Yöntem makalesi

Fare karaciğerinde trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için intravital mikroskopi

928 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64239

⸱

6 Ekim 2022

 ,  , 
1Center for Translational Research on Inflammatory Diseases, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

İntravital mikroskopi, hızlı ve/veya sıralı süreçlerin hem zamansal hem de mekansal ilişkileri hakkında bilgi sağlayan güçlü bir araçtır. Burada, deneysel sepsis (endotoksemi) murin modelinde karaciğer sinüzoidlerinde hem protein-protein etkileşimlerini hem de trombosit-nötrofil-endotelyal etkileşimleri değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır.

Özet

Enflamasyon ve tromboz, öncelikle mikrosirkülasyonda meydana gelen karmaşık süreçlerdir. Standart histoloji, hem inflamasyon hem de tromboz için son yol hakkında bilgi sağlayabilse de, bu süreçlerin zaman seyri boyunca meydana gelen zamansal değişiklikleri gösterme yeteneğine sahip değildir. İntravital mikroskopi (IVM), in vivo fizyolojik süreçler hakkında zamansal içgörü elde etmek için canlı hayvan görüntülemenin kullanılmasıdır. Bu yöntem, bu etkileşimlerin meydana gelmesi için sıklıkla gerekli olan hızlı ve sıralı olaylar nedeniyle dolaşım içindeki hücresel ve protein etkileşimlerini değerlendirirken özellikle güçlüdür. IVM, karmaşık süreçleri in vivo olarak görüntüleyebilen son derece güçlü bir görüntüleme metodolojisi olsa da, bir IVM çalışması planlarken dikkate alınması gereken bir dizi metodolojik faktör vardır. Bu makale, karaciğerin intravital görüntülemesini yapma sürecini özetlemekte, ortaya çıkabilecek önemli hususları ve potansiyel tuzakları belirlemektedir. Bu nedenle, bu makale, farklı akut karaciğer hasarı modellerinde her birinin göreceli katkılarını incelemek için karaciğer sinüzoidlerinde trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için IVM'nin kullanımını açıklamaktadır.

Giriş

Enflamasyon ve tromboz, öncelikle mikrosirkülasyonda meydana gelen karmaşık süreçlerdir. Bu protokol, karaciğer mikrovaskülatürünün in vivo olarak görüntülenmesine izin veren cerrahi hazırlığı ana hatlarıyla belirtir. Standart histoloji hem inflamasyon hem de tromboz için son yollar hakkında fikir verebilse de, süreç boyunca meydana gelen zamansal değişiklikleri gösteremez. Ayrıca, bu yöntem, biyolojik sistemlerde meydana gelen genellikle hızlı ve sıralı etkileşimleri videomikroskopi yoluyla yakalama kabiliyeti nedeniyle, mikrovasküler dolaşım içinde meydana gelen geçici hücresel ve protein etkileşimlerini değerlendirirken özellikle güçlüdür. Bu makale, farklı akut karaciğer hasarı modellerinde her birinin göreceli katkısını incelemek için karaciğer sinüzoidlerinde trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için intravital mikroskopinin kullanımını açıklamaktadır.

Bu cerrahi hazırlık ve görüntüleme modalitesi bir dizi enflamatuar ve patolojik modele uyarlanma potansiyeline sahipken, burada iki vasküler inflamasyon modeli özetlenmiştir: murin sepsisi ve asetaminofen (APAP) ile indüklenen karaciğer hasarının endotoksemi modeli. Endotoksin enjeksiyonu (lipopolisakkarit; LPS), murin sepsisinin deneysel bir modelini indüklemek, 1930'ların başlarında, sepsis1'in ilerlemesinde anahtar bir molekül olarak izolasyonu ve ardından keşfi ile başladı. Bu model, LPS'nin Gram-negatif bakterilerin yalnızca tek bir bileşeni olması nedeniyle sınırlı olsa da, bu, nispeten basit ve gerçekleştirilmesi hızlı, yaygın olarak kabul edilen ve kullanılan bir yöntemdir. Ayrıca, sepsis1'in fizyolojik belirtilerini hızlı ve doğru bir şekilde çoğaltır. Bağırsak endotoksin emiliminin karaciğer hastalığı ve inflamasyon2 gelişiminde oynadığı rol göz önüne alındığında, bu, fare karaciğerindeki trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için mükemmel bir modeldir.

Bir LPS sepsis modeline ek olarak, APAP aşırı dozu, karaciğerdeki patolojik hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesi için mükemmel bir model sağlar. APAP doz aşımı, karaciğerde trombositopeni ve trombosit birikimi ile işaretlenmiş akut karaciğer yetmezliğine yol açabilir ve ardından lökosit aracılı karaciğer iyileşmesini bloke eder3. Bu model için cerrahi hazırlık ve görüntüleme metodolojisi bir dizi biyolojik soru için uyarlanabilir ve çeşitli patolojik süreçleri incelemek için uyarlanabilirken, hem LPS sepsis modeli hem de APAP'ın neden olduğu karaciğer hasarı, trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerinin in vivo olarak incelenmesi için mükemmel modellerdir.

