Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi

4.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64236

⸱

9 Ağustos 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1INRAe, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, 2Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI), 3Medical Faculty, University of Würzburg, 4Centre de Biochimie Structurale, INSERM U1054, CNRS UMR 5048, University of Montpellier

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada sunulan, Escherichia coli BL21 Rosetta2'nin (ΔrecBCD ve ΔrecB) ekzonükleaz V nakavt suşlarından hücre ekstraktlarının hazırlanması ve tampon kalibrasyonu için bir protokoldür. Bu, lineer DNA şablonlarını kullanarak hücresiz protein sentez sistemlerinde ekspresyon için hızlı, kolay ve doğrudan bir yaklaşımdır.

Özet

Hücresiz protein sentezi (CFPS), sayısız avantajı nedeniyle sentetik biyoloji alanında son zamanlarda çok popüler hale gelmiştir. CFPS için lineer DNA şablonlarının kullanılması, klonlama, transformasyon ve plazmid ekstraksiyonu adımlarını ortadan kaldırarak deneysel süreyi azaltarak teknolojinin tam potansiyeline ulaşmasını sağlayacaktır. Lineer DNA, şablonun yüksek konsantrasyonlarını elde etmek için PCR ile hızlı ve kolay bir şekilde çoğaltılabilir, böylece potansiyel in vivo ekspresyon toksisitesi önlenir. Bununla birlikte, lineer DNA kalıpları hücre ekstraktlarında doğal olarak bulunan ekzonükleazlar tarafından hızla parçalanır. Bu problemin üstesinden gelmek için, nükleaz inhibitörlerinin eklenmesi veya korunma için lineer DNA uçlarının kimyasal modifikasyonu gibi önerilen birkaç strateji vardır. Tüm bu stratejiler ekstra zamana ve kaynaklara mal olur ve henüz plazmid protein ekspresyonu seviyelerini elde edememiştir. CFPS için lineer DNA kalıplarını kullanmak için alternatif bir strateji için ayrıntılı bir protokol burada sunulmuştur. Ekzonükleaz eksikliği olan nakavt hücrelerinden hücre ekstraktlarını kullanarak, lineer DNA şablonları herhangi bir son modifikasyon gerektirmeden bozulmadan kalır. Özellikle lineer DNA için Mg-glutamat (Mg-glu) ve K-glutamat (K-glu) için sonikasyon lizisi ve tampon kalibrasyonu ile Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD suşundan hücre lizatının hazırlık adımlarını sunuyoruz. Bu yöntem, E. coli CFPS'deki plazmid DNA'sından elde edilenle karşılaştırılabilir protein ekspresyon seviyelerine ulaşabilir.

Giriş

Hücresiz protein sentezi (CFPS) sistemleri, biyosensör mühendisliği, merkezi olmayan üretim ve genetik devrelerin prototiplenmesi için hızlı, basit ve verimli bir yöntem olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır1. CFPS sistemleri büyük potansiyelleri nedeniyle sentetik biyoloji alanında düzenli olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar CFPS sistemleri, teknolojinin tam potansiyeline ulaşmasını sınırlayabilen dairesel plazmidlere dayanmaktadır. Plazmid DNA'sının hazırlanması, klonlama sırasında birçok zaman alıcı adıma ve büyük miktarda DNA izolasyonuna bağlıdır. Öte yandan, bir plazmidden veya sentezlenmiş bir DNA şablonundan PCR amplifikasyonu, CFPS şablonlarını birkaç saat içinde hazırlamak için kullanılabilir 2,3. Bu nedenle, lineer DNA uygulaması CFPS için umut verici bir çözüm sunmaktadır. Bununla birlikte, lineer DNA, hücresel ekstraktlarda doğal olarak bulunan ekzonükleazlar tarafından hızla parçalanır4. λ-faj GamS proteini5'i veya Chi bölgeleri6'yı içeren DNA'yı koruyucu ajanlar olarak kullanmak veya uçlarının kimyasal modifikasyonu ile doğrusal DNA'yı doğrudan korumak gibi bu sorunu ele alan çözümler vardır 2,7,8,9. Tüm bu yöntemler, pahalı ve zaman alıcı olan hücre ekstraktına takviyeler gerektirir. Ekzonükleaz V kompleksinin (RecBCD) hücre lizatlarındaki lineer DNA'yı bozduğu uzun zamandır bilinmektedir4. Son zamanlarda, lineer DNA'nın, ekzonükleaz genleri (recBCD)10 için nakavt edilen hücrelerden lizatlarda çok daha iyi korunabileceğini gösterdik.

Bu protokolde, E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD suşundan sonikasyon lizisi ile hücresiz lizatların hazırlanması için adımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Sonication lizis birkaç laboratuar tarafından kullanılan yaygın ve uygun fiyatlı bir tekniktir11,12. Bu suştan üretilen ekstraktlar, lineer DNA kalıplarından gelen ifadeyi desteklemek için herhangi bir ekstra bileşenin veya DNA kalıbı modifikasyonunun eklenmesine ihtiyaç duymaz. Yöntem, özellikle yerli E. coli promotörlerinden doğrusal DNA ekspresyonu için hücre ekstraktları için tampon optimizasyonunun temel adımına dayanır. Lineer DNA ekspresyonu için bu spesifik tampon optimizasyonunun, yerel σ70 promotörlerinin GamS proteini veya Chi DNA takviyesi olmadan yüksek protein üretimi sağlaması için anahtar olduğu, hatta PCR ürünlerinin saflaştırılmasından kaçındığı gösterilmiştir10. Lineer DNA ekspresyonu için optimal Mg-glu konsantrasyonunun, plazmid DNA'sına benzer olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, optimal K-glu konsantrasyonu, muhtemelen transkripsiyonla ilgili bir mekanizma10'dan dolayı doğrusal ve plazmid DNA'sı arasında önemli bir fark göstermiştir. Bu yöntem kullanılarak ifade edilen proteinlerin işlevselliği, ayak parmağı anahtarlarının hızlı bir şekilde taranması ve enzim varyantlarının aktivite değerlendirmesi10 gibi çeşitli uygulamalar için gösterilmiştir.

Bu protokol, sadece mutant ΔrecBCD hücre ekstraktlarını ve lineer DNA için spesifik kalibrasyonu şablon olarak kullanarak E. coli hücresiz sistemlerde lineer DNA şablonlarını kullanmak için basit, verimli ve uygun maliyetli bir çözüm sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Ortam ve tampon hazırlama

  1. 2xYT+P ortamının hazırlanması (katı ve sıvı)
    1. Sıvı ve katı maddeleri Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın ve ardından otoklavlama ile sterilize edin.
      NOT: Bu protokol, kloramfenikol (10 μg / mL) içeren bir adet 2xYT + P agar plakası gerektirir. Sıvı ortamın hacmi, gerekli lizatın hacmi ile orantılıdır. Burada, 5 L sıvı 2xYT + P ortamın başlangıç hacmi kullanılır. Bununla birlikte, hücre kültürünün 1 L'sinin nihai hücre lizatının 2 ila 3 mL'si ile sonuçlandığını bilerek hacim gerektiği gibi ayarlanabilir.
  2. Kloramfenikol hazırlanması (34 mg/mL)
    1. 0.34 g kloramfenikol ağırlığında, 10 mL'ye etanol ekleyin ve karıştırarak çözün. Aliquot 1 mL her biri birkaç tüp halinde ve daha sonra kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.
  3. S30A tamponunun hazırlanması
    1. S30A tamponunu Tablo 2'ye göre hazırlayın ve bu tamponun 2 L'sini hedefleyin.
      NOT: Bir kez daha, bu arabelleğin hacmi, gerekli lizatın hacmiyle orantılıdır.
    2. Otoklavlamadan önce, buzul asetik asit kullanarak tamponun pH'ını 7,7'ye ayarlayın.
    3. Arabelleği otoklav edin.
