Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Homolog rekombinasyon (HR), DNA çift sarmallı kırılmaların (DSB'ler), iplikler arası çapraz bağlantıların ve ssDNA boşluklarının onarımının yüksek doğrulukta bir mekanizmasının yanı sıra DNA hasar toleransı için bir yoldur. HR, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ve translezyon sentezi gibi DNA hasarı onarımı / toleransı için hataya eğilimli yollardan farklıdır, çünkü onarım olayını şablonlamak için donör olarak sağlam, homolog bir dupleks DNA kullanır. Dahası, İK yolundaki anahtar ara ürünlerin çoğu geri dönüşümlüdür ve bireysel yol adımlarının mükemmel bir şekilde düzenlenmesine izin verir. Hücre döngüsünün S, G2 ve M fazları sırasında İK, iki uçlu DSB'lerin^onarımı için NHEJ ile rekabet eder 1. Ek olarak, HR, ssDNA boşlukları ve tek taraflı DSB'ler de dahil olmak üzere replikasyonla ilişkili DNA hasarının onarımı için ve DNA lezyonu bypass^2'nin bir mekanizması olarak DNA replikasyonu için gereklidir.

HR yolundaki kritik bir ara madde, yer değiştirme döngüsü veya D-döngüsüdür (Şekil 1). Son rezeksiyonu takiben, reaksiyondaki merkezi rekombinaz, Rad51, kırık molekülün yeni rezeke edilmiş ssDNA'sına yüklenir ve sarmal bir filament² oluşturur. Rad51 daha sonra uygun bir homolog donörü, tipik olarak somatik hücrelerdeki kardeş kromatidini tanımlamak için bir homoloji araştırması yapar. D-döngüsü, Rad51-ssDNA filamenti homolog bir dubleks DNA'yı istila ettiğinde oluşur, bu da kırık ipliğin Watson-Crick baz eşleşmesine donörün tamamlayıcı ipliği ile eşleştirilmesine yol açar ve karşı donör ipliğinin yerini alır. Kırık ipliğin 3' ucunun bir DNA polimeraz ile uzatılması, DNA hasarı olayı sırasında kaybedilen bazların yerini alır ve genişletilmiş D-döngü ara ürününün senteze bağımlı iplik tavlama (SDSA), çift Holliday kavşağı (dHJ) veya kırılmaya bağlı replikasyon (BIR) HR alt yolları yoluyla bir dsDNA ürününe çözünürlüğünü teşvik eder.

İK yolundaki ara ürünleri fiziksel olarak izleyen testler, her adım için genetik gereksinimlerin analizine izin verir (yani, yol analizi). DSB oluşumu, uç rezeksiyon, dHJ'ler, BIR replikasyon kabarcıkları ve HR ürünleri, Güney lekelenmesi ^3,4,5,6,7 ile kolayca gözlenir. Bununla birlikte, Güney lekelenmesi yeni ortaya çıkan ve genişlemiş D-döngüleri hakkında rapor vermekte başarısız olmaktadır ve bu nedenle, bu eklem moleküllerini güvenilir bir şekilde ölçmek için alternatif bir yöntem gereklidir ^4,8,9. Gelişmekte olan D-döngü oluşumunu analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir strateji, Rad51'in kromatin-immünopresipitasyonu (ChIP) ve kantitatif PCR (qPCR) ^10,11'dir. Bununla birlikte, ChIP-qPCR ile ölçülen dsDNA ile Rad51 ilişkisi, dizi homolojisinden ve Rad51 aksesuar faktörü Rad54^{10,11'den bağımsızdır.} Buna karşılık, burada sunulan D-döngü analizi yöntemini kullanan ve D-döngü yakalama (DLC) testi olarak adlandırılan kayda değer bir sinyal, DSB oluşumuna, dizi homolojisine, Rad51'e ve Rad51 aksesuar proteinleri Rad52 ve Rad54^8'e bağlıdır. Saccharomyces cerevisiae Rad51-terfi eden D-döngü oluşumunun Rad54'e in vivo olarak bağlı olduğu bulgusu, Rad54'ün tomurcuklanan maya Rad51^{8,12,13,14,15} ile homoloji araştırması ve D-döngü oluşumu için gerekli olduğunu gösteren çok sayıda in vitro sulandırma deneyi ile ^uyumludur.

D-döngü uzantısını ölçmeye yönelik mevcut yaklaşımlar, öncelikle yarı kantitatif PCR yoluyla, benzer şekilde sorunludur. D-döngü uzantısını tespit etmek için tipik bir PCR tabanlı tahlil, bir kırılma bölgesi ile ektopik bir donör arasındaki rekombinasyondan ve müteakip rekombinasyonla ilişkili DNA sentezinden kaynaklanan, kırık iplikçik üzerindeki homoloji bölgesinin bir primer yukarı akışı ve donör iplikçik üzerindeki homoloji bölgesinin aşağı yönünde başka bir primer yoluyla benzersiz bir diziyi güçlendirir. Bu yöntemi kullanarak, rekombinasyonla ilişkili DNA sentezinin tespiti, gerekli olmayan Pol δ işlemsellik faktörü Pol32^16'yı gerektirir. Bu bulgu, POL32 delesyonunun in vivo¹⁷ gen transformasyonu üzerinde sadece hafif bir etkiye sahip olduğu gözlemiyle çelişmektedir. Dahası, bu PCR tabanlı analizler D-döngü uzantısını ve BIR ürün oluşumunu geçici olarak çözmekte başarısız olur, bu da sinyalin ssDNA yerine dsDNA ürünlerinden kaynaklandığını düşündürmektedir^17,18,19. D-döngü uzantısı (DLE) testi yakın zamanda bu tutarsızlıkları gidermek için geliştirilmiştir. DLE testi, ilk 3' istilacı uç^9'un aşağı yönünde ~ 400 baz çifti (bp) bir bölgede rekombinasyonla ilişkili DNA sentezini ölçer. Bu yöntemle, D-döngü uzantısı Pol32'den bağımsızdır ve DSB indüksiyonundan sonraki 4 saat içinde tespit edilebilirken, BIR ürünleri ilk olarak 6 saatte gözlenir. Nitekim, Haber ve Malkova laboratuvarlarından yeni bir yayın, genomik DNA'nın bu hazırlama yönteminin kullanılmasının tekil olarak ssDNA'nın korunmasıyla sonuçlandığını belirtmiştir ^9,20.