IVM'nin standart histolojik tekniklere göre bazı doğal avantajları vardır. Standart histolojik yöntemler, tüm veya kesitli doku örneklerinin incelenmesine ve proteinlerin ve doku mimarisinin değerlendirilmesine izin verirken, bu metodolojilerin sınırlamaları vardır. Tasarım gereği, bu işlemler, canlı sistemde bulunanları çarpıtma veya maskeleme potansiyeline sahip doku işlemeyi gerektirir. Doku, histolojik hazırlık sırasında sabitlenmeli, fiksasyon artefaktları veya gelişmiş otofloresan potansiyeli ortaya çıkmalıdır. Fiksasyon ayrıca dokuda hücre içi değişikliklere yol açabilir ve yanlış fiksasyon potansiyeli doku bozulmasına yol açabilir. Ayrıca, histolojik yöntemler, protein veya hücresel etkileşimlerin zamansal yönlerini doğrudan inceleme potansiyelinden yoksundur ve geçici veya seyrek etkileşimleri kaçırma potansiyeline sahiptir.

Tersine, floresan intravital mikroskopi, standart histolojinin doğasında bulunan birçok komplikasyon ve sınırlamadan kaçınmaya izin verir. IVM, fiksasyonu ve dolayısıyla histolojik hazırlık sırasında meydana gelebilecek artefaktları veya doku bozulmasını önler. Tasarım gereği, canlı biyolojik sistem içindeki dokuların görüntülenmesine de izin verir ve bu nedenle doku izolasyonu ve kesit alma gerekli değildir. Ayrıca, histoloji kullanılarak yakalanması zor veya imkansız olabilen geçici veya seyrek süreçlerin görüntülenmesine ve incelenmesine izin verir. Bu IVM yöntemi, sıralı süreçleri yakalamak ve tanımlamak için de kullanılabilir (örneğin, vasküler endotelyuma bağlı trombosit-lökosit agregatları ile sonuçlanan trombosit veya lökosit tarafından başlatılan etkileşimler). Son olarak, bu yöntem bir dizi görüntüleme sistemine uyarlanabilir. Çalışmanın ihtiyaçlarına ve istenen veri setine bağlı olarak, cerrahi hazırlıktan sonra, eksternalize karaciğer istenen hemen hemen her görüntüleme sistemine yerleştirilebilir. Bu protokolü, geniş alan floresan mikroskobu, dönen disk mikroskobu, rezonans kafa tarayıcı kullanarak lazer taramalı konfokal mikroskopi ve iki foton mikroskobu kullanarak görüntülemeye başarıyla uyguladık. Bununla birlikte, bu yöntemin yukarıda belirtilen mikroskopi sistemleriyle sınırlı olması gerektiğine inanmak için hiçbir neden yoktur.

Bu yöntem makalesi, daha önce fare karaciğerindeki trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için kullanılan IVM için bir protokolü özetlemektedir. Bu protokol, floresan konjuge antikorlarla etiketlenmiş veya endojen floresan4 için genetik olarak modifiye edilmiş trombositlerin temporal trombosit-endotel adezyonunu karşılaştırmak için kullanılmıştır. Bu protokol, karaciğer inflamasyonunun endotoksemik modelinde karaciğer sinüzoidlerinde geçici trombosit-lökosit-endotel etkileşimlerini değerlendirmek ve P-selektin ve rekombinant proteini birlikte lokalize etmek için kullanılmıştır. Ek olarak, bu protokol, standart histoloji kullanılarak nötrofil yoğunluğunda görülen farklılıkların, kırmızı kan hücresi hızlarındaki farklılıkların bir sonucu olup olmadığını belirlemeyi mümkün kılmıştır (hacimsel akış hızı için bir vekil olarak)5. Son olarak, bu yöntem, APAP'ın neden olduğu karaciğer hasarının akut bir modelinde karaciğer sinüzoidlerindeki Kupffer hücreleri tarafından trombosit alımını değerlendirmek için kullanılmıştır6. Bu çalışma grubu, standart histolojik yöntemler kullanılarak mümkün olmazdı. Belirtildiği gibi, bu protokol çeşitli görüntüleme sistemleri için uyarlanabilir ve uygun cerrahi hazırlık, floresan antikor seçimi ve görüntüleme ayarları ile bu protokol karaciğer patolojisinin incelenmesi için oldukça güvenilir ve tekrarlanabilirdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri, Baylor Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Michael E. DeBakey Gazi İşleri Tıp Merkezi Araştırma ve Geliştirme Komitesi tarafından onaylandı. Tüm deneyler terminaldir, ötanazi sonunda cerrahi bir anestezi düzlemi altında gerçekleştirilir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Antikorların ve boyaların hazırlanması

  1. Antikor ve boya seçimi
    NOT: Gözlemlenen eşzamanlı renklerin sayısı, belirli mikroskop kurulumuna bağlı olacaktır. Burada kullanılan sistemde, dört farklı dalga boyu aynı anda görüntülenebilmektedir.
    1. Gemilerin görselleştirilmesi:
      1. Deneysel tasarıma dayanarak, damar sistemini endotel spesifik (örneğin, CD31) bir antikor ve / veya plazmada düzgün bir şekilde dağılmış bir molekül (örneğin, dekstran veya albümin) ile etiketleyin.
        NOT: Bu makale, Texas Red etiketli dekstran (150 kDa; 250 μg/fare) kullanımını açıklamaktadır. Bu büyük moleküler ağırlıklı proteinin yararı, akut inflamasyon sırasında damar sistemi içinde kalma yeteneğidir. Endotel fonksiyonuna müdahale etme potansiyeline sahip antikorlardan kaçınmak için antikor etiketlemesi kullanılırken dikkatli olunmalıdır.
    2. Trombositlerin görselleştirilmesi:
      1. Trombositleri tanımlamak için, IVM için genetik olarak değiştirilmiş fareler (örneğin, R26R-EYFPf / f / PF4-Cre) veya trombosit spesifik (örneğin, anti-GPIbβ) antikorlar kullanın. Trombositlerin floresan etiketlemesinin kullanımıyla ilgili ayrıntılı bilgi için, önceki bir yayınabakın 4.
        NOT: Burada, DyLight488 etiketli anti-GPIbβ antikorları (X488; 6 μg/fare) kullanılır. Trombosit fonksiyonuna veya yapışmaya müdahaleyi önlemek için antikor etiketlemesi kullanılırken dikkatli olunmalıdır.
    3. Lökositlerin görselleştirilmesi:
      1. Görüntüleme trombositlerine benzer şekilde, ilgilenilen lökositleri genetik olarak değiştirilmiş farelerle (örneğin, granülositler için LysM-EGFP) veya lökosit spesifik antikorlarla (örneğin, murin nötrofilleri için Ly6G) görselleştirin. Bu protokolü takip etmek için Brilliant Violet 421 (BV421) etiketli anti-Ly6G antikorları (3 μg/fare) kullanın. Akut (<6 saat) deneylerde, nötrofilleri hayvan başına 3 μg anti-Ly6G (klon 1A8) ile etiketleyin.
        NOT: Anti-Ly6G antikoru (klon 1A8) kullanılırken, bu antikorun en az 24 saat sonra ve / veya tekrarlanan enjeksiyonlarla nötrofilleri (0.05-1 mg antikor / fare)7-9 tüketmek için kullanıldığına dikkat edilmelidir. Anti-Ly6G (1A8) antikorlarının, hepsinde olmasa da belirli durumlarda yüksek (ancak düşük değil) kesme geriliminde nötrofil yapışmasını ve transmigrasyonunu etkilediği de bildirilmiştir 9,10. Bu nedenle, antikor dozu her vaka için dikkatlice seçilmelidir.
    4. Ek proteinler:
      1. Belirli bir görüntüleme sisteminde bulunan lazerlerin ve filtre setlerinin/dedektörlerinin sayısına bağlı olarak, spektral örtüşmeyi önlemeye dikkat ederken aynı anda daha fazla nesneyi tanımlamak için daha fazla dalga boyu ekleyin.
        NOT: Bu protokol, PerCP-eFluor 710 etiketli anti-P-selektin antikoru (4 μg/fare) kullanılarak 4. bir nesne olan P-selektinin (klon Psel.KO2.3) görüntülenmesini açıklar. Bu yazıdaki açıklamaların ve resimlerin çoğu LPS'ye bağlı akut karaciğer hasarı için olsa da, diğer yaralanma modelleri ilgi çekici olabilir ve alternatif etiketler gerektirebilir. APAP kaynaklı yaralanma6 için kullanılan antikorların açıklaması için tartışmaya bakın.
  2. Koruyucuların uzaklaştırılması ve sterilizasyon
    NOT: Hayvanlara enjeksiyona hazır, ticari olarak temin edilebilen antikorlar ve boyalar olmasına rağmen, bunların çoğunda hayvanlara zararlı olabilecek veya kafa karıştırıcı değişkenler ekleyebilecek taşıyıcılar veya koruyucular (örneğin, sodyum azid) olacaktır. Taşıyıcılar veya koruyucular içeren antikorlar ve boyalar, Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine karşı kalsiyum veya magnezyum (DPBS-/-; veya diğer fizyolojik tamponlar) olmadan diyalize edilmelidir.
    1. 500 mL DPBS-/- (diyalize edilecek antikor/boyanın ~ 1.000 kat hacmi) manyetik karıştırma çubuklu bir behere dökün. Bir şamandıra şamandırasına 7.000 MWCO'luk bir kaset takın ve membranı ön koşullandırmak için en az 5 dakika diyaliz tamponuna yerleştirin. Kaseti çıkarın ve plastik kenarları tüy bırakmayan bir mendille kurulayın. Diyaliz membranına dokunmaktan kaçının.
    2. Antikoru/boyayı 18-20 G'lik bir iğne kullanarak dört porttan birinden kasete enjekte edin. Antikor/boya içeren kaseti diyaliz tamponuna yerleştirin. Beheri manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin ve 4 °C'de en az 1 saat diyalize girin. Diyaliz tamponunu değiştirin.
    3. Adım 1.2.2'deki diyalizi ve diyaliz tamponunun değiştirilmesini en az iki kez daha tekrarlayın (en az üç değişim).
    4. Kaseti çıkarın ve plastik kenarları tüy bırakmayan bir mendille kurulayın. Diyaliz membranına dokunmaktan kaçının. 18-20 G'lik bir iğne kullanarak kullanılmayan bir porttan kasetteki antikoru/boyayı aspire edin.
    5. Bir doku kültürü davlumbazında, hayvanlarda kullanmadan önce preparatları 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin. Kullanılmayan kısımları 4 °C'de steril tüplerde saklayın.
  3. Denetim
    1. Her deney için gerekli olan kesin kontroller, çalışmanın tasarımına bağlı olarak değişecek olsa da, çalışma sonuçlarını analiz ederken spesifik olmayan etiketleme ve biyolojik etkileri hariç tutmak için uygun sahte kohortları, araçla tedavi edilen ve araçla tedavi edilmeyen grupları ve ayrıca izotip kontrollerini dahil ettiğinizden emin olun.