    4. Otoklavlamadan sonra bu tamponu 4 °C'de tutun.
    5. Kullanmadan önce, 2 mM'lik son konsantrasyona (2 mL stok 1 M DTT ila 1 L S30A tamponu) ulaşmak için S30A tamponuna DTT (0,22 μm membran filtre ile filtrelenmiş) ekleyin.
      NOT: Bir kez daha, bu arabelleğin hacmi, gerekli lizatın hacmiyle orantılıdır.
  4. Enerji çözeltisinin hazırlanması
    NOT: Bu enerji çözümü, Sun et al. paper13'e (14x stok konsantrasyonu) dayanmaktadır. Tablo 3, enerji çözeltisi stoğunun hazırlanması için gerekli bileşenleri, bu protokolde kullanılan tüm kimyasalların katalog numaralarıyla özetlemektedir.
    1. Stok çözeltilerini Tablo 3'e göre hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
    2. Tablo 3'te belirtildiği gibi Tris tamponu 2 M (250 mL steril su hacminde 60,57 g Tris baz) veya %15 KOH (100 mL steril su hacminde 15 g KOH) ile belirtilen bileşenler için istenen pH değerini kalibre edin.
    3. 15 mL'lik bir tüpte, her bileşenin hacmini Tablo 3'te belirtilen sırayla ekleyin.
    4. Aliquot enerji çözeltisi, tüp başına 150 μL.
    5. Alikotları kuru buz üzerinde flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
  5. Amino asit (AA) çözeltisinin hazırlanması
    NOT: Amino asit çözeltisi, RTS Amino Asit Örnekleyici kiti tarafından hazırlanır. Bu kitte 20 amino asidin her biri, 140 mM'de bulunan lösin hariç, 168 mM'de 1.5 mL hacim olarak sağlanır. Burada, hazırlanan stok çözeltisi, gerekli çalışma çözeltisi yerine 4x konsantredir. Amino asit çözeltisinin nihai konsantrasyonu, 5 mM'de olan lösin hariç, tüm amino asitler için 6 mM'dir.
    1. 20 amino asit tüpünü vorteks yaparak çözün ve tamamen çözünene kadar 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Cys tamamen erimeyebilir.
    2. 50 mL'lik bir tüpte, Tablo 4'te belirtilen sırayla 12 mL steril su ve amino asitlerin her birine 1,5 mL ekleyin.
    3. Çözelti oldukça berrak olana kadar vorteks, gerekirse 37 ° C'de inkübe edilir.
      NOT: Cys tamamen erimeyebilir.
    4. Aliquot 500 μL buz üzerinde tüp başına amino asit çözeltisi.
    5. Alikotları kuru buz üzerinde flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
  6. Tampon kalibrasyonu için çözeltilerin hazırlanması
    1. Stok çözeltisini Tablo 5'te belirtildiği gibi Mg-glu (100 mM) ve K-glu (3 M) için hazırlayın. Kalibrasyon adımları için Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi Mg-glu (0 ila 20 mM) ve K-glu (20 ila 300 mM) için bu stoklardan seri seyreltme ( 1 mL hacimde) yapın.
      NOT: Bu stok konsantrasyonları kalibrasyon adımı içindir ve son deneyi kurarken değiştirilmesi gerekebilir. Bu protokol için test edilen stokların en yüksek konsantrasyonları, Mg-glu ve K-glu için sırasıyla 1 M ve 4.5 M'dir.
  7. PEG8000 çözelti stoğunun hazırlanması
    1. 50 mL% 40 PEG8000 çözeltisi hazırlayın (50 mL steril su hacminde 20 g PEG8000).