Burada, DLC ve DLE testleri ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu analizler, S. cerevisiae'de yeni ortaya çıkan ve uzatılmış D-döngülerini tespit etmek için yakınlık ligasyonuna dayanır (Şekil 2)^8,9. BIR ürünleri aynı tahlil sistemi kullanılarak ölçülebilir. Her iki tahlil için, kromozom (Chr.) V üzerindeki URA3 lokusunda bulunan bir HO endonükleaz kesim bölgesinde DSB oluşumu, galaktoz ile indüklenebilir bir promotörün kontrolü altında HO endonükleazın ekspresyonu ile indüklenir. Rad51 aracılı DNA iplikçik invazyonu, Chr. II'deki LYS2 lokusunda bulunan ektopik bir donörün yerinde yeni ortaya çıkan D-döngü oluşumuna yol açar. DSB'nin sağ tarafında donöre homoloji bulunmadığından, SDSA ve dHJ oluşumu yoluyla onarım mümkün değildir. DSB'nin BIR ile ilk onarımı mümkündür, ancak canlı ürünlerin oluşumu sentromer^21'in varlığı ile engellenir. Bu kasıtlı tasarım, üretken DSB onarımını önler, böylece onarılmış DBS'lere sahip hücreler tarafından büyümenin yeniden başlamasını önler, aksi takdirde zaman seyri analizi sırasında kültürü geçebilir.

DLC tahlilinde, D-döngüsü içindeki heterodupleks DNA'nın iki ipliğinin psoralen çapraz bağlanması, rekombinasyon ara maddesini korur. Kırık (rezeke edilmiş) iplikçik ve sindirim üzerinde kısıtlama enzim bölgesi restorasyonunu takiben, çapraz bağlama, homolog kırık ve donör DNA'ların yukarı yönündeki benzersiz dizilerin bağlanmasına izin verir. qPCR kullanılarak, her numunede bulunan kimerik DNA molekülünün seviyesi ölçülür. DLE testinde, çapraz bağlama gerekli değildir ve kısıtlama enzim bölgesi restorasyonu ve sindirimi ve ardından intramoleküler ligasyon bunun yerine kırık molekülün 5' ucunu yeni genişletilmiş 3' ucuna bağlar. Yine, qPCR, her numunedeki bu kimerik ürünün nispi miktarlarını ölçmek için kullanılır. Kısıtlama enzim bölgesi restorasyonunun yokluğunda, DLE testi, D-döngü uzantısını takiben oluşan BIR (dsDNA) ürününün göreceli seviyelerini rapor eder.

Vahşi tip bir suş kullanan her tahlil için temsili sonuçlar gösterilir ve okuyucular, rekombinasyon mutantlarının ^{analizi için} bu testlerin ^{kullanımı için Piazza} ve ark.8 ve Piazza ve ark.9'a yönlendirilir ^8,9. Bu katkının amacı, diğer laboratuvarların DLC ve DLE tahlillerini benimsemelerini sağlamaktır ve talep üzerine bunlara destek sağlanmaktadır.

1. Büyüme öncesi, DSB indüksiyonu ve numune toplama

NOT: Ade suşları için tüm ortamların %0,01 adenin ile desteklenmesi önerilir.