2. İntraperitoneal endotoksin enjeksiyonu

NOT: Deneysel bir murin sepsis modelinde karaciğer sinüzoidlerindeki trombosit-nötrofil-endotel etkileşimlerini değerlendirmek için endotoksin enjeksiyonu kullanılabilir.

  1. Enjekte edilecek endotoksin miktarını belirlemek için fareleri tartın (5 mg / kg; Escherichia coli serotipi O111:B4; endotoksin içeriği 1 x 106 EU / mg).
    NOT: Endotoksin gücü ve etkisi türe ve suşa bağlıdır ve partiden partiyedeğişebilir 11. Bu nedenle, sonuçların tutarlılığını en üst düzeye çıkarmak için, aynı miktarda endotoksin12 ile deneyler yapılmalıdır.
  2. Normal salin (% 0.9 sodyum klorür) ile seyreltilmiş endotoksini 27 G'lık bir iğne takılı bir şırıngaya çekin. Baskın olmayan elde, başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak fareyi tırnağından tutun. Diğer elinizi kullanarak, karnı ortaya çıkarmak için kuyruğa çekiş sağlayın ve kuyruğu beşinci basamak ile baskın olmayan elin avuç içi arasına yerleştirin.
  3. Karnı% 70 etanol ile temizleyin. İğneyi sol alt (veya sağ) karın içine sokun ve endotoksini enjekte edin.
    NOT: İğneyi çok derine batırmaktan kaçınmak için özen gösterilmelidir, çünkü deneyleri karıştırabilecek organ yaralanması riski vardır (örn. bağırsaklarda, bağırsakta, böbreklerde vb. yaralanma).
  4. Normal salin (veya araç) kullanarak kontrol hayvanlarında 2.1-2.3 adımlarını uygulayın.
    NOT: APAP'ın neden olduğu karaciğer hasarı, endotoksin6 yerine APAP kullanılarak, yukarıdakine benzer bir metodoloji kullanılarak gerçekleştirilebilir. APAP'ın neden olduğu karaciğer hasarı modeliyle ilgili ayrıntılar için tartışmaya bakın.

3. Hayvanların anestezisinin indüksiyonu ve sürdürülmesi ve ötenazi

  1. Hayvanları cerrahi bir anestezi düzlemi altına yerleştirin. Bir nosekon veya trakeostomi tüpü yoluyla inhale izofluran kullanarak anesteziyi koruyun. Bir ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra hareketi izleyerek anestezi seviyesini değerlendirin ve ayarlayın.
  2. Tüm deneylerin sonunda cerrahi bir anestezi düzlemi altında kan kaybı ve ardından bilateral pnömotoraslar ile ötenazi yapın.

4. Juguler ven ve trakeanın kateterizasyonu

  1. Solunumu kolaylaştırmak ve etiketli antikorların/boyaların enjeksiyonu için vasküler kateterlerin yerleştirilmesini kolaylaştırmak için bir trakeotomi yapın.
    NOT: Cerrahi diseksiyon mikroskobu veya luplar kateterizasyonda yardımcıdır.
  2. Kürkü boynundan ve karnından tıraş edin; Fazla tüyleri alın. Çekirdek sıcaklığını izlemek için bir rektal prob kullanarak vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak için hayvanı bir ısıtma pedine yerleştirin. Boynu betadin ve ardından% 70 etanol ile ovalayın.
  3. Boyunda dikey bir orta hat insizyonu yapın ve künt diseksiyon kullanarak trakeayı ortaya çıkarın.
    1. Trakeostomi
      1. 21 G künt iğne yerleştirilmiş bir trakeostomi tüpü PE90 tüpü hazırlayın (Şekil 1A).
        NOT: Trakeostomi tüpünün ucuna ~ 45 ° eğim eklemek, trakeaya yerleştirilmesini kolaylaştırmaya yardımcı olabilir. Alternatif olarak, PE90 tüpü için 18-20 G'lik bir periferik intravenöz kateter de kullanılabilir.
      2. Deri ve fasya kesildikten sonra, tükürük bezlerini merkezden uzağa yansıtın.
      3. Künt diseksiyon kullanarak, trakeaya daha iyi erişim sağlamak için sternotiroid kasını ayırın.
        NOT: Soluk borusuna bitişik olan besleme damarlarından ve karotis arterlerden kaçınmaya dikkat edin.
      4. Trakeanın ventral/anterior tarafındaki trakeal halkalar arasında küçük (~1-2 mm) yatay bir kesi yapın (Şekil 1B).
        NOT: Vannas makasının kullanılması uygun diseksiyonu kolaylaştıracaktır. Trakeanın sadece ön yüzünün kesildiğinden emin olun; Trakeanın tam transeksiyonu, trakeanın kanülasyonunu zorlaştıracak ve yakındaki vasküler yapılara zarar verme riski taşıyacaktır.
      5. Deliğe bir trakeostomi tüpü geçirin. Tüpün ucunun karinadan geçecek şekilde yerleştirilmediğinden emin olun.
      6. Trakeal halkaları destek olarak kullanarak, trakea ve tüpün etrafına # 4-0 ipek bir sütür bağlayarak trakeostomi tüpünü trakea içine sabitleyin (Şekil 1C).
    2. Eksternal juguler kanülasyon
      1. PE50 tüpü (OD 0.97 mm, ID 0.58 mm) kullanarak bir juguler kateter hazırlayın (Şekil 2) PE10 tüpü (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) bir ucuna yerleştirilmiş (Şekil 2 ek) ve diğer ucuna 22 G veya 23 G künt iğne yerleştirilmiş. Borunun kaymamasını veya sızmamasını sağlamak için yapıştırıcı kullanın. Kateteri yıkamak için steril normal salinle doldurulmuş bir şırınga takın.
      2. Tükürük bezi yansımasından sonra dış juguler veni (EJV) ortaya çıkarın. Künt diseksiyon kullanarak, EJV'yi çevredeki bağ dokusundan serbest bırakın (Şekil 3A).
      3. #4-0 ipek sütürler kullanarak, görüntülenen EJV'nin kraniyal ucunu bağlayın ve EJV'nin kaudal ucunun etrafına gevşek bir halka yerleştirin (Şekil 3B). Her bir sütürün uçlarını kanama durdurucularla birlikte sıkıştırın ve EJV'yi açığa çıkarmaya yardımcı olmak için iki kanama durdurucuyu birbirinden nazikçe geri çekin.
        NOT: Kanül yapmak için en uygun bölge, kraniyal olarak anterior juguler venin dalları ile kaudal olarak internal juguler ven arasındadır. Sütür yerleştirmeyi kolaylaştırmak için, bir parça (~ 15 cm) dikişi ikiye katlayın ve kabın yuvarlanmasını önlemek için EJV'yi ayrı bir çift forseps ile kaldırırken, bükülmüş ucu bir çift forseps ile EJV'nin altından geçirin. Ardından, iki ayrı uzunluk yapmak için dikişi kesin.
      4. Vannas makası kullanarak EJV'nin ön yüzeyinde küçük (~1 mm) bir kesi yapın. Bükülmüş 30 G'lik künt bir iğneyi (künt bir şekilde törpülenmiş ve iğne ucuna yerleştirilmiş 0,15 mm'lik bir minutien pimi ile güçlendirilmiş) insizyondan EJV'ye sokun ve normal salin içeren kateterin EJV'ye geçişini kolaylaştırmak için yavaşça yukarı kaldırın.
        NOT: Fareye yerleştirmeden ve yıkamadan önce kateter ve göbeğe hava kabarcığı olmadığından emin olun. Bir hava embolisi hayvan için öldürücü olabilir.
      5. Kateter EJV'nin içine girdikten sonra, kateterin damarın daha derinlerine geçmesine izin verecek kadar kaudal halkayı gevşetin. Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için kanı aspire ederek ve kateteri yıkayarak kateterin yerleşimini kontrol edin (Şekil 3C).
      6. Kaudal halkayı kullanarak kateteri EJV içinde sabitleyin. Kraniyal sütür kullanarak, kazara dekannasyonu en aza indirmek için kateteri EJV'nin kraniyal ucuna sabitleyin (Şekil 3D).
      7. Boyun derisi kesisini #4-0 ipek sütür ile kapatın.