2. Hücre kültürü ve lizat hazırlama (4 günlük deney)

  1. 1. Gün
    1. Streak suşu BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (Tablo 6) -80 °C gliserol stoğundan 10 μg / mL kloramfenikol içeren 2xYT + P agar plakasına kadar. Alternatif olarak, BL21 Rosetta2 ΔrecB (Tablo 6) da kullanılabilir10.
    2. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 2. Gün
    1. Yukarıdaki agar plakasından tek bir koloniyi, 10 μg / mL kloramfenikol ile desteklenmiş 10 mL 2xYT + P'ye aşılayın.
    2. 200 rpm sallama ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  3. 3. Gün
    1. Gece kültürünü 100 kez 10 μg / mL kloramfenikol içeren 4 L taze 2xYT + P ortama seyrelterek bir alt kültür yapın.
      NOT: Örneğin, 3960 mL taze ortama 40 mL gecelik kültür eklenir. Seyreltmeden sonra, 4 L ortam 4 şişeye (5 L hacim) bölünür, böylece her şişe 1 L içerir.
    2. 1.5-2.0'lık bir OD 600'e ulaşmak için yaklaşık 3 ila 4 saatlik büyüme için 37 ° C,200 rpm'de inkübe edin. OD600 > 0,8 ölçülüyorsa kültürü 4 kat seyreltin.
      NOT: Tam inkübasyon süresi gerinim, ilk inokulum, laboratuvar yazılımı ve kullanılan aletlere göre değişebilir. ΔrecB / ΔrecBCD nakavt suşları, BL21 Rosetta2 ebeveyni ile karşılaştırılabilir büyüme oranlarına sahiptir (Ek Şekil 1).
    3. Kültürü buza koyun.
    4. Hücreleri 5.000 x g'de 4 ° C'de 12 dakika boyunca döndürün ve ardından dekantı boşaltarak atın.
    5. Hücre peletlerini 800 mL soğutulmuş S30A+DTT içinde yeniden askıya alın.
      NOT: S30A+DTT'nin hacmi, orijinal hücre kültürü hacminden 5 kat daha azdır. Örneğin, hücre kültürünün 1 L'lik bir başlangıç hacmi için, hücre peletlerini 200 mL S30A + DTT'de yeniden askıya alın. Bu adımın 4 ° C'de soğuk bir odada yapılması ve tüm malzemelerin buz üzerinde tutulması da önerilir.
    6. Hücreleri 5.000 x g'de 4 ° C'de 12 dakika boyunca döndürün ve ardından dekantı boşaltarak atın.
    7. 2.3.5 ve 2.3.6 numaralı adımları yineleyin.
    8. Hücre peletlerini 160 mL soğutulmuş S30A+DTT'de yeniden askıya alın.
      NOT: Bu kez S30A+DTT'nin hacmi, orijinal hücre kültürü hacminden 25 kat daha azdır. Örneğin, hücre kültürünün 1 L'lik bir başlangıç hacmi için, hücre peletlerini 40 mL S30A + DTT'de yeniden askıya alın. Yine, bu adımın 4 ° C'de soğuk bir odada yapılması ve malzemelerin buz üzerinde tutulması önerilir.
    9. Hücreleri soğutulmuş ve önceden tartılmış 50 mL tüplere aktarın.
    10. Hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 2.000 x g'de döndürün ve ardından dekantı boşaltarak atın.
    11. Hücreleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 2.000 x g'de döndürün ve ardından bir pipet kullanarak kalan süpernatantı dikkatlice çıkarın.
    12. Hücre peletinin ağırlığını hesaplamak için tüpün ağırlığını yeniden ölçün.
    13. Hücre peletlerini -80 °C'de tutun.
  4. 4. Gün
    1. Hücre peletlerini -80 ° C'den alın ve 1-2 saat boyunca buz üzerinde çözün.
    2. Hücre peletlerini, pelet ağırlığının gramı başına 0,9 mL S30A+DTT tamponunda yeniden askıya alın. Hücreleri yeniden askıya almak için yavaşça pipet çekin, varsa üst köpükten mümkün olduğunca kaçının.
    3. Yeniden askıya alınan hücrelerin 1 mL'lik alikotlarını 1,5 mL mikrotüplere yerleştirin ve bunları 4 ° C'de buz veya önceden soğutulmuş bir soğuk blok üzerinde tutun (metal blokların kullanılması tercih edilir).
      NOT: Son aliquot 1 mL'den çok daha azsa, optimal olmayan bir hacmi sonikleştirmekten ziyade atmak daha iyidir. Sonikasyon için en uygun ses seviyesi (1 mL) bu kurulum (tüp, sonikatör ve prob) için belirlenmiştir ve farklı bir kurulum için değişebilir.
    4. Üç döngü için% 20 genlik kurulumu ile (3 mm prob, frekans 20 kHz) her tüpü bir sonikatörde (30 s sonikasyon, 1 dakikalık duraklama) sonikleştirin.
      NOT: Üç döngü boyunca verilen toplam enerji ~ 266 Joule (döngü başına ~ 80-110 Joule) idi. Bu adım sırasında, tüpleri buzla çevrili soğuk blokta tutun. Probun aşırı ısınmasını önlemek için iki soğuk blok arasında geçiş yapın (beklemedeki soğuk blok da buz üzerinde soğuk tutulur). Her iki soğuk blok da sonikasyondan bir gün önce buzdolabında önceden soğutuldu.
    5. Lisatı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün.
    6. Süpernatantı (hücre lizat) bir pipetle toplayın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
    7. Hücre lizatını 37 ° C'de 200 rpm ajitasyonda 80 dakika boyunca inkübe edin.
    8. Lisatı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün.
    9. Tüm tüpleri buz üzerinde tutarken, her biri önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrotüplerde süpernatant ve aliquot 30 μL'yi toplayın.
    10. Lisat alikotlarını kuru buz üzerinde flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.

3. Lineer DNA için hücresiz tampon kalibrasyonu

NOT: Hücresiz tampon, Sun ve ark.13'te açıklandığı gibi optimal Mg-glu ve K-glu konsantrasyonları için kalibre edilmiştir. Kalibrasyon adımları için Ek Dosya 1 gereklidir. Reaksiyonlar her biri 10.5 μL'lik bir son hacme ayarlandı. Ekstraktlar 1 nM lineer (aşağıdaki bölüm 4'e bakınız) veya plazmid DNA kullanılarak kalibre edildi. Deneyler, tamponların hazırlandığı gün yapılabilir veya hazırlanan tamponlar -80 °C'de dondurularak deneyi başka bir günde gerçekleştirebilir. Tüm kalibrasyon adımları için, her bir bileşen 384 delikli bir plakaya karıştırılmadan ve pipetlenmeden önce buz üzerinde çözüldü.