1. Maya pepton dekstroz adenin (YPDA) (% 1 maya ekstresi,% 2 pepon,% 2 glikoz,% 2 agar,% 0.001 adenin) üzerindeki uygun haploid suşları (bakınız Tablo 1) çizin ve 30 ° C'de 2 gün boyunca büyüyün.
2. 15 mL'lik bir cam kültür tüpünde 5 mL YPDA'yı aşılamak için tek bir koloni kullanın. Havalandırma için sallama veya dönme ile kültürleri 30 ° C'de doygunluğa kadar büyütün.
3. DLC testi: 5x psoralen stok çözeltisini (200 geçirmez etanolde 0,5 mg/mL trioksalen) bir duman davlumbazında, psoralen'i oda sıcaklığında gece boyunca sürekli çalkalama veya ters çevirme ile alüminyum folyoya sarılmış 50 mL'lik bir konik tüp içinde çözerek hazırlayın. Buharlaşmayı önlemek için vidalı üst kısmı şeffaf bir filmle kapatın. Psoralen uygun çözünmesini sağlamak için 50 mL konik tüp başına 7 mL'den fazla 5x psoralen stok çözeltisi hazırlamayın.
4. Ertesi gün, uygun büyüklükte bir şişede (tomurcuklanan maya, kültürün hacminin en az 5 katı olan bir şişede en uygun şekilde büyür) 50-100 mL YEP-laktat (% 1 maya ekstresi,% 2 pepton,% 2 w laktat,% 0.001 adenin) aşılamak için gece kültüründe yetiştirilen YPDA'nın 5 mL'sini kullanın. ~ 0.03'lük bir OD_600'e .
5. Kültürü 30 ° C'de ~ 16 saat boyunca 220 rpm'de sallayarak büyütün. ~ 16 saatten sonra, kültürün OD_600'ünü ölçün ve ~ 0.5-0.8 olmalıdır. Az veya aşırı büyümüş kültürleri kullanmayın.
6. Her zaman noktası için, uygun hücre hacmini konik bir tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Tipik olarak, bu, DLC testi için 1 x 10⁸ hücre (bir haploid vahşi tip suş için OD 600 1.0'da yaklaşık^7.5 mL kültür) ve DLE testi için 5 x 10 7 hücredir (OD₆₀₀ 1.0'da yaklaşık 2.5 mL kültür).
7. OD₆₀₀ değerlerinin doğruluğunu sağlamak için, OD okumasını 0,2 veya altında tutmak üzere OD₆₀₀≥0,2 olan kültürler için 1:5 seyreltmeler hazırlayın. Vahşi tip suşlar için, DLC analizi için en uygun zaman noktaları 2 saat ile 6 saat arasındadır ve DLE analizi için en uygun zaman noktaları 4 saat ile 8 saat arasındadır (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4).
8. DLC testi
   1. Her zaman noktasından önce, folyoya sarılı 50 mL'lik konik bir tüp içindeki tüm numuneler için bir duman davlumbazında yeterli miktarda 1x psoralen çözeltisi (0.1 mg / mL trioksalen, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0,% 20 etanol) hazırlayın. RT'de bırakın.
   2. Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj yapın. Peleti bir duman davlumbazında 2,5 mL 1x psoralen çözeltisinde yeniden askıya alın ve 60 mm x 15 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Alternatif olarak, çapraz bağlamasız bir kontrol için peleti 2,5 mL TE1 çözeltisinde (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) yeniden askıya alın.
   3. Örnekleri çapraz bağlayın. Uzun dalga (365 nm) ampullerle uyumlu bir UV çapraz bağlayıcı için, Petri kaplarını UV ışık kaynağının 1-2 cm altına yerleştirin ve kapak -20 ° C'de önceden soğutulmuş plastik veya pleksiglas bir plakanın üzerine çıkarılmış olarak yerleştirin. Bir UV ışık kutusu için, Petri kaplarını doğrudan UV ışık kaynağının üzerine yerleştirin. Numuneleri hafifçe sallayarak 10 dakika boyunca maruz bırakın.
      NOT: UV ışık kaynağının ~ 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörüngesel çalkalayıcının üzerine ayarlanması önerilir.
   4. Bir duman davlumbazında, numuneyi yeni bir 15 mL tüpe aktarın. Petri kabını 2,5 mL TE1 çözeltisi ile durulayın ve bunu tüpe ekleyin. Numuneleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj edin, süpernatanı uygun şekilde atın ve peleti -20 ° C'de saklayın.
9. DLE testi
   1. Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj yapın. Spini tekrarlamadan ve peletleri -20 ° C'de saklamadan önce hücre peletini 2,5 mL soğuk TE1 çözeltisinde yıkayın. Numuneler bir sonraki adıma geçmeden önce 1 haftaya kadar saklanabilir.
10. 0 saatte numune toplamak için,% 20 galaktoz ilavesinden önce örnekleri toplayın. Sonraki zaman noktaları için, kültürlere% 20 galaktoz ekleyerek% 2'lik bir nihai konsantrasyona DSB oluşumunu indükleyin. Kalan örnekleri yukarıda açıklandığı gibi toplayın, pelet ve DSB indüksiyonu sonrası zamana göre dondurun (yani, 4 saatlik örnek,% 20 galaktoz ilavesinden 4 saat sonra toplanır).

2. Hücre sferoplastı, lizis ve restriksiyon bölgesi restorasyonu

1. Örnekleri buz üzerinde çözün. Kuru bir banyoyu önceden 30 ° C'ye ısıtın.
2. Numuneleri 1 mL sferoplast tamponda (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM sodyum fosfat tamponu pH 7,2, 0,5 mM MgCl₂) yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. 3.5 μL zymolyase çözeltisi ekleyin (% 2 glikoz, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mg / mL zymolyase 100T; 17.5 μg / mL zymolyase nihai konsantrasyonu). Dokunarak veya ters çevirerek hafifçe karıştırın. 15 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin ve ardından buzun üzerine yerleştirin. 15 dakikalık inkübasyon sırasında sıvı azot veya kuru buz elde edin.
4. 4 °C'de 2.500 x g'de 3 dakika santrifüj yapın ve numuneleri buz üzerine yerleştirin. Numuneleri 1 mL sferoplast tamponda 3 kat yıkayın. Numuneleri 4 °C'de 2.500 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
5. Numuneleri 1 mL soğuk 1x kısıtlama enzim tamponunda (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat, RT'de 100 μg/mL BSA pH ~8.0) yeniden askıya alın ve 4 °C'de 16.000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Örnekleri buzun üzerine yerleştirin. Yıkamayı 1x tekrarlayın.
6. Numuneleri 1 mL soğuk 1x kısıtlama enzim tamponunda yeniden askıya alın. Numuneyi (her biri 0,5 mL) iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne bölün. Numuneleri 4 °C'de 16.000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
7. Her numuneden bir tüpü hibridize oligolarla 180 μL 1.4x kısıtlama enzim tamponunda (bakınız Tablo 2) ve oligoları hibridize etmeden 180 μL 1.4x kısıtlama enzim tamponunda bir tüpü yeniden askıya alın. Her hibridize edici oligo, 1x TE'de (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) yeniden askıya alınır ve 7 nM'lik bir son konsantrasyonda kullanılır. 1x TE, oligoları hibridize etmeden 1.4x kısıtlama enzim tamponundaki hibridize oligoların yerini alır.
   NOT: Hibridize oligolar, çalışma seyreltmesinde küçük alikotlarda -20 ° C'de saklanmalıdır. Hibridize oligoların konsantrasyonu optimizasyon gerektirebilir; bkz: Tartışma.
8. Numuneleri sıvı azot veya kuru buz/etanol içinde çıtçıtla dondurun ve -80 °C'de saklayın. Örnekler bu aşamada birkaç ay saklanabilir.

3. Restriksiyon enzim sindirimi ve intramoleküler ligasyon

1. Örnekleri buz üzerinde çözün. Bir kuru banyoyu önceden 65 ° C'ye, diğerini 37 ° C'ye ısıtın.
2. Pipet 36 μL numuneyi buz üzerinde yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dönüştürür. Kalan numuneyi depolama için derhal -80 ° C'ye iade edin.
3. 4 μL% 1 SDS (% 0.1 nihai konsantrasyon) ekleyin ve tüpün kenarına hafifçe dokunarak karıştırın. Her 5 dakikada bir hafifçe dokunarak 15 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin. Kuluçkadan hemen sonra buz üzerine numuneler yerleştirin.
   NOT: Bu SDS tedavisi, DNA ile ilişkili proteinlerin denatürasyonunu, nükleer zarfın çözünmesini ve kısıtlama enzimi sindirimi ve molekül içi ligasyon adımlarından önce kromatin erişilebilirliğini teşvik eder.
4. 4,5 μL %10 Triton X-100 (%1 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Her numuneye 20-50 U kısıtlama enzimi (EcoRI-HF veya HindIII-HF) ekleyin ve her 20-30 dakikada bir nazik ajitasyonla 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu süre zarfında, kuru bir banyoyu 55 ° C'ye önceden ısıtın ve bir su banyosunu 16 ° C'ye önceden ayarlayın.
5. Her numuneye 8,6 μL %10 SDS (%1,5 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ve kılavuzlama yoluyla karıştırın. 10 dakika boyunca 55 °C'de inkübe edin. Her numuneye 80 μL %10 Triton X-100 (%6 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
6. Her numuneye ATP'siz 660 μL 1x ligasyon tamponu (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,_2.5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA ligaz (8 U/numune) ekleyin ve nazik ters çevirerek karıştırın. Her 30 dakikada bir ters çevirme ile 1,5 saat boyunca 16 °C'de inkübe edin. Örnekleri inkübasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirin.

4. DNA saflaştırma

1. Bir kuru banyoyu önceden 65 ° C'ye, diğerini 37 ° C'ye ısıtın. Her numuneye 1 μL 10 mg/mL proteinaz K (1x TE pH 8.0'da hazırlanmış) ekleyin (12.5 μg/mL nihai konsantrasyon). 65 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve numuneleri soğuyana kadar inkübasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirin.
2. Numuneleri 2 mL tüplere aktarın. Bir davlumbazda çalışırken, her numuneye eşit miktarda (~800 μL) fenol/kloroform/izoamil alkol (P/C/IA; pH 8.0) ekleyin. Numuneleri ~ 30 s vortekste edin ve numuneleri bir mikrosantrifüjde 16.000 x g'de 5-10 dakika boyunca santrifüj yapın.
3. Her numunenin üst fazının 600 μL'sini yeni bir 1,5 mL'lik tüpe dikkatlice çıkarın. Alt fazı ve 2 mL tüpleri uygun şekilde atın.
4. Her numuneye 1/10 hacim 3 M sodyum asetat pH 5.2 (~60 μL) ekleyerek DNA'yı çökeltin, ardından 1 hacim izopropanol (~ 660 μL). Numuneleri 5x-10x ters çevirin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
5. Numuneleri 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin ve ardından numuneleri bir mikrosantrifüjde 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.500 x g'de santrifüj yapın. Numuneleri buza geri döndürün, süpernatanı dökün ve tüpü bir kağıt havluya boşaltın.
6. DNA peletini 200 μL% 70 etanol ile yıkayın. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 16.500 x g'de santrifüj yapın, numuneleri tekrar buzun üzerine yerleştirin, süpernatanı dökün ve kalan alkolü bir pipetle çıkarın. Numuneleri, tüplerin kapakları 37 °C'de 15-20 dakika açık olacak şekilde kurulayın.
7. DNA peletlerini vorteks yaparak 50 μL 1x TE'de yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın, girdap yapın ve daha sonra 30 dakika boyunca kuru bir banyoda 37 ° C'de inkübe edin. Örnekleri tekrar vorteksleyin ve sonra buzun üzerine yerleştirin. Numuneler bu aşamada birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir, ancak çapraz bağlama (yalnızca DLC) ve qPCR adımları için hemen devam etmeniz önerilir.

5. Psoralen çapraz bağlantı tersine çevirme (yalnızca DLC testi için)

1. Pipet 9 μL saflaştırılmış DNA, buz üzerindeki bir PCR tüpüne dönüşür. 1 μL 1 M KOH (0,1 M nihai konsantrasyon) ekleyin. Numuneleri bir termosiklusta 30 dakika boyunca 90 ° C'de inkübe edin.
2. 19.73 μL sodyum asetat çözeltisi ekleyin (0.1 M sodyum asetat, 9.6 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.0 mM EDTA pH 8.0). Numuneler bu aşamada birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir, ancak hemen qPCR adımına geçmeniz önerilir.

6. Kantitatif PCR, kontroller ve analiz

1. Çapraz bağlantılı veya çapraz bağlanmasız 2 μL saflaştırılmış DNA kullanarak, üreticinin talimatlarına göre 20 μL qPCR reaksiyonu ayarlayın. Her reaksiyonu çift olarak ayarlayın. Hem DLC hem de DLE tahlilleri için, beş kontrol reaksiyonu ve bir DLC / DLE niceleme reaksiyonu veya numune başına toplam altı reaksiyon çift olarak çalıştırılır. Ek Tablo S1 ve Ek Tablo S2 , bu reaksiyonları ve analizleri ayarlamak için bir şablon sağlar ve qPCR primerlerinin dizileri Tablo 3'te listelenmiştir.
2. qPCR bisiklet koşullarının her qPCR kiti için optimize edilmesi gerekir.
   1. Kullanılan qPCR kitlerine bağlı olarak aşağıdaki DLC qPCR koşullarını kullanın: ilk denatürasyon (3 dakika boyunca 95 °C); 50 tur amplifikasyon (15 s için 95 °C, 25 s için 61 °C, tek bir kazanımla 15 s için 72 °C); erime eğrisi analizi (5 s için 95 °C, 1 dakika için 65 °C, sürekli kazanım ile 97 °C); ve soğutma (30 s için 37 ° C).
   2. DLE testi için aşağıdaki qPCR koşullarını kullanın: ilk denatürasyon (5 dakika boyunca 95 °C); 50 tur amplifikasyon (15 s için 95 °C, 30 s için 60 °C, tek bir kazanımla 15 s için 72 °C); erime eğrisi analizi (5 s için 95 °C, 1 dakika için 65 °C, sürekli kazanım ile 97 °C); ve soğutma (30 s için 37 ° C). Farklı qPCR makineleri/kitleri için optimizasyonun gerekli olabileceğini unutmayın.
3. DLC testi
   1. Denetimler: Tablo 3'teki qPCR primerlerinin listesine bakın. Astar bağlanma bölgelerinin bir haritası Şekil S1'de gösterilmiştir. İlgili genomik özellikler ve amplikonlar için ek dizi dosyaları için, A plazmid Düzenleyicisi (ApE) dosyalarını kontrol edin; Ek Sıra Dosyaları 1-5.
      1. ARG4'te Genomik DNA: ARG4'te bulunan dsDNA'yı yükseltmek için olWDH1760 / olWDH1761 kullanın. Bu reaksiyonu bir yükleme kontrolü olarak kullanın ve bu kontrole DLC sinyal reaksiyonu dışındaki diğer tüm reaksiyonları normalleştirin.
      2. DAP2'de intramoleküler ligasyon verimliliği: DLC ligasyonuna paralel olarak intramoleküler ligasyon için EcoRI sindirimi tarafından oluşturulan 1.904 bp fragmanını kullanın. Bu ligasyon kavşağı boyunca amplifikasyon, molekül içi ligasyon verimliliğini bildirir ve DLC sinyalinin normalleştirildiği bir kontrol görevi görür.
      3. DSB indüksiyonu: İndüklenen DSB'yi kapsayan bir bölgeyi yükseltmek için olWDH1766/olWDH1767 kullanın.
      4. Psoralen çapraz bağlama ve rezeksiyon: EcoRI tanıma alanının aşağısındaki benzersiz PhiX bölgesini yükseltmek için olWDH2019/olWDH2020 kullanın. Çapraz bağlantı tersine çevirme olmadan, çapraz bağlama verimliliğini belirlemek için ARG4 (çapraz bağlı dsDNA) üzerindeki ssDNA (çapraz bağlanma yok) oranını kullanın. Çapraz bağlantının tersine çevrilmesi ile rezeksiyon, ARG4'e göre sinyalin 1'inden 0.5'ine aşamalı bir düşüşe yol açacaktır.
      5. EkoR I tanıma alanı restorasyonu ve kesme: Rezeke edilen iplikçik üzerinde DSB'nin yukarı yönünde restore edilmiş EcoRI tanıma bölgesini kapsayan bir bölgeyi büyütmek için olWDH1768/olWDH1764 kullanın. olWDH1769/olWDH1763, DAP2'deki EcoRI kısıtlama enzim bölgesini kapsayan bir bölgeyi güçlendirir. İntramoleküler ligasyon kontrolü olarak kullanmak için bu bölgede EcoRI bölünmesi yapın.
   2. DLC sinyali: Rezeke edilmiş (istilacı) ipliğin ve donörün intramoleküler ligasyonu ile oluşturulan kimerik DNA molekülünü yükseltmek için olWDH1764 / olWDH1765 kullanın.
   3. Analiz: Yinelenen reaksiyonların her biri için Cp değerlerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın. Diğer tüm kontrol qPCR'lerini normalleştirmek için ARG4 genomik DNA qPCR Cp değerlerini referans olarak kullanın. DAP2'deki molekül içi ligasyon kontrolüne DLC sinyalini normalleştirin. 2 saatte tipik DLC sinyal değerleri için Şekil 3'e bakınız.
4. DLE testi
   1. Denetimler: Tablo 3'teki qPCR primerlerinin listesine bakın. Astar bağlanma bölgelerinin bir haritası Şekil S1'de gösterilmiştir. İlgili genomik özellikler ve amplikonlar için ek dizi dosyaları için, A plazmid Düzenleyicisi (ApE) dosyalarını (Ek Dizi Dosyaları 1-5) kontrol edin.
      1. ARG4'te genomik DNA: Bölüm 6.3.1.1'e bakınız.
      2. YLR050C'de molekül içi ligasyon verimliliği: DLE ligasyonuna paralel olarak intramoleküler ligasyona tabi tutulacak 765 bp'lik bir fragman oluşturmak için HindIII sindirimini kullanın. Bu ligasyon kavşağı boyunca amplifikasyon, molekül içi ligasyon verimliliğini bildirir ve DLE sinyalinin normalleştirildiği bir kontrol görevi görür.
      3. DSB indüksiyonu: Bkz. bölüm 6.3.1.3.
      4. Arjantin III tanıma bölgesi restorasyonu ve kesimi: Sırasıyla rezeke edildiği ve uzatıldığı kırık iplikçik üzerindeki HindIII kısıtlama enzim bölgelerini kapsayan bir bölgeyi büyütmek için olWDH2010/olWDH2012 ve olWDH2009/2011 kullanın.
   2. DLE sinyali: DSB'nin istilacı iplikçik yukarı akışının rezeke edilmiş ucunun DSB'nin yeni genişletilmiş uç aşağı akışına intramoleküler ligasyonu ile oluşturulan kimerik DNA molekülünü yükseltmek için olWDH2009 / olWDH2010 kullanın.
   3. Analiz: Yinelenen reaksiyonların her biri için Cp değerlerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın. Diğer tüm kontrol qPCR'lerini normalleştirmek için ARG4 genomik DNA qPCR Cp değerlerini referans olarak kullanın. DLE sinyalini YLR050C'deki molekül içi ligasyon kontrolüne normalleştirin. 6 saatteki tipik DLE sinyal değerleri Şekil 4 ve önceki yayınlar^9'da bildirilmiştir.

