesinde büyük başarı ile sonuçlandı, ancak etik tartışmalar eşlik etti. Otolog mitokondriyal transplantasyonun yaşa bağlı olarak azalan oositlerin kalitesini artırmak için yararlı bir teknik olması beklenmektedir. Bu çalışmada, yaşlı farelerin oositlerinin kalitesini artırmak için yaşlı farelerden elde edilen adipoz kaynaklı kök hücreleri mitokondri donörü olarak kullandık. Otolog mitokondriyal transfer teknolojisinin daha da geliştirilmesi, yaşlı kadınlarda kısırlık için yeni ve etkili bir tedavi sağlayacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kadın doğurganlığını etkileyen önemli faktörlerden biri oosit yaşlanmasıdır; Oosit kalitesindeki azalma yaşlı kadınlarda infertilitenin ana nedenidir. Bununla birlikte, oosit yaşlanmasının ana nedeni ve oosit kalitesini düzenleyen moleküler mekanizma hala belirsizdir. Önceki çalışmalar, mitokondri sayısının ve kalitesinin oositlerin kalite kontrolünde ve embriyonik gelişimde rol oynadığını göstermiştir 1,2,3. Mitokondri miktarının ve kalitesinin azalması yaşlanma ile yakından ilişkilidir3.

Mitokondri besin takviyesi ve mitokondri transferi de dahil olmak üzere yaşlı oositlerde mitokondrinin işlevini iyileştirmek için birçok girişimde bulunulmuştur. Mitokondrinin iyi bilinen, etkili besin takviyeleri arasında Koenzim Q10 (CoQ10), Alfa-lipoik asit (α-LA) ve resveratrol (RSV)4 bulunur. Çalışmalar, CoQ10 takviyesinin sadece oositlerin miktarı ve kalitesindeki yaşa bağlı düşüşü iyileştirmekle kalmayıp, aynı zamanda oositlerin normal gelişimini ve yumurtlamasını da desteklediğini göstermiştir5. α-LA, polikistik over sendromlu (PKOS) hastaların yaşlanmasına ve metabolik fenotipine bağlı oosit kalitesi düşüşünü yavaşlatır6,7. Resveratrol, yaşlanan farelerde anormal iğciklere ve yanlış kromozom hizalamasına sahip oosit sayısını azaltabilirken, embriyonik gelişimi doza bağlı bir şekilde etkileyebilir8. Bununla birlikte, mitokondri besin takviyelerinin klinik etkisi beklenen seviyelere ulaşmadığından, diğer etkili tedavilerin araştırılması gerekmektedir.

İlk mitokondri transferi girişimi 1997 yılında gerçekleştirilmiştir. Genç donör oosit sitoplazmasının yaşlı alıcı oositlere transferi, sağlıklı bebekleri başarılı bir şekilde doğuran yaşlı hastaların oosit kalitesini iyileştirmiştir9, bu tekniğin kullanılmasının arkasındaki mantık budur. Bununla birlikte, allojenik oosit sitoplazmik transferi, genetik heterojenlik sorunu ve donör mitokondri transplantasyonunun neden olduğu düzenleyici sorunlar olmak üzere iki ana nedenden dolayı klinik uygulamaya uygulanamaz. Daha önce yapılan bir çalışma, otolog hücreli mitokondriyal transplantasyonun, etik sorunları veya genetik heterojenlik sorunları olmayan yaşlı farelerin10 oosit kalitesini, embriyo gelişimini ve doğurganlığını iyileştirebileceğini ve donör oosit sitoplazmasının alıcı oositlere transferinden kaynaklanan bazı sorunları çözdüğünü göstermiştir10,11.

Bu arada, otolog hücre mitokondriyal transferi, mitokondrinin önceki besin takviyelerinin oositlerin kalitesini iyileştirme üzerindeki etkisinden daha üstündü11. Bu nedenle, otolog hücreli mitokondriyal transplantasyon, bu teknolojinin klinik uygulaması için uygun seçimdir12. Adipoz kaynaklı kök hücreler (ADSC'ler) minimal invaziv teknoloji ile elde edilebilir, izole edilmesi ve kültürlenmesi kolaydır ve rejeneratif tıp için ideal bir "tohum" hücresi olabilir. Mitokondri ADSC'ler açısından zengindir ve mitokondrinin işlevi yaşla birlikte azalmaz, bu da ADSC'lerin mükemmel bir mitokondri kaynağı olduğunu düşündürür13,14. Bu protokolde, oosit kalitesini artırmak için fare adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin mitokondrisini yaşlı fare oositlerine aktarmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu, insan ADSC otolog mitokondriyal transfer teknolojisi için yararlı bir modeldir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Soochow Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi'nin Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylandı. Tüm operasyonlar uygun hayvan bakımı ve kullanımı ajansı ve ulusal yönergeleri takip eder. Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin, aletlerin ve reaktiflerin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Yaşlı fare adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ADSC'ler) izolasyonu ve karakterizasyonu

  1. Yaşlı fareleri (10 aylık, ortalama üç) pentobarbital sodyum anestezisi altında servikal çıkık ile sakride edin ve yağ dokusu izolasyonundan önce 5 dakika boyunca% 75 alkole batırın.
    NOT: 5 dakika boyunca %75 alkole batırmak, birincil hücrelerin kontaminasyonunu etkili bir şekilde azaltabilir.
  2. Bilateral kaşek kemiğinde deride 2 cm'lik bir kesi yapın, deri altı yağını açığa çıkarın ve deri altı yağını izole etmek için cımbız kullanın. Sterilize edilmiş oftalmik makas kullanarak farelerden bilateral kasık yağını toplayın (deri altı dokusunu kesmekten kaçının). Yağ dokusunu buz üzerinde 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve hemen hücre kültürü laboratuvarına taşıyın.
  3. Yağ dokusunu 6 oyuklu bir plakaya aktarın, 100 U / mL penisilin ve streptomisin içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez durulayın. Yağ dokusunun altındaki kan damarlarını, yağ fasyasını ve bağ dokusunu çıkarın ve ~ 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm'lik parçalar halinde kesin.
    NOT: Adipoz kök hücreleri izole ederken, genellikle vasküler endotel hücrelerinde kontaminasyon olur. Kan damarlarının yağ dokusundan çıkarılması vasküler endotel hücre kontaminasyonunu azaltabilir.
  4. Parçalanmış yağ dokusunu aynı hacimde kollajenaz tip I çözeltisine (% 0.1 nihai kollajenaz tip I konsantrasyonu) aktarın ve 37 ° C'de 30 dakika sindirin.
  5. Kollajenaz tip I'i nötralize etmek için eşit hacimde tam kültür ortamı (% 10 fetal sığır serumu içeren DMEM F-12 ortamı) ekleyin, 10 dakika boyunca 600 × g'da santrifüjleyin ve süpernatan ve yağ dokusunu atın.
  6. Hücre peletini tam kültür ortamında yeniden süspanse edin. Sindirilmemiş dokuyu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzülerek çıkarın ve ardından 600 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  7. Hücre süspansiyonunu 5 mL tam kültür ortamı ile yeniden süspanse edin ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetlemek için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Herhangi bir agrega olmadan sadece tek hücreler olduğunu doğrulamak için bir hemositometre üzerine bir alikot yerleştirerek hücre süspansiyonunu mikroskop altında kontrol edin. Tek hücreli süspansiyonu 25cm2'lik bir hücre kültürü şişesine ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin.
  8. Kültür ortamını 48 saat sonra değiştirin. Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirmeye devam edin.
  9. 7-10 gün sonra, birleşmeleri% 80 -% 90'a ulaştığında hücre geçişi için hücreleri ayırın. Tüm kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 2 mL PBS ile yıkayın. Ardından, hücre ayrışmasını gerçekleştirmek için 2 mL% 0.05 tripsin / EDTA ekleyin15,16.
  10. ADSC'lerin adipoktilere farklılaşmasını indüklemek için 14 gün boyunca adipojenik indüksiyon ortamı ekleyin. Osteoblastlara farklılaşmalarını indüklemek için% 2 jelatin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine kaplanmış ADSC'lere 28 gün boyunca osteojenik indüksiyon ortamı ekleyin. Nöral farklılaşma için, ADSC'leri nöral indüksiyon ortamı ile kültürleyin, ardından immünofloresan15 kullanarak nörona özgü enolaz ve nörofilament aracı polipeptidi tespit edin.
    1. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından 15 dakika boyunca PBS'de% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenleştirme yapın.
    2. PBS'de% 3 BSA ile bloke ettikten sonra, hücreleri gece boyunca 4 ° C'de bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş birincil antikorlarla (Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
    3. Hücreleri ikincil antikorlarla 45 dakika inkübe edin ve ardından 10 dakika boyunca DAPI ile boyayın. Ardından, hücreleri bir floresan mikroskobu ile inceleyin.
  11. % 0.05 tripsin / EDTA kullanarak tek hücreli ADSC süspansiyonunu toplayın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüjleyin ve hücre yoğunluğunu 1 × 106 / mL'ye ayarlamak için PBS'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (100 μL / tüp) ayırın ve 0.5 μg / mL'lik bir antikor konsantrasyonu ile FITC etiketli tavşan anti-fare CD29, CD90, CD34 ve HLA-DR monoklonal antikorları ekleyin. Kontrol grubuna aynı hacimde tavşan IgG FITC uygulayın, 30 dakika buz üzerinde inkübe edin ve konjuge olmayan antikoru çıkarmak için PBS ile durulayın. Akış sitometrisi13 ile ADSC yüzey belirteçlerini tespit edin.