  1. Excel dosyası Ek Dosya 1'deki 'Tampon Hazırlama' sekmesine göre, aşağıdakileri içeren bir Ana Karışım hazırlayın: (a) hücre ekstraktı (toplam reaksiyon hacminin% 33'ü), (b) raporlayıcı DNA (doğrusal ve / veya plazmid DNA'sı olarak) 1 nM'lik bir nihai konsantrasyona, (c) hücresiz tampon (PEG8000, AA çözeltisi ve enerji çözeltisi) ve (d) K-glu 80 mM'lik bir nihai konsantrasyona.
  2. 10.5 μL'lik bir reaksiyon hacmi için, farklı konsantrasyonlarda Mg-glu 10x konsantre stoklarından (nihai konsantrasyon aralıkları: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ve 20 mM) 1.05 μL (% 10 toplam reaksiyon) alın ve Master Mix'in 9.45 μL'sini (% 90 toplam reaksiyon) ekleyin. Yavaşça karıştırın.
    NOT: Dillüzyonları hazırlamak için PCR sekiz şeritli tüpler kullanın ve çok kanallı pipetle karıştırın. Gerekirse, farklı bir Mg-glu konsantrasyonu aralığı kullanılabilir.
  3. Yukarıdaki reaksiyonların 10 μL'sini 384 kuyucuklu kare tabanlı bir mikro plakaya pipetleyin, yapışkan bir plaka contası kullanarak örtün ve floresan çıkışı olarak gen ekspresyonunu ölçün. Floresan verilerini bir plaka okuyucu ile kaydetme (Ör. 485 nm; Em: 528 nm) düzenli aralıklarla (örneğin, 5 dakika) 30 ° C'de 8 saatlik inkübasyon için 307 cpm'de sürekli yörüngesel sarsıntı ile.
    NOT: Gerekirse, veri toplamaya başlamadan önce 384 delikli mikro plakayı (<2.500 x g, 1 dakika, oda sıcaklığı) aşağı doğru döndürün. Farklı tampon bileşimlerindeki GFP ekspresyonunu karşılaştırmak için son nokta ölçümleri kullanıldı. Floresan değerleri, çizim için standartlaştırılmış birimlere dönüştürülebilir (aşağıya bakınız).
  4. Son noktada en yüksek floresan değeri ile sonuçlanan Mg-glu konsantrasyonunu tanımlayın.
    NOT: Elde edilen optimal Mg-glu konsantrasyonundan emin değilseniz, adım 3.2'yi daha çeşitli konsantrasyon aralıklarıyla tekrarlayın.
  5. Optimize edilmiş Mg-glu konsantrasyonu ile, adım 3.2'de belirtilen hacimleri kullanarak bir dizi konsantrasyon (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 ve 240 mM) için K-glu kalibrasyonuna geçin. Deneyi çalıştırın ve test edilen K-glu konsantrasyonları arasından en yüksek floresan değerini belirleyin. Bu, bu lizat için Mg-glu ve K-glu için en uygun tampon bileşimini gösterir.
    NOT: Elde edilen optimum K-glu konsantrasyonundan emin değilseniz, adımı daha çeşitli konsantrasyon aralıklarıyla tekrarlayın.
  6. Mg-glu ve K-glu değerleri belirlendikten sonra, elde edilen parti hacmine göre optimize edilmiş tampon bileşiminin stok tüplerini hazırlayın. Gerekli tampon tüp sayısını hesaplamak için Ek Dosya 1'deki 'Tampon Hazırlama' sekmesini kullanın, tüp başına 38 μL aliquot ve -80 ° C'de saklayın.

4. Lineer DNA hazırlığı

NOT: Lisat kalibrasyonu için plazmid P70a-deGFP kullanılır. Bu plazmid, Plazmid Miniprep Kiti kullanılarak miniprep için E. coli KL740 cl857+ (Tablo 6) veya Plasmid Maxiprep Kiti kullanılarak maxiprep olarak muhafaza edilmiştir. Hücresiz reaksiyonlarda ekspresyon şablonları olarak kullanılan lineer DNA fragmanları, Tablo 7 ve Tablo 8'de listelenen primerler ve şablonlar kullanılarak PCR güçlendirildi.