DLC testi
DLC testi, bölgeye özgü bir DSB'nin tek bir donöre invazyonuyla oluşan hem yeni ortaya çıkan hem de genişletilmiş D-döngülerini tespit eder (Şekil 2). Psoralen çapraz bağlanması, kırık ipliği ve donörü D-döngüsü içindeki heterodubleks DNA aracılığıyla fiziksel olarak bağlar. Kırılmanın rezeke edilmiş ipliği üzerinde uzun, hibridize edici bir oligo ile restriksiyon enzim bölgesi restorasyonu, restriksiyon enzim bölünmesine izin verir, ardından qPCR ile ölçülen bir kimerik ürün oluşturmak için kırık ipliğin proksimal donöre bağlanmasına izin verir. Özellikle, DLC sinyali psoralen çapraz bağlama, hibridize oligo, merkezi rekombinaz, Rad51 ve Rad51 aksesuar faktörleri Rad52 ve Rad548'e bağlıdır. DNA helikazlar / topoizomeralar Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 ve Srs2'nin silinmesi, DLC sinyalinin artmasına neden olur.

Şekil 3 , DSB indüksiyonu sonrası 2 saat içinde standart vahşi tip suşu için temsili sonuçları, oligo ile ve hibridize etmeden üçlü olarak göstermektedir. Önemli bir adımda, psoralen çapraz bağlamada eksik olan bir örnek de kopya olarak gösterilir.

Şekil 3'te gösterildiği gibi, psoralen çapraz bağlama kritik bir adımdır. 8 olmadan pratik olarak tespitedilebilir bir sinyal yoktur. Çapraz bağlama verimliliği, ssDNA'nın dsDNA amplifikasyonuna oranına göre ölçülür. dsDNA'dan farklı olarak, ssDNA minimal psoralen çapraz bağlama yaşar ve bu nedenle yüksek bir sinyal başarılı çapraz bağlamayı gösterir. Çapraz bağlama verimliliği, numune toplama ve qPCR hazırlığı arasındaki süreye bağlı olarak değişir (Şekil 3, sol alt panel). Numune toplama ve hazırlama arasında ne kadar fazla zaman olursa, çapraz bağlama verimliliği qPCR kontrolü için o kadar az sinyal gözlenecektir. Çapraz bağlama verimliliği qPCR kontrolü için gözlenen sinyaldeki önemli örnekler arası varyasyon endişe kaynağıdır ve zaman seyri atılmalıdır.

ARG4 Cp değerleri, hibridize edici oligo örnekleri arasında benzerdir (Şekil 3, sol üst panel). Düşük bir Cp değeri, daha fazla amplififiye edilebilir DNA'nın mevcut olduğunu gösterir. Bu, çapraz bağlama olmayan örnekler için ARG4 Cp değerlerinin neden önemli ölçüde daha düşük olduğunu açıklar: çapraz bağlama, qPCR amplifikasyonuna müdahale eder. Çapraz bağlamalı ve çapraz bağlanmayan örnekler arasındaki bu fark, ssDNA/çapraz bağlı olmayan dsDNA'yıyükseltecek olan EcoR I bölünme qPCR kontrolü dışındaki tüm qPCR'ler için geçerlidir. DLC sinyali değil, tüm qPCR kontrolleri ARG4 qPCR sinyaline normalleştirilir.

Tüm numuneler için, intramoleküler ligasyon qPCR kontrolü uygun aralıktadır (Şekil 3, üst orta panel) ve HO endonükleaz tanıma bölgesi boyunca yükselen qPCR kontrolü için düşük sinyalle kanıtlandığı gibi sağlam DSB indüksiyonu vardır (Şekil 3, sağ üst panel). Hibridize oligo numunelerinde, verimli EcoRI kesimi gözlenir ve bu qPCR kontrolü düşük sinyal verir (Şekil 3, alt orta panel). Tersine, çapraz bağlama örnekleri ile hibridize edici oligo, çapraz bağlama verimliliği qPCR kontrolü için gösterilene benzer şekilde yüksek bir sinyal verir, çünkü bu durumda, kesilmemiş ssDNA, ARG4 qPCR sinyaline (dsDNA) yükseltilir ve normalleştirilir.

Diğer qPCR'lerin aksine, DLC testi için qPCR sinyali, DLC qPCR tarafından ölçülen kimerik molekül ligasyona bağlı olduğundan, molekül içi ligasyon qPCR kontrolüne normalleştirilir. Hibridize oligo ile 2 saatte medyan DLC sinyali, bu tahlil8 için daha önce yayınlanmış sonuçlara uygun olarak 0.030 ± 0.0055'tir (Şekil 3, sağ alt panel). Beklendiği gibi, bu sinyal hem hibridize edici oligo hem de psoralen çapraz bağlanmasına bağlıdır.