5. Karaciğerin dışsallaştırılması

  1. Karnı bir betadin ovma ve ardından% 70 etanol ile temizleyin.
  2. Sternumun tabanından başlayarak üst karın derisinde ~ 1 cm'lik dikey bir kesi yapın. Künt diseksiyon kullanarak, cildi karın kaslarından ayırın. Aşağıdaki adımlar sırasında kanamayı en aza indirmek için cildin ve kasların büyük besleme damarlarını koterize edin (Şekil 4A).
  3. Deride ~ 1-2 cm'lik yatay bir kesi yapın ve ardından karın kasını takip edin, adım 5.2'deki dikey kesiyi yaklaşık olarak görünür karaciğerin üst kısmında ikiye bölün; cildin hemostazına yardımcı olmak için bir koter aleti kullanın (Şekil 4B).
    NOT: Karın kesisinin boyutu, karaciğerin optimal görüntülenmesi için kritik öneme sahiptir. Açıklık çok küçükse, hepatik arter ve/veya portal venin aşırı gerilmesi veya sıkışması nedeniyle karaciğer iskemisi riski vardır. Açıklık çok büyükse, bağırsaklar gibi diğer organlar da dışa dönük olabilir ve görüntülemeye müdahale edebilir.
  4. Gazlı bezde 2 inç x 2 ortada yaklaşık 1 cm'lik bir daire kesin ve ılık normal tuzlu su ile nemlendirin. Gazlı bezi, açıklık kesi üzerinde ortalanacak şekilde konumlandırın. Kesinin kenarlarını nazikçe ayırın ve karaciğeri dışsallaştırmak için karın üzerine hafif, yukarı doğru basınç uygulayın, böylece karaciğer nemli gazlı bezin üzerine kolayca dayanır (Şekil 4C).
  5. Fareyi, karaciğer lamel üzerinde ortalanmış şekilde yüzüstü pozisyonda görüntüleme tepsisine yerleştirin (Şekil 4D).
    NOT: Bir kontrol hayvanında, karaciğer kestane rengi görünmelidir. Bu protokolde IVM için iki yönlü rezonans kafa tarayıcılı ters çevrilmiş, lazer taramalı konfokal bir mikroskop kullanılır. Bu nedenle, özel bir IVM tepsisi oluşturmak için bir 3D yazıcı kullanıldı (Şekil 5). 3D yazdırma için oluşturulan .stl dosyaları sağlanır (Ek Dosya 1); Bireylerin ihtiyaçlarına uyacak şekilde ayarlamalar gerekebilir.
  6. Hayvanı ters çevrilmiş mikroskoba aktarın.