  1. PCR, Tablo 7'de listelenen oligo primerleri ile DNA polimeraz kullanarak plazmid P70a-deGFP'den amplifikasyon yapar. PCR reaksiyonlarını, üreticinin protokolüne göre, termosikler programını kullanarak 50 μL'lik bir hacimde ayarlayın: [2 dakika boyunca 98 °C; 40 döngü x (30 s için 98 °C → 30 s için 66 °C → 60 s için 72 °C); 10 dakika için 72 °C; ∞ için 4 °C].
  2. 50 μL PCR reaksiyonu başına 1 μL DpnI kısıtlama enzimi ekleyerek PCR reaksiyonlarındaki şablon DNA'yı sindirin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, bir PCR ve DNA temizleme kiti kullanarak PCR reaksiyonunu saflaştırın ve nükleaz içermeyen suda salın.
  3. Kullanmadan önce PCR ürünlerini %1 agaroz jeli (1x TAE) üzerinde doğrulayın.
  4. Nanodrop (ND-1,000) kullanarak saflaştırılmış PCR ürünlerini (veya plazmid preparatlarını) ölçün.
    NOT: Aşağı akış hücresiz reaksiyonu ile doğrudan uyumlu bir DNA polimeraz / tampon kullanılıyorsa, saflaştırma adımı (adım 2) tamamen atlanabilir ve saflaştırılmamış DNA konsantrasyonu, DNA bağlayıcı boya ile florometrik bir tahlil ile ölçülebilir (bkz.

5. Deneysel yürütme

NOT: Hazırlanan her lizat partisi için tampon stoğunu kalibre etmek üzere Ek Dosya 1'i kullanmanın yanı sıra (yukarıda), sonraki hücresiz reaksiyonları ayarlamak için dosyadaki 'Reaksiyon Hazırlama' sekmesinin kullanılması önerilir. Daha önce olduğu gibi, reaksiyonların hacmi reaksiyon başına 10,5 μL'ye ayarlanır, bunun sadece 10 μL'si veri toplama için 384 delikli plakaya pipetlenir. Burada, hücresiz ifade için her şablonun 5 nM'si kullanılır. Reaksiyonları pipetlerken tutarlı olmak önemlidir – aynı pipeti ve uçların türünü kullanın. Kuyudaki kabarcıkların veya kuyunun duvarlarına yapışan herhangi bir sıvının önlenmesi için dikkatlice dağıtın. Gerekirse, plakayı aşağı doğru çevirin (<2.500 x g, 1 dakika, oda sıcaklığı).

  1. Ek Dosya 1'in 'Reaksiyon Hazırlama' sekmesine numune başına gereken numune açıklamalarını ve replikalarını girerek pipet hacimlerini hesaplayın.
    NOT: 10,5 μL'den farklı bir reaksiyon hacmi gerekiyorsa, bu Ek Dosya 1'e de girilebilir. Dosya, daha önce optimize edilmiş tampon stoklarının tüp sayısını ve buz üzerinde çözülecek hücre ekstrakt tüplerini hesaplayacaktır.
  2. Optimal Master Mix preparatı için 1,5 mL'lik bir mikrotüpü etiketleyin (lineer ve plazmid DNA için ayrı ayrı), Tampon ve Lisat'ın doğru hacimlerini ekleyin ve yavaşça karıştırın.
    NOT: Tamponlarındaki optimal K-glu konsantrasyonlarındaki farklılıklar nedeniyle, lineer ve plazmid DNA'sı için ayrı ayrı kullanılmak üzere 'Reaksiyon Hazırlama' sekmesinin kopyaları yapılmalıdır.
  3. Önce DNA örneklerini pipetleyin, ardından nükleaz içermeyen su ve son olarak adım 5.2'den itibaren Optimal Master Mix (MM). Plaka okuyucuya eklemeden hemen önce hücresiz reaksiyonu pipetle nazikçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının.
    NOT: Ek bir çoğaltma için reaksiyon hacmini karıştırmak üzere bir PCR sekiz şeritli tüp kullanın. Örneğin, teknik üçlü dosyalar amaçlanıyorsa, dört reaksiyon için bir karışım hazırlayın ve numuneleri plakaya eklerken pipetleme hatalarını azaltmak için tüpte ölü bir hacim bırakın.
  4. Plaka okuyucudaki reaksiyonları ayarlayın (Ex 485 nm; Em 528 nm). Kinetik çalışmalar, 30 ° C'de 8 saatlik inkübasyon için düzenli aralıklarla (örneğin, 5 dakika) floresan verilerini kaydetti ve 307 cpm'de sürekli yörüngesel sarsıntı yaptı.
    NOT: Son nokta ölçümleri 8 saatlik zaman noktası olarak bildirilmiştir. Toplanan floresan değerleri rastgele birimlerdedir (a.u.), ancak çizim için standartlaştırılmış birimlere dönüştürülebilirler (aşağıya bakınız).

6. FITC ve GFP bağıl nicelleştirme

NOT: GFP ifadesi, plaka okuyucu tarafından keyfi floresan ünitelerinde (a.u.) dışa aktarılır. Bununla birlikte, farklı ortamlar (partiler, ekipmanlar, kullanıcılar ve laboratuvarlar) arasındaki floresan değerlerini karşılaştırmak için standartlaştırılmış ölçü birimlerinin kullanılması önerilir. Burada, NIST-FITC ve rekombinant eGFP'nin standart eğrilerini kullanarak floresan değerlerini (a.u.) FITC eşdeğeri ve eGFP (μM) değerlerine dönüştürmek için ayrıntılı adımlar sunulmaktadır. NIST-FITC stok solüsyonunu 4 °C'de ve rekombinant eGFP'yi -20 °C'de saklayın. Stok çözeltisinin ve seri seyreltmelerin ışıktan korunduğundan emin olun. Teslimattan sonra, birden fazla donma-çözülme döngüsünü önlemek için rekombinant eGFP'nin daha küçük hacimlere ayrılması önerilir.

  1. 100 mM sodyum borat, pH 9.5'lik bir çözelti hazırlayın ve oda sıcaklığında veya 4 ° C'de saklayın.
  2. Standart eğri için 12 seyreltme (her biri 70 μL), sodyum borat çözeltisini kullanarak 50 μM stoktan NIST-izlenebilir FITC standardının adım başına 2x (50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390, 0.195, 0.097, 0.048 ve 0 μM) hazırlayın. Seyreltme serisini üçlü olarak hazırlayın.
  3. Adım 6.2'ye benzer şekilde, sodyum borat çözeltisini (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.0003, 0.00007 ve 0 μM) kullanarak rekombinant eGFP'den seri seyreltmeler (her biri 70 μL) hazırlayın. Molarite hesaplaması için, proteinin tam boyutunu (28 kDa) ve saflaştırılmış eGFP'nin konsantrasyonunu (1 g / L) göz önünde bulundurun. Seyreltme serisini üçlü olarak hazırlayın.
  4. Her seyreltmeden 20 μL (her biri dokuz kuyucuk = üç seyreltme serisi x üç teknik kopya) yapışkan bir plaka contası ile kaplanmış 384 kuyucuklu kare tabanlı bir mikro plakaya ekleyin ve ölçüm için bir plaka okuyucuda inkübe edin.
    NOT: Burada kullanılan ayarlar Uyarılma: 485/20, Emisyon: 528/20, kazanç 50 idi. Bununla birlikte, diğer floresan molekülleri ve / veya kazanç ayarlarını kalibre etmek için ek dalga boyu / kazanç kombinasyonları da kullanılabilir. Dönüşüm faktörünü hesaplamak için, GFP floresan verilerini hücresiz deneylerden ve standart eğri verilerinden elde etmek için aynı dalga boyu ve kazanç ayarları gereklidir.
  5. Her koşul için [y = eksen ve R2] eğimine uyması için doğrusal sinyal aralığını (örneğin, [FITC] ≤ 0,781 μM) kullanın.
    NOT: Ürün yelpazesi, kullanılan farklı makineler ve standart çözümler için farklılık gösterebilir.
  6. Tablo 9'daki örneği izleyerek laboratuvarın bağıl ölçümlerini hesaplamak üzere FITC ve eGFP kalibrasyonu için verileri kaydedin. GFP üretimini FITC veya eGFP cinsinden tahmin etmek için floresan keyfi birimlerinde (a.u.) elde edilen değerleri eğri eğimi "a" değerine (y = ax) bölün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Lineer ve plazmid DNA için ayrı ayrı optimal Mg-glutamat ve K-glutamat seviyeleri için lizatın kalibrasyonundan sonra temsili sonuçlar burada gösterilmiştir (Şekil 1). Mg-glutamat optimal konsantrasyonu, 8 mM'de Δ recB ve ΔrecBCD ekstraktları arasında benzerdir (Şekil 1B). Bununla birlikte, plazmid DNA'sı için optimal K-glutamat konsantrasyonu 140 mM'dir, oysa aynı ekstrakt için lineer DNA için optimal K-glutamat konsantrasyonu 20 mM'dir (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, E. coli BL21 Rosetta2'den hazırlanan hücre lizatının, recB veya recBCD operon için genomik nakavt ile doğrusal DNA şablonlarından yüksek protein ekspresyonunu desteklediğini gösteriyoruz. Bu protokol, lineer DNA şablonlarına özgü adım adım lizat kalibrasyon prosedürünü detaylandırır (Şekil 2), bu da lineer DNA'daki σ70 promotörlerinden yüksek ekspresyona yol açan ve equimolar DNA konsantrasyonları için plazmid seviyelerine ulaşan kritik bir adımdır. Bu prot...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