2. Mitokondrinin adipoz kök hücrelerden izolasyonu

NOT: Tüm mitokondri izolasyon işlemleri buz üzerinde yapılmalıdır.

  1. ADSC'ler %90 yoğunluğa ulaştığında, hücreleri 2 mL %0.05 tripsin / EDTA ile sindirin, 600 × g'da 5 dakika santrifüjleyin, hücreleri toplayın ve sayın ve her ekstraksiyon için 1 × 107 hücre alın.
  2. Hücreleri 2 mL mitokondri ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin (tampon hazırlığı için: 10 mL 0.1 M Tris-MOPS, 1 mL 0.1 M EGTA / Tris ve 20 mL 1 M sükroz; hacmi damıtılmış su ile 100 mL'ye getirin ve pH'ı 7.4'e ayarlayın) 2 mL steril PBS ile yıkadıktan sonra 1x proteaz inhibitörü kokteyli ile, ve sonra 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  3. Hücreleri bir cam homojenizatör (2.0 mL) ile 20x-30x homojenize edin ve tripan mavisi boyama ile homojenizasyon derecesini kontrol edin.
    NOT: Lekeli hücrelerin oranı ~%80 olmalıdır. Aşırı homojenizasyon mitokondrinin yapısına zarar verir.
  4. Hücre homojenatını 600 × g'da 15 dakika santrifüjleyin, süpernatanı yeni, önceden soğutulmuş 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne alın ve işlemi bir kez tekrarlayın.
  5. Süpernatanı 15 dakika boyunca 7.500 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Mitokondriyal çökeltiyi yıkayın ve ~ 100 μL önceden soğutulmuş mitokondriyal enjeksiyon tamponu (225 mM mannitol, 75 mM sükroz, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ve 5 mM KH2PO4, pH 7.2) ekleyerek yeniden süspanse edin, 1-5 mg / mL konsantrasyonda (toplam protein konsantrasyonu). Mitokondriyal süspansiyonu buz üzerinde taşıyın.
  6. İzole edilmiş mitokondrinin işlevini ve saflığını JC-1 akış sitometrik analizi ve Western blot (VDAC1, β-aktin ve Lamin B) ile analiz edin13.
    1. İzole edilmiş mitokondriyi üç gruba ayırın: dimetil sülfoksit (DMSO), JC-1 lekeli ve 30 dakikalık karbonil siyanür 3-klorofenilhidrazon (CCCP) ön işlemi ile boyanmış JC-1.
    2. 7.500 × g'da santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın ve tamponu askıya alın.
    3. Akış sitometrisi ile yakalanan JC-1 monomerlerinin (FITC kanalı) ve agregaların (PE kanalı) floresan yoğunluğunu yakalayın. PE kanalının ortalama floresan yoğunluğunun FITC kanalına oranlarını ölçerek izole edilmiş mitokondriyal membran potansiyellerini değerlendirin.
      NOT: Yukarıdaki adımları karanlıkta gerçekleştirin.

3. Yumurtalık süper stimülasyonu

  1. Süperovülasyon için 10 aylık dişi C57BL / 6 farelere intraperitoneal olarak 10 IU hamile kısrak serumu gonadotropin (PMSG) enjekte edin. 48 saat sonra, intraperitoneal olarak 10 IU insan koryonik gonadotropini (hCG) enjekte edin.
  2. HCG enjeksiyonundan 13 saat sonra, şişmiş fallop tüpünü mikroskobik cımbızla yırtın. Şişmiş fallop tüpünden kümülüs komplekslerini serbest bırakın. M2 ortamındaki kümülüs hücrelerini 37 ° C'de hyaluronidaz (0.3 mg / mL) ile çözün.
    NOT: Çözünme süresi 5 dakikadan azdır. Kümülüs kompleksinin hyaluronidaza maruz kaldığı süreyi en aza indirin, çünkü uzun süreli maruz kalma oosit gelişim potansiyelini bozabilir.

4. ICSI ile birlikte mitokondriyal transfer

  1. Spermi kuyruksuz mitokondriyal sıvıya koyun. Ultrason17 kullanarak keserek kuyruksuz sperm elde edin. Spermi kuyruksuz mitokondriyal sıvıya yerleştirin, böylece mitokondriyal sıvının 50 μL'sinde 100 sperm olur.
    NOT: Mitokondriyal süspansiyon hafif viskoz olduğundan ve in vitro olarak stabil olmadığından, enjeksiyonu 30 dakika içinde tamamlayın ve tıkandığında mikroenjeksiyon iğnesini hemen değiştirin. Mikroenjeksiyon iğnesinin optimum iç çapı 5 μm'dir.
  2. Mehlmann ve Kline10,18 tarafından tarif edilen Hiramoto protokolüne göre 30 dakika içinde ters mikroskop altında (200x; Malzeme Tablosuna bakınız) bir mikroenjektör kullanarak oositlere ~ 2 pL mitokondriyal solunum tamponu veya sperm ile mitokondriyal süspansiyon enjekte edin.
    NOT: Enjekte edilen mitokondriyal süspansiyon, toplam oosit hacminin %1-3'ünü oluşturur. Enjeksiyonun tutarlılığını sağlamak için sitoplazmadaki mitokondriyal süspansiyonun hacmini (% 1 -% 3) kontrol edin.
  3. Enjeksiyondan sonra, döllenmiş oositleri 15 dakika boyunca dengeleme için M2 ortamına yerleştirin ve hayatta kalan döllenmiş yumurtaları M16 kültür ortamına aktarın.
  4. İkinci kutup gövdesinin19 düzgün morfolojisini, pronükleer oluşumunu ve salınımını gözlemleyerek hayatta kalan verimli yumurtaları inceleyin. Embriyoları 4 gün boyunca her gün 09:00 ve 18:00'de gözlemleyin, fotoğraflayın ve sayın. Son olarak, blastokistleri toplayın ve dondurun ve mitokondriyal transplantasyonun sayısını ve gelişimini değerlendirmek için ATP ve mtDNA kopya sayısı belirleme için -80 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
    1. 1 ila 107, 1 ×× 106, 1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102 ve 1 × 101 kopya numarasına göre mitokondriyal kopya sayısı tayini için standart plazmid (daha önce tarif edildiği gibi13 gibi mutlak miktar tayini için plazmit) hazırlayın. Embriyoları sterilizasyon tüpüne aktarın ve mitokondriyal DNA'yı serbest bırakmak için 20 μL lizat tamponu ekleyin. Ardından, lizattaki proteazı 55 ° C'de 20 dakika ve 95 ° C'de 10 dakika inaktive edin.
    2. Aşağıdaki kurulumu kullanarak floresan kantitatif PCR ile mtDNA kopya sayısını belirleyin: 5 μL PCR karışımı, 0.5 μL B6 primer-ileri, 0.5 μL B6 primer-rev, 2 μL piroliz ürünü ve 2 μL ddH2O. PCR koşullarını takip edin: aşama 1, 3 dakika boyunca 95 °C; aşama2, 30 saniye boyunca 95 °C, 30 saniye boyunca 58 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C; Döngüyü 40x tekrarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, ADSC'leri fare yağından izole ettik ve karakterize ettik (Şekil 1). İzole mitokondri elde etmek için, hücre zarının bir cam homojenizatör kullanılarak parçalanması gerekir. (Şekil 2A). Mikroenjeksiyon tüpünün tıkanmaması için büyük kümeler olmadan düzgün bir mitokondriyal fraksiyon elde etmek önemlidir. Önce 200 μL, ardından 10 μL'lik pipet uçları kullanılarak homojenatlar