6. Karaciğer intravital mikroskopi görüntüleme

NOT: Bu protokol, intravital mikroskopi için iki yönlü rezonans kafa tarayıcılı bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanır. Rezonans kafası frekansını stabilize etmek için, görüntülemeden önce sistemi en az 30 dakika açın. Farklı sistemler farklı yeteneklere sahip olabilir. Bunların tartışılması bu makalenin kapsamı dışındadır. Belirli sistemlerin teknik ayrıntıları için ekipman temsilcileriyle iletişime geçin.

  1. Cerrahi bir anestezi düzlemini korumak için, hayvanı izofluran dağıtım sistemine bağlayın.
    NOT: Deneysel protokole bağlı olarak, mekanik ventilasyon gerekli olabilir (spontan ventilasyona kıyasla).
  2. 37 °C'lik bir çekirdek sıcaklığını korumak için rektal probu kullanarak hayvanın üzerine radyant bir ısıtma pedi yerleştirin.
    NOT: Bu protokolde, IVM tepsisinin etrafına oturan dikdörtgen bir köpük parçası, bir yalıtkan ve radyant ısıtma pedinin yerleştirileceği bir ara parça görevi görür (Şekil 4D).
  3. Objektif taretini istenen büyütme oranına ayarlayın ve gerektiği kadar daldırma yağı uygulayın. Bu protokolü takip etmek için 60x optik yakınlaştırmalı 1.30x/NA1 silikon yağı objektifini kullanın.
  4. Odak düzlemi tanımlandıktan sonra, karaciğerin kenarlarına yakın alanlardan kaçınarak ≥10 rastgele görüş alanı tanımlayın.
    NOT: Karaciğer, floresein izotiyosiyanat (FITC) kanalında otofloresan gösterdiğinden, genel odak düzlemini hızlı bir şekilde tanımlamak için epifloresan kullanın.
    1. Sisteme bağlı olarak, FITC kanalında epifloresan kullanarak görünür karaciğerin kenarlarını tanımlayın ve (x,y) aşama koordinatlarını kaydedin.
    2. Rastgele (x,y) koordinatları tanımlamak için karaciğerin (x,y) sınırlarını ve rastgele bir sayı üreteci kullanın. Kabul edilebilir bir görüş alanı için, (a) görüş alanı boyunca dağılmış gemilerin varlığını; (b) Aynı odak düzlemindeki gemilerin %≥80'i; ve (c) herhangi bir karaciğer kenarından uzakta ≥1 görüş alanı ( Şekil 6'daki örnek). Görüntü analizinin odak noktası hepatik sinüzoidlerdeki trombosit-lökosit-endotel etkileşimleri üzerindeyse, çapları ≥15 μm olan damarlara sahip alanları hariç tutun (murin sinüzoidleri tipik olarak ≤10 μm çapındadır).

7. Görüntü analizi

NOT: Bu makaledeki tüm görüntüleri işlemek için ImageJ/FIJI kullanılmıştır. FIJI (fiji.sc), Image J'nin (imagej.nih.gov) ek eklentiler ve makrolar13 kullanılarak daha fazla işlevselliğe sahip açık kaynaklı bir sürümüdür.