ACB ve JLF, ANR SINAPUV hibesi (ANR-17-CE07-0046) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. JLF ve JB, ANR SynBioDiag hibesi (ANR-18-CE33-0015) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. MSA ve JLF, ANR iCFree hibesi (ANR-20-BiopNSE) tarafından sağlanan finansman desteğini kabul eder. JB, ERC'nin "COMPUCELL" (hibe numarası 657579) başlatan desteğini kabul ediyor. Centre de Biochimie Structurale, Fransız Entegre Yapısal Biyoloji Altyapısı'nın (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01) desteğini kabul etmektedir. MK, INRAe'nin MICA bölümü, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) bölgesinin DIM-RFSI ve ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003) fon desteğini kabul etmektedir. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi Konsolidatör Ödülü (CLB'ye 865973) aracılığıyla finanse edilerek desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-YT Et SuyuInvitrogen22712020
1,5 mL Güvenli Kilitli tüplerEppendorf301200861,5 mL mikrotüp
384 kuyulu kare tabanlı mikroplakaThermo Scientific Nunc142761
3PGA (D- (-) -3-Fosfogliserik asit disodyum)Sigma-AldrichP8877
yapışkan plaka contasıThermo Scientific Nunc
AgarInvitrogen30391023
ATP (Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidrat)Sigma-AldrichA8937
BL21 Rosetta2Merck Millipore71402
BL21 Rosetta2 & Delta; recBAddgene176582
BL21 Rosetta2 ve Delta; recBCDAddgene176583
cAMP (Adenozin 3' 5'-siklik monofosfat)Sigma-Aldrich A9501
Kloramfenikol ve nbsp;Sigma-AldrichC0378
CoA (Koenzim A hidrat)Sigma-AldrichC4282
Corning 15 mL PP Santrifüj Tüpleri, CentriStar Kapaklı Raf Paketli, SterilCorning43079015 mL tüp
Corning 50 mL PP Santrifüj Tüpleri, CentriStar Kapaklı Konik Taban, SterilCorning430828 50 mL tüp
CTP (Sitidin 5'-trifosfat, disodyum tuzu hidrat)Alfa Aesar  J62238
DpnINEBR0176S
DTT (DL-Ditiyotreitol)Sigma-AldrichD0632
Folinik asit (katı folinik asit kalsiyum tuzu)Sigma-AldrichF7878
GTP (Guanozin 5?-Trifosfat,  Disodyum Tuzu)Sigma-Aldrich371701
HEPESSigma-Aldrich  H3375
K fosfat dibazik (K2HPO4)Carl Roth231-834-5
K fosfat monobazik (H2KO4P)Sigma-AldrichP5655
K-glutamatAlfa AesarA17232
Mg-glutamat Sigma-Aldrich49605
Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 & m, polietersülfonMerck MilliporeSLGP033RBmembran filtresi 0.22 &mikro; m
Monarch PCR & DNA Temizleme KitiNEBT1030SPCR & DNA temizleme Kiti
Monarch Plazmid Miniprep KitiNEBT1010SPlazmid Miniprep Kiti
NAD (B-nikotinamid adenin dinükleotid hidrat) Sigma-Aldrich N6522
NIST-izlenebilir FITC standardıInvitrogenF36915NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kitiMacherey-Nagel740414.1Plazmid Maxiprep Kiti
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
plaka okuyucuBiotek ve nbsp;Synergy HTX
Saflaştırılmış Rekombinant EGFP ProteinKromotekegfp-250rekombinant eGFP
Q5 Yüksek Sadakatli 2X Master MixNEBM0492SDNA polimeraz
Q5 Yüksek Sadakatli 2X Master MixNew England BiolabsM0492LDNA polimeraz
Qubit dsDNA BR Test KitiDNAQ32850florometrik test
RTS Amino Asit ÖrnekleyicibiotechrabbitBR1401801
SpermidinSigma-Aldrich85558
Steril suMillipore RiOs 8 sisteminden arıtılmış su, otoklavlama ile sterilize edilmiştir.
Tris baseYaşam Bilimleri ürünleri Cytiva17-1321-01 
tRNARoche 10109550001
Ultrasonik işlemci Vibra hücresi VC-505SONICSVC505sonikatör
UTP Na3 (Üridin 5'- trifosfat, trisodyum tuzu hidrat)Acros Organics 
Su, nükleaz içermeyenThermoR0581nükleaz içermeyen su
232701 bağlayıcı boya ile Thermo 226310010

Kaynaklar

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328(2021).
  3. Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8(2016).
  4. Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
  5. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  6. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  7. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  8. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  9. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  10. Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882(2019).
  12. Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).
  13. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  14. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  15. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ekson kleaz Eksik H cre z tleriSentetik BiyolojiSonikasyon LizisiTampon KalibrasyonuMg Glutamat OptimizasyonuK Glutamat KalibrasyonuGFP EkspresyonuEscherichia Coli z tleri
Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.