nazikçe yeniden süspanse edilmelidir; son olarak, enjeksiyon için kullanıla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oositler, vücuttaki herhangi bir hücre türünden daha fazla mitokondri içerir ve ~ 1-5 × 105 mtDNA kopya sayısına sahiptir. Mitokondri, oosit olgunlaşması, döllenme ve embriyonik gelişim için gereklidir, bu nedenle herhangi bir mitokondriyal disfonksiyon, oosit kalitesinin düşmesine neden olabilir. Azalmış mitokondriyal miktar ve kalite fizyolojik yaşlanma ile yakından ilişkilidir. Bu protokolde, yaşlı oosit kalitesini iyileştirmeye çalışmak için yaşlı farelerin ADSC'lerinden m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (82001629'den XQS'ye), Changzhou Bilim ve Teknoloji Bürosu'nun CJ20200110 numaralı hibe numarasıyla Temel Araştırma Projesi'nden (NYY'ye), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı Gençlik Programı'ndan (BK20200116'den XQS'ye) ve Jiangsu Eyaleti Doktora Sonrası Araştırma Fonu'ndan (2021K277B'den X'e, Q.S.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 tripsin / EDTAGibco25300054Hücre Kültürü
  % 4 paraformaldehitbeyotimeP0099immünofloresan
40 & mu; m hücre süzgeciCorning352340ADSC izolasyon
adipojenik indüksiyonCyagenHUXXC-90031Çok yönlü farklılaşma
Alizarin kırmızı boyama çözeltisiSigmaA5533Çok yönlü farklılaşma
CD29'a karşı antikorBD Biosciences558741akış analizi
CD34BD Biosciences'a560942akış analizi
CD90'a karşı antikorBD Biosciences553016akış analizi
HLA-DR'ye karşı antikor BDBiosciences555560akış analizi
ve beta;-aktinAbcamab-8226Mitokondriyal fonksiyon testi
BSASigmaV900933immünofloresan
CCCPSolarbioC6700mitokondri JC-1 akış analizi
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711qPCR
kollajenaz tip ISigmaSCR103ADSC izolasyonu
DAPI InvitrojenD1306immünofloresan
DMEM-F12Gibco11320033Hücre Kültürü
DMSOSigma276855mitokondri JC-1 akış analizi
EGTASigma324626Mitokondri izolasyonu
FBSGibco10100147Hücre Kültürü
Akış sitometrisiBD BiosciencesFACSCanto& ticaret; IIADSC'lerin özellikleri
floresan mikroskobuleicaDM2500immünofloresan
jelatinSigma48722Çok yönlü farklılaşma
cam homojenizasyon tüpüSangonF519062Mitokondri izolasyonu
hCGAibeiM2520Yumurtalık süper stimülasyonu
hyaluronidazSigmaH1115000Yumurtalık süper stimülasyonu
  Ters mikroskopOlympusIMT-2Mikroenjeksiyon
İzole Mitokondri BoyamaKiti SigmaCS0760mitokondri JC-1 akış analizi
JC-1SigmaT4069Mitokondriyal fonksiyon testi
KClSigmaP5405Mitokondri transferi
KH2PO4SigmaP5655Mitokondri transferi
LaminBAbcamab-16048Mitokondriyal fonksiyon testi
M16 OrtaSigmaM7292embriyo hücre kültürü
M2 OrtaSigmaM7167embriyo hücre kültürü
mannitolSigmaM9546Mitokondri transferi
MikroenjektörOlympus + eppendorfIX73Mitokondri transferi
MitoTracker kırmızıInvitrogenM22425Mitokondri boyama
MOPSSigmaM1442Mitokondri izolasyonu
nörofilament aracı polipeptit (NFM)Santa Cruz Biyoteknolojisc-16143Çok yönlü farklılaşma
nörojenik indüksiyonGibcoA1647801Çok yönlü farklılaşma
Nöron spesifik enolaz (NSE)Santa Cruz Biyoteknolojisc-292097Çok yönlü farklılaşma
Yağ Kırmızı OSangonE607319Adipojenik farklılaşma
yağı kırmızı O çözeltisiSigmaO1516Çok yönlü farklılaşma
osteojenik indüksiyonSiyajenHUXXC-90021Çok yönlü farklılaşma
PBS (fosfat tamponlu salin)HidroksinSH30256.LSHücre Kültürü
penisilin ve streptomisinHiklonSV30010Hücre Kültürü
PMSGAibeiM2620Yumurtalık süper stimülasyon
proteaz İnhibitörü kokteyliSigmaP8340Mitokondri izolasyonu
sükrozSigmaV900116 Mitokondri izolasyonu
TrisSigma648314Mitokondri izolasyonu
Tris-HClSigma108319Mitokondri transferi
Triton X-100beyotimeP0096immünofloresan
VDACAbcamab-14734Mitokondriyal fonksiyon testi
karşı antikor

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. eBioMedicine. 75, 103790(2022).
  2. Qi, L., et al. Mitochondria: the panacea to improve oocyte quality. Annals of Translational Medicine. 7 (23), 789(2019).
  3. Babayev, E., Seli, E. Oocyte mitochondrial function and reproduction. Current Opinion in Obstettrics & Gynecology. 27 (3), 175-181 (2015).
  4. Bentov, Y., Esfandiari, N., Burstein, E., Casper, R. F. The use of mitochondrial nutrients to improve the outcome of infertility treatment in older patients. Fertility and Sterility. 93 (1), 272-275 (2010).
  5. Ben-Meir, A., et al. Coenzyme Q10 restores oocyte mitochondrial function and fertility during reproductive aging. Aging Cell. 14 (5), 887-895 (2015).
  6. He, Y., Wang, Y., Zhang, H., Zhang, Y., Quan, F. Alpha-lipoic acid improves the maturation and the developmental potential of goat oocytes in vitro. Reproduction in Domestic Animals. 56 (4), 545-554 (2021).
  7. Gunalan, E., Yaba, A., Yilmaz, B. The effect of nutrient supplementation in the management of polycystic ovary syndrome-associated metabolic dysfunctions: A critical review. Journal of the Turkish German Gynecological Association. 19 (4), 220-232 (2018).
  8. Liu, M., et al. Resveratrol protects against age-associated infertility in mice. Human Reproduction. 28 (3), 707-717 (2013).
  9. Cohen, J., Scott, R., Schimmel, T., Levron, J., Willadsen, S. Birth of infant after transfer of anucleate donor oocyte cytoplasm into recipient eggs. Lancet. 350 (9072), 186-187 (1997).
  10. Wang, Z. B., et al. Transfer of autologous mitochondria from adipose tissue-derived stem cells rescues oocyte quality and infertility in aged mice. Aging. 9 (12), 2480-2488 (2017).
  11. Mobarak, H., et al. Autologous mitochondrial microinjection; a strategy to improve the oocyte quality and subsequent reproductive outcome during aging. Cell & Bioscience. 9, 95(2019).
  12. Bagheri, H. S., et al. Mitochondrial donation in translational medicine; from imagination to reality. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 367(2020).
  13. Sheng, X., et al. Mitochondrial transfer from aged adipose-derived stem cells does not improve the quality of aged oocytes in C57BL/6 mice. Molecular Reproduction & Development. 86 (5), 516-529 (2019).
  14. Arana, M., Mazo, M., Aranda, P., Pelacho, B., Prosper, F. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and characterization. Methods in Molecular Biology. 1036, 47-61 (2013).
  15. Yang, Y., Zhang, C., Sheng, X. Isolation and culture of three kinds of umbilical cord mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (186), e64065(2022).
  16. Yang, Y., et al. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on a collagen scaffold improves ovarian function in a premature ovarian failure model of mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 55 (4), 302-311 (2019).
  17. Ward, M. A., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), (2018).
  18. Rinaudo, P., et al. Microinjection of mitochondria into zygotes creates a model for studying the inheritance of mitochondrial DNA during preimplantation development. Fertility and Sterility. 71 (5), 912-918 (1999).
  19. Arroyo, G., et al. Pronuclear morphology, embryo development and chromosome constitution. Reproductive Biomedicine Online. 20 (5), 649-655 (2010).
  20. Gosden, R. G., Johnson, M. H. Can oocyte quality be augmented. Reproductive Biomedicine Online. 32 (6), 551-555 (2016).
  21. Su, J., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen scaffolds restores ovarian function in a rat model of premature ovarian insufficiency. Human Reproduction. 31 (5), 1075-1086 (2016).
  22. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), 115963(2014).
  23. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Adipoz Kaynakl K k H crelerOosit KalitesiMitokondriyal DisfonksiyonOtolog Mitokondriyal TransplantasyonOosit Sitoplazmik TransferiKad n nfertilitesiYa lanan Oositler
Video yakında

İlgili makaleler