  1. Çok kanallı, zaman atlamalı dosyaları ImageJ/FIJI'de açın.
    NOT: Platforma bağlı olarak ek programlar/eklentiler gerekebilir. ImageJ/FIJI, Olympus'un .oir dosyaları gibi birden çok farklı dosya türünü açabilen bir Biyo-Format İçe Aktarıcıya sahiptir. Burada, daha yaygın olarak kullanılan bir format olduğu için dosyalar .tif dönüştürülmüştür.
  2. Doğru ölçeğin ayarlandığından emin olun; Meta verilerde/özelliklerde piksel/μm oranını ve zaman aralığını arayın.
  3. Arka plan gürültüsünü gidermek için farklı filtreler kullanın (örneğin, bu protokolde kullanılan 2 piksel yarıçaplı bir medyan filtre). İşlem sonrası varyasyonu en aza indirmek için işlemenin tüm görüntüler arasında benzer olduğundan emin olun. Bu deneylerde sayımlar ve uzunluklar karşılaştırılırken, ortalama floresan yoğunluğu yerine, netliği ve hücre-hücre etkileşimlerinin tanımlanmasını ve ölçülmesini iyileştirmek için filtreleyin.
    NOT: Filtrelerin kullanımı ve büyüklüğü, ilgilenilen hedef(ler)in boyutuna ve görüntülerdeki sinyal-gürültü oranına bağlı olacaktır.
  4. Vasküler yoğunlukta görüş alanları arasında heterojenlik olduğundan, seçim fırçasını kullanarak her alandaki toplam vasküler alanı ölçün (Şekil 7).
    1. Oval seçim aracını sağ tıklatın ve seçim fırçası aracını seçin.
    2. Seçim fırçası aracı simgesini çift tıklatarak fırçanın boyutunu ayarlayın.
    3. Vurgulamak/seçmek için gemilerin üzerinden geçin. Seçimin bazı kısımlarını silmek için [alt]-sol tıklamayı kullanın ve [shift]-sol tıklamayı kullanarak kısımları ekleyin.
    4. Seçilen alanı ölçmek için [M] düğmesine basın.
      NOT: Görüntü ölçeği uygun şekilde ayarlanmışsa, çıktı μm2 cinsinden olmalıdır, bu da mm2'ye dönüştürülür.
  5. Alandaki trombosit ve lökosit sayısını sayın. 30 saniye boyunca <1 hücre gövdesi hareket ettiren hücrelerin yapışık hücreler olduğunu düşünün. Mm başına hücre sayısını (trombositler ve / veya lökositler)hesaplayın 2.
  6. Her bir damar içindeki bağıl kan akışını tahmin etmek için, daha önce açıklandığı gibi ImageJ/FIJI'deki (imagescience.org/meijering/ yazılımı/mtrackj)14 MTrackJ eklentisini kullanarak bir vekil olarak ortalama kırmızı kan hücresi (RBC) hızını ölçün5. RBC'leri dekstran kanalındaki yuvarlak veya disk şeklindeki doldurma kusurları olarak tanımlayın. Kayıt tutma, eşzamansız analiz ve doğrulama için parçaları kaydedin.
    NOT: Bunun bir örneği Şekil 8 ve Ek Video S1'de gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Lökositin inflamasyonlu endotelyuma yapışmasında vimentin çubuk alanının etkisinin değerlendirilmesi
Lökosit P-selektin glikoprotein ligand-1 (PSGL-1) endotel ve trombosit P-selektine bağlanması, sepsis kaynaklı karaciğer hasarı inflamasyonunun akut fazı sırasında meydana gelir. Bununla birlikte, vimentinin (rhRod) rekombinant insan çubuk alanının P-selektine bağlandığı ve hem endotel hem de trombositlere lökosit yapışmasını bloke ettiği gösterilmiştir. Bu protokol, rhRod'un karaciğerde PSGL-1'e bağım...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yöntem makalesinin amacı, homeostatik koşullar altında ve endotoksin veya APAP uygulamasını takiben fare karaciğerinin yüksek çözünürlüklü intravital görüntülerini ve videolarını güvenilir bir şekilde yakalamak için gerekli adımları özetlemektir. Bu protokol, karaciğerdeki trombosit-lökosit-endotel etkileşimleri hakkında tutarlı veri üretimine izin vermiş olsa da, başarı için gerekli olan bir dizi kritik adımın yanı sıra bu görüntüleme paradigmasını kullanırken kaçınılması gereken pot...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu. İçerikler, ABD Gazi İşleri Bakanlığı'nın veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) ve NIH/NHLBI HL139425 (JC) tarafından desteklenmiştir. Araştırma desteği ayrıca NIH / NHLBI HL116524 tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
< güçlü > Cerrahi Malzemeler< / güçlü >
2 "x 2" dokunmamış süngerlerMcKesson Med. Surg92242000Karaciğer izolasyonu için
# 4-0 iğneli ipek örgülü sütürSOFSILKN/A4-0 Softsilk kaplı örgülü siyah, emilmez: C-1 kesme iğnesi
# 4-0 iğnesiz ipek örgülü sütürEthiconN/A4-0 Siyah örgülü ipek, emilmeyen
21 G künt iğne (0,5 inç)SAI İnfüzyon TeknolojileriB21-50Bu, ventilatöre bağlantıya izin vermek için trakeostomi tüpünün ucuna takmak için kullanılır. Alternatif bir kaynak Instech
23 G künt iğnedir (0,5 inç)SAI İnfüzyon TeknolojileriB23-50Bu, vasküler kateterin bir şırıngaya bağlantıya izin vermesi için kullanılır. Alternatif bir kaynak Instech
Diseksiyon Makası (Sivri Uçlu)Kent ScientificINS600393-GMikro Diseksiyon Makası; Karbür Bıçaklar; Düz; Keskin noktalar; 24 mm Bıçak Uzunluğu; 4 1/2" Toplam Uzunluk
McPherson-Vannas Mikro Makas (Vannas)Kent ScientificINS600124Bunlar trakea ve damarlardaki açıklıkları oluşturmak için kullanışlıdır
Polietilen boru 10InstechBTPE-10Bu, kateterin intravasküler kısmını yapmak için kullanılır. Alternatif bir kaynak BD Intramedic
Polietilen boru 50InstechBTPE-50Bu, kateterin ekstravasküler kısmını yapmak için kullanılır. Alternatif bir kaynak BD Intramedic
Polietilen boru 90InstechBTPE-90Bu, trakeostomi tüpünü yapmak için kullanılır. Alternatif bir kaynak BD Intramedic
USP sınıfı steril normal salinCoviden8881570121 Hospira% 0.0 Sodyum Klorür Enjeksiyonu, USP
< güçlü > Mikroskopi Malzemeleri< / güçlü >
İzofluran dağıtım sistemi ve ventilatörKent ScientificSomnosuiteKombinasyon kemirgen ventilatörü ve uçucu anestezik dağıtım sistemidir
Mikroskopi sırasında pedin ısıtılması için köpük ara parçasıN/AN/ABu ara parça yüksek kaliteli köpükten kesilmeli, karaciğer mikroskobu tepsisinin etrafına sığmalı ve belirli yükseklik boyutları mikroskop sistemine bağlıdır
Rezonans kafa tarayıcılı lazer taramalı konfokal mikroskop sistemiOlympusFV3000Her ne kadar bir rezonans kafa tarayıcı kullanarak bir Olympus FV3000'in kullanımını tanımlasak da, bu protokol çoğu görüntüleme sistemi ile çalışır
Karaciğer Mikroskobu TepsisiN/AN/AKaraciğer mikroskobu tepsisi, ters çevrilmiş bir mikroskop
Antikorlar ve İlgili Reaktifler
Parlak Menekşe 421/anti-fare Ly6G antikoruBioLegend1276283 & mikro; g/fare. Nötrofilleri etiketlemek için
BV421/F4/80 antikoruBioLegend1231320.75 mg/kg. Kupffer hücrelerini etiketlemek için
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su, kalsiyum veya magnezyum içermezGibco/ThermoFisher Scientific14190144Antikorlardan sodyum azidi uzaklaştırmak için diyalizat olarak kullanılır
DyLight649/anti-GPIbβ antikoremfret AnalyticsX6493 µ g/fare. Trombositleri etiketlemek için
DyLight488/anti-fare GPIbβ antikoremfret AnalyticsX4886 &mikro; g/fare. Trombositleri etiketlemek için
Escherichia coli serotype O111:B4Sigma-AldrichL30245 mg/kg'dan Endotoksin; Endotoksinin gücü partiden partiye değişebilir. Bu nedenle, endotoksin lotu
PerCP-eFluor 710 / anti-fare P-selektin antikoruInvitrogen46-0626-824 & mikro; g/fare. P-selektin etiketlemek için
Slide-a-Lyzer 7.000 MWCO kasetThermo Scientific66370Sodyum azidi uzaklaştırmak için antikorları diyaliz etmek için kullanılır
Texas Red etiketli dekstranSigma-AldrichT1287~ 150 kDa; 250 ve mikro; g/fare
TRITC/sığır serum albüminiSigma-AldrichA2289500 & mikro; g/fare. Normal tuzlu suda 50 mg / mL (% 5) stok konsantrasyonuna seyreltin. Damar sistemini etiketlemek için kullanılır. Enflamasyon sırasında interstisyel boşluğa yüksek moleküler ağırlıklı dekstrandan daha kolay sızabilir

