İntravital mikroskopi, hızlı ve/veya sıralı süreçlerin hem zamansal hem de mekansal ilişkileri hakkında bilgi sağlayan güçlü bir araçtır. Burada, deneysel sepsis (endotoksemi) murin modelinde karaciğer sinüzoidlerinde hem protein-protein etkileşimlerini hem de trombosit-nötrofil-endotelyal etkileşimleri değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır.
Yöntem makalesi
Fare karaciğerinde trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için intravital mikroskopi
Bu makalede
Özet
Özet
Enflamasyon ve tromboz, öncelikle mikrosirkülasyonda meydana gelen karmaşık süreçlerdir. Standart histoloji, hem inflamasyon hem de tromboz için son yol hakkında bilgi sağlayabilse de, bu süreçlerin zaman seyri boyunca meydana gelen zamansal değişiklikleri gösterme yeteneğine sahip değildir. İntravital mikroskopi (IVM), in vivo fizyolojik süreçler hakkında zamansal içgörü elde etmek için canlı hayvan görüntülemenin kullanılmasıdır. Bu yöntem, bu etkileşimlerin meydana gelmesi için sıklıkla gerekli olan hızlı ve sıralı olaylar nedeniyle dolaşım içindeki hücresel ve protein etkileşimlerini değerlendirirken özellikle güçlüdür. IVM, karmaşık süreçleri in vivo olarak görüntüleyebilen son derece güçlü bir görüntüleme metodolojisi olsa da, bir IVM çalışması planlarken dikkate alınması gereken bir dizi metodolojik faktör vardır. Bu makale, karaciğerin intravital görüntülemesini yapma sürecini özetlemekte, ortaya çıkabilecek önemli hususları ve potansiyel tuzakları belirlemektedir. Bu nedenle, bu makale, farklı akut karaciğer hasarı modellerinde her birinin göreceli katkılarını incelemek için karaciğer sinüzoidlerinde trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için IVM'nin kullanımını açıklamaktadır.
Giriş
Enflamasyon ve tromboz, öncelikle mikrosirkülasyonda meydana gelen karmaşık süreçlerdir. Bu protokol, karaciğer mikrovaskülatürünün in vivo olarak görüntülenmesine izin veren cerrahi hazırlığı ana hatlarıyla belirtir. Standart histoloji hem inflamasyon hem de tromboz için son yollar hakkında fikir verebilse de, süreç boyunca meydana gelen zamansal değişiklikleri gösteremez. Ayrıca, bu yöntem, biyolojik sistemlerde meydana gelen genellikle hızlı ve sıralı etkileşimleri videomikroskopi yoluyla yakalama kabiliyeti nedeniyle, mikrovasküler dolaşım içinde meydana gelen geçici hücresel ve protein etki....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan protokolleri, Baylor Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Michael E. DeBakey Gazi İşleri Tıp Merkezi Araştırma ve Geliştirme Komitesi tarafından onaylandı. Tüm deneyler terminaldir, ötanazi sonunda cerrahi bir anestezi düzlemi altında gerçekleştirilir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Antikorların ve boyaların hazırlanması
- Antikor ve boya seçimi
NOT: Gözlemlenen eşzamanlı renklerin sayısı, belirli mikroskop kurulumuna bağlı olacaktır. Bura....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Lökositin inflamasyonlu endotelyuma yapışmasında vimentin çubuk alanının etkisinin değerlendirilmesi
Lökosit P-selektin glikoprotein ligand-1 (PSGL-1) endotel ve trombosit P-selektine bağlanması, sepsis kaynaklı karaciğer hasarı inflamasyonunun akut fazı sırasında meydana gelir. Bununla birlikte, vimentinin (rhRod) rekombinant insan çubuk alanının P-selektine bağlandığı ve hem endotel hem de trombositlere lökosit yapışmasını bloke ettiği gösterilmiştir. Bu protokol, rhRod'un karaciğerde PSGL-1'e bağım.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yöntem makalesinin amacı, homeostatik koşullar altında ve endotoksin veya APAP uygulamasını takiben fare karaciğerinin yüksek çözünürlüklü intravital görüntülerini ve videolarını güvenilir bir şekilde yakalamak için gerekli adımları özetlemektir. Bu protokol, karaciğerdeki trombosit-lökosit-endotel etkileşimleri hakkında tutarlı veri üretimine izin vermiş olsa da, başarı için gerekli olan bir dizi kritik adımın yanı sıra bu görüntüleme paradigmasını kullanırken kaçınılması gereken pot.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu. İçerikler, ABD Gazi İşleri Bakanlığı'nın veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) ve NIH/NHLBI HL139425 (JC) tarafından desteklenmiştir. Araştırma desteği ayrıca NIH / NHLBI HL116524 tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < güçlü > Cerrahi Malzemeler< / güçlü > | |||