DLE testi
DLE testi, sahaya özgü bir DSB'ye yanıt olarak D-loop uzantısının doğru bir şekilde izlenmesini sağlar (Şekil 2). DLE sinyalinin, iplik istilasına aracılık eden ve bu nedenle rekombinasyonla ilişkili DNA sentezi9 için gerekli olan reaksiyondaki merkezi rekombinaz olan Rad51'e bağlı olduğu daha önce gösterilmiştir. Ek olarak, DLE sinyali Pol δ, Pol3'ün (DR, AP, WDH, yayınlanmamış veriler) katalitik alt birimine bağlıdır, ancak gerekli olmayan işlemsellik faktörü Pol32'ye bağlı değildir. DSB indüksiyonundan sonra ilk olarak 2 saat sonra tespit edilebilen DLC sinyalinin aksine, DLE sinyali ilk önce DSB indüksiyonundan sonraki 4 saatte gözle görülür şekilde artar, 4 saat ile 6 saat arasında çarpıcı bir şekilde yükselir ve bundan sonra platolaşmaya başlar, 6 saat ile 8 saat arasındaki sinyal artışının çoğu BIR ürün oluşumuna atfedilebilir8, 9.

DLE testinde ölçülen kimerik ligasyon ürünü tek sarmallı olduğundan, hücre sferoplastı ve lizis adımı kritik öneme sahiptir. Azalmış DLE sinyali, nükleazları serbest bırakabilecek ve hedef ssDNA'nın bozulmasına yol açabilecek bu adımdaki sorunlardan kaynaklanabilir.

Şekil 4 , DSB indüksiyonundan 6 saat sonra standart vahşi tip suşu için temsili sonuçları göstermektedir. Oligoları hibridize etmeden vahşi tip numune tek başına dsDNA BIR ürününü temsil ederken, oligo ile sinyal hem genişletilmiş D-döngüsünün ssDNA'sından hem de dsDNA BIR ürününden türetilir. Başarısız bir deneyin örneği olarak üçüncü bir örnek dahil edilmiştir.

ARG4 Cp değerleri, hibridize edici oligoların örnekleri arasında benzerdi (Şekil 4, sol üst panel). ARG4 Cp değerleri, başarısız numune için belirgin şekilde daha düşüktü, bu da bu numunenin başarılı örneklerden daha fazla genomik DNA'ya sahip olduğunu gösteriyordu. qPCR kontrolleri için qPCR sinyalleri, ancak DLE sinyali değil, ARG4 qPCR sinyaline normalleştirildi. İntramoleküler ligasyon qPCR kontrolü, hibridize oligos örnekleri için kabul edilebilir bir sinyal (~ 0.15-0.35 arasında), ancak başarısız numune için önemli ölçüde daha düşük bir sinyal ortaya koymuştur (Şekil 4, üst-orta panel). Bu başarısız örnekte, ARG4 qPCR kontrolü ile belirtilen yüksek miktarda genomik DNA, muhtemelen moleküller arası ligasyonun başarısız olmasına neden olmuştur, çünkü yüksek konsantrasyonda genomik DNA, moleküller arası ligasyona yol açacaktır.

Her üç örnekte de sağlam DSB indüksiyonu vardı (Şekil 4, sağ üst panel). Arjantin Hem rezeke edilmiş hem de uzatılmış iplikçiklerdeki III bölünmesi, hibridize edici oligoların varlığına bağlıdır. Genişletilmiş iplikçikte, ayrıca D-döngü uzantısına da bağlıdır. Bu nedenle, oligo içeren ve olmayan oligo örnekleri arasındaki rezeke edilmiş iplikçikteki Hind III bölünme bölgesi boyunca amplifikasyonda anlamlı bir fark vardı (Şekil 4, sol alt panel) ve bu örnekler arasındaki genişletilmiş iplikçikteki HindIII tanıma bölgesi boyunca amplifikasyonda daha küçük bir fark vardı (Şekil 4, alt-orta panel).

DLE sinyali intramoleküler ligasyona bağlı olduğundan, intramoleküler ligasyon qPCR kontrolüne normalize edilir. Hibridize oligolarla 6 saatte medyan DLE sinyali, bu tahlil9 için daha önce yayınlanmış sonuçlarla tutarlı olarak 0.53 ± 0.17 (Şekil 4, sağ alt panel) idi. Oligoları hibridize etmeden vahşi tip numune için DLE sinyali, bu önceki yayınla benzer şekilde uyumluydu. DLE sinyali, başarısız numune için beklenenden daha düşüktü ve muhtemelen yukarıda belirtilen numuneyle ilgili sorunları yansıtıyordu.

Çapraz bağlantı tersine çevirme
dsDNA'daki ApT / TpA baz çiftleri arasında interkale edilen psoralen, furan ve piron halkaları aracılığıyla UV ışınlaması üzerine birbirine zıt timin bazlarından birine veya her ikisine kovalent olarak bağlanabilir ve sırasıyla (ağırlıklı olarak furan) mono-adducts veya inter-strand di-adducts (yani, çapraz bağlantılar) ile sonuçlanır. Bu modifikasyonların DNA polimerazın ilerlemesini bloke etmesi ve böylece kantitatif PCR'nin ayrılmaz DNA sentez reaksiyonunu inhibe etmesi beklenir. Sonuç olarak, çoğu dsDNA şablonu güçlendirilemez (Şekil 5A, B). Buna karşılık, ssDNA'daki baz çiftlerinin yokluğu, onu psoralen çapraz bağlanmasına daha az eğilimli hale getirir. Bu nedenle, ssDNA'nın dsDNA'ya karşı göreceli niceliğini ve farklı uzunluklardaki dsDNA amplikonlarını ve ApT / TpA içeriğini bozan dsDNA'dan daha kolay çoğaltılır (Şekil 5A, B). Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, kantitatif PCR'den önce psoralen çapraz bağlantı tersine çevirme adım23'ün baz ve ısı katalizörlü bir tersine çevrilmesi uygulanmıştır. Bu yöntem sadece piron tarafı mono-adducts23,24 küçük türlerini bırakır. Genomik dsDNA ve intramoleküler ligasyon kontrol amplikonlarının 80 kat geri kazanımına yol açtı, bu da şablon moleküllerin büyük çoğunluğunun en az bir furan tarafı monoadduct veya iplikler arası çapraz bağlantıya sahip olduğunu gösteriyor (Şekil 5B, C). Çapraz bağlantı tersine çevrilmesinden önce ve sonra dsDNA genomik DNA kontrolünün Cp değerlerinin karşılaştırılması, burada gösterilen aralıkta olması gereken çapraz bağlama verimliliğinin bir tahminini sağlar. Kısa amplikonların ötesinde, bu yordam 3 kb uzunluğa kadar şablonları geri yükleyebilir (Şekil S2). ssDNA amplikonu için, ssDNA'ya çapraz bağlanan psoralen eksikliği ile tutarlı bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 5B-D). Ayrıca, çapraz bağ tersine çevirme prosedürünün DNA23'e tespit edilebilir şekilde zarar vermediğini göstermektedir. Çapraz bağlı olmayan bir ds-ssDNA segmentine (50 bp ve 118 bp / nt; Şekil 5A) dsDNA ve ssDNA amplikonlarınınkine orta düzeydeydi ve iyileşmede 8 kat iyileşme gösterdi (Şekil 5B, C). Çapraz bağlantı tersine çevrilmesi, iki dsDNA amplikonunun göreceli seviyelerini etkilemedi, intramoleküler ligasyon kontrolü genomik DNA kontrolüne göre 0.2-0.25 aralığında kaldı (Şekil 5E). Bununla birlikte, dsDNA genomik DNA kontrolüne göre ssDNA amplikonunun göreceli miktarını, bir dsDNA şablonuna göre bir ssDNA için beklenen 0.5 kat fazlalıktan 40 kat fazlalığa değiştirdi (Şekil 5D). Benzer şekilde, kısmen ssDNA DLC sinyali, dsDNA intramoleküler ligasyon kontrollerine göre 6.6 x 10−2'den 6.6 x 10−3'e düşmüştür (Şekil 5F). Bu, DSB indüksiyonundan 4 saat sonra bu yaklaşımla tespit edilen kromozomlar arası bir donördeki D-döngü eklem moleküllerinin sayısını, hücre popülasyonundaki toplam kırık moleküllerin ortalama% 1.3'ü olarak tahmin etmemize yol açmaktadır. Bu tür mutlak tahminler, dsDNA'nın psoralen-bazlı çarpıtılması ve ssDNA amplifikasyonu ile yapılamadı, bu da bu ek çapraz bağlantı tersine çevirme adımının değerini vurguladı.

Şekil 1: Homolog rekombinasyon ve çözünürlük alt yolakları. Bir veya iki uçlu bir DSB (gösterilmiştir) veya bir ssDNA boşluğu ile sonuçlanan DNA hasarını takiben, DNA uçlarının 5' ila 3' rezeksiyonu, Rad51 filamentinin üzerinde oluştuğu 3' ssDNA çıkıntılarını ortaya çıkarır. Rad51 daha sonra genomu, onarım olayını şablonlamak için sağlam bir dubleks DNA (yani donör) için arar. Bu süreç, kırık iplikçik Watson-Crick bazının, çift sarmallı DNA donörünün tamamlayıcı ipliği ile eşleştiği, karşı ipliğin yerini aldığı ve yeni ortaya çıkan D-döngüsünü oluşturduğu DNA iplikçik istilası ile sonuçlanır. Bu D-döngüsü, Rad51 homoloji araştırmasının farklı bir donör seçmesine izin vermek için tersine çevrilebilir veya DNA hasarı olayı sırasında kaybedilen bazların yerini almak için bir DNA polimeraz tarafından genişletilebilir. Bu genişletilmiş D-döngü ara ürününü bir ürüne dönüştürmek için üç İK alt yolu mevcuttur. İlk olarak, genişletilmiş D-döngüsü bir helikaz tarafından bozulabilir ve senteze bağımlı iplik tavlama (SDSA) adı verilen bir işlemde kırılmanın yeni genişletilmiş ucunun ikinci uca tavlanmasına izin verir. Dolgu DNA sentezi ve ligasyonu daha sonra ürün oluşumuna yol açar. Alternatif olarak, kırılmanın ikinci ucu, yer değiştirmiş donör ipliğine tavlanabilir ve bir çift Holliday kavşağı (dHJ) oluşturabilir. dHJ'nin nükleolitik çözünürlüğü ya bir crossover (CO) ya da crossover olmayan (NCO) ile sonuçlanırken, dHJ çözünmesi (gösterilmemiş) sadece NCO ürünleri ile sonuçlanır. Son olarak, DSB'nin ikinci ucunun devreye sokulmaması, binlerce baz çiftinin donörden kırık ipliğe kopyalandığı mutajenik bir süreç olan kırılmaya bağlı replikasyon (BIR) ile sonuçlanır. Bu işlem, yakınsak replikasyon çatalına veya kromozomun sonuna kadar uzanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: D-döngü yakalama (DLC), D-döngü uzantısı (DLE) ve kırılma kaynaklı replikasyon (BIR) ürün oluşturma tahlillerinin öncülü. DSB oluşumu, GAL1 promotörünün kontrolü altında bölgeye özgü bir endonükleaz tarafından yönlendirilir. DSB indüksiyonu, yeni ortaya çıkan bir D-döngüsünün oluşumuna yol açar. DLC testinde, DNA'nın iplikçikler arası çapraz bağlanması bu yapıyı korur ve daha sonra ekstrakte edilir. Restriksiyon enzim bölgesi restorasyonu, uzun bir oligonükleotid ile hibridizasyon yoluyla elde edilir ve daha sonra DNA, kantitatif PCR (qPCR) ile nicelleştirilebilen bir ürün oluşturmak için sindirilir ve bağlanır. DLE testi, DNA'nın çapraz bağlı olmaması ve bunun yerine, molekül içi ligasyon ürününün, kırılmanın bir tarafındaki ssDNA'nın iki ucu arasında oluşması bakımından farklıdır, 3' ucu