Kaynaklar

  1. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, Suppl 1 19-23 (2005).
  2. Nolan, J. P. The role of intestinal endotoxin in liver injury: A long and evolving history. Hepatology. 52 (5), 1829-1835 (2010).
  3. Miyakawa, K., et al. Platelets and protease-activated receptor-4 contribute to acetaminophen-induced liver injury in mice. Blood. 126 (15), 1835-1843 (2015).
  4. Da, Q., Derry, P. J., Lam, F. W., Rumbaut, R. E. Fluorescent labeling of endogenous platelets for intravital microscopy: Effects on platelet function. Microcirculation. 25 (6), 12457(2018).
  5. Lam, F. W., et al. The vimentin rod domain blocks P-selectin-P-selectin glycoprotein ligand 1 interactions to attenuate leukocyte adhesion to inflamed endothelium. PLoS One. 15 (10), 0240164(2020).
  6. Shan, Z., et al. Chitinase 3-like-1 contributes to acetaminophen-induced liver injury by promoting hepatic platelet recruitment. eLife. 10, 68571(2021).
  7. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (1), 64-70 (2008).
  8. Pollenus, E., et al. Limitations of neutrophil depletion by anti-Ly6G antibodies in two heterogenic immunological models. Immunology Letters. 212, 30-36 (2019).
  9. Wang, J. X., et al. Ly6G ligation blocks recruitment of neutrophils via a β2-integrin-dependent mechanism. Blood. 120 (7), 1489-1498 (2012).
  10. Cunin, P., et al. Differential attenuation of β2 integrin-dependent and -independent neutrophil migration by Ly6G ligation. Blood Advances. 3 (3), 256-267 (2019).
  11. Weary, M. E., Donohue, G., Pearson, F. C., Story, K. Relative potencies of four reference endotoxin standards as measured by the Limulus amoebocyte lysate and USP rabbit pyrogen tests. Applied and Environmental Microbiology. 40 (6), 1148-1151 (1980).
  12. Kiers, D., et al. Comparison of different lots of endotoxin and evaluation of in vivo potency over time in the experimental human endotoxemia model. Innate Immunity. 25 (1), 34-45 (2019).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  15. Sierro, F., et al. A liver capsular network of monocyte-derived macrophages restricts hepatic dissemination of intraperitoneal bacteria by neutrophil recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  16. Guidotti, L. G., et al. Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8+ T cells. Cell. 161 (3), 486-500 (2015).
  17. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Frontiers in Immunology. 10, 2988(2020).
  18. Reif, R., et al. In vivo imaging of systemic transport and elimination of xenobiotics and endogenous molecules in mice. Archives of Toxicology. 91 (3), 1335-1352 (2017).
  19. Sloboda, D. D., Brooks, S. V. Treatment with selectin blocking antibodies after lengthening contractions of mouse muscle blunts neutrophil accumulation but does not reduce damage. Physiological Reports. 4 (1), 12667(2016).
  20. Lam, F. W., Da, Q., Guillory, B., Cruz, M. A. Recombinant human vimentin binds to P-selectin and blocks neutrophil capture and rolling on platelets and endothelium. Journal of Immunology. 200 (5), 1718-1726 (2018).
  21. Mossanen, J. C., Tacke, F. Acetaminophen-induced acute liver injury in mice. Laboratory Animals. 49, 30-36 (2015).
  22. Guerrero Munoz, F., Fearon, Z. Sex related differences in acetaminophen toxicity in the mouse. Journal of Toxicology. Clinical Toxicology. 22 (2), 149-156 (1984).
  23. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. European Journal of Histochemistry. 65 (4), 3337(2021).
  24. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
  25. Jost, A. P., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Trombosit L kosit Etkile imleriKaraci er Sin zoidleriAkut Karaci er HasarCanl Hayvan G r nt lemeMikrosirk lasyon nflamasyonuTromboz Modellerin Vivo G r nt leme
Video yakında

İlgili makaleler