| 2 "x 2" dokunmamış süngerler | McKesson Med. Surg | 92242000 | Karaciğer izolasyonu için |
| # 4-0 iğneli ipek örgülü sütür | SOFSILK | N/A | 4-0 Softsilk kaplı örgülü siyah, emilmez: C-1 kesme iğnesi |
| # 4-0 iğnesiz ipek örgülü sütür | Ethicon | N/A | 4-0 Siyah örgülü ipek, emilmeyen |
| 21 G künt iğne (0,5 inç) | SAI İnfüzyon Teknolojileri | B21-50 | Bu, ventilatöre bağlantıya izin vermek için trakeostomi tüpünün ucuna takmak için kullanılır. Alternatif bir kaynak Instech |
| 23 G künt iğnedir (0,5 inç) | SAI İnfüzyon Teknolojileri | B23-50 | Bu, vasküler kateterin bir şırıngaya bağlantıya izin vermesi için kullanılır. Alternatif bir kaynak Instech |
| Diseksiyon Makası (Sivri Uçlu) | Kent Scientific | INS600393-G | Mikro Diseksiyon Makası; Karbür Bıçaklar; Düz; Keskin noktalar; 24 mm Bıçak Uzunluğu; 4 1/2" Toplam Uzunluk |
| McPherson-Vannas Mikro Makas (Vannas) | Kent Scientific | INS600124 | Bunlar trakea ve damarlardaki açıklıkları oluşturmak için kullanışlıdır |
| Polietilen boru 10 | Instech | BTPE-10 | Bu, kateterin intravasküler kısmını yapmak için kullanılır. Alternatif bir kaynak BD Intramedic |
| Polietilen boru 50 | Instech | BTPE-50 | Bu, kateterin ekstravasküler kısmını yapmak için kullanılır. Alternatif bir kaynak BD Intramedic |
| Polietilen boru 90 | Instech | BTPE-90 | Bu, trakeostomi tüpünü yapmak için kullanılır. Alternatif bir kaynak BD Intramedic |
| USP sınıfı steril normal salin | Coviden | 8881570121 Hospira% 0.0 Sodyum Klorür Enjeksiyonu, USP | |
| < güçlü > Mikroskopi Malzemeleri< / güçlü > | |||
| İzofluran dağıtım sistemi ve ventilatör | Kent Scientific | Somnosuite | Kombinasyon kemirgen ventilatörü ve uçucu anestezik dağıtım sistemidir |
| Mikroskopi sırasında pedin ısıtılması için köpük ara parçası | N/A | N/A | Bu ara parça yüksek kaliteli köpükten kesilmeli, karaciğer mikroskobu tepsisinin etrafına sığmalı ve belirli yükseklik boyutları mikroskop sistemine bağlıdır |
| Rezonans kafa tarayıcılı lazer taramalı konfokal mikroskop sistemi | Olympus | FV3000 | Her ne kadar bir rezonans kafa tarayıcı kullanarak bir Olympus FV3000'in kullanımını tanımlasak da, bu protokol çoğu görüntüleme sistemi ile çalışır |
| Karaciğer Mikroskobu Tepsisi | N/A | N/A | Karaciğer mikroskobu tepsisi, ters çevrilmiş bir mikroskop |
| Antikorlar ve İlgili Reaktifler | |||
| Parlak Menekşe 421/anti-fare Ly6G antikoru | BioLegend | 127628 | 3 & mikro; g/fare. Nötrofilleri etiketlemek için |
| BV421/F4/80 antikoru | BioLegend | 123132 | 0.75 mg/kg. Kupffer hücrelerini etiketlemek için |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su, kalsiyum veya magnezyum içermez | Gibco/ThermoFisher Scientific | 14190144 | Antikorlardan sodyum azidi uzaklaştırmak için diyalizat olarak kullanılır |
| DyLight649/anti-GPIbβ antikor | emfret Analytics | X649 | 3 µ g/fare. Trombositleri etiketlemek için |
| DyLight488/anti-fare GPIbβ antikor | emfret Analytics | X488 | 6 &mikro; g/fare. Trombositleri etiketlemek için |
| Escherichia coli serotype O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | 5 mg/kg'dan Endotoksin; Endotoksinin gücü partiden partiye değişebilir. Bu nedenle, endotoksin lotu |
| PerCP-eFluor 710 / anti-fare P-selektin antikoru | Invitrogen | 46-0626-82 | 4 & mikro; g/fare. P-selektin etiketlemek için |
| Slide-a-Lyzer 7.000 MWCO kaset | Thermo Scientific | 66370 | Sodyum azidi uzaklaştırmak için antikorları diyaliz etmek için kullanılır |
| Texas Red etiketli dekstran | Sigma-Aldrich | T1287 | ~ 150 kDa; 250 ve mikro; g/fare |
| TRITC/sığır serum albümini | Sigma-Aldrich | A2289 | 500 & mikro; g/fare. Normal tuzlu suda 50 mg / mL (% 5) stok konsantrasyonuna seyreltin. Damar sistemini etiketlemek için kullanılır. Enflamasyon sırasında interstisyel boşluğa yüksek moleküler ağırlıklı dekstrandan daha kolay sızabilir |
Kaynaklar
- Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, Suppl 1 19-23 (2005).
- Nolan, J. P. The role of intestinal endotoxin in liver injury: A long and evolving history. Hepatology. 52 (5), 1829-1835 (2010).
- Miyakawa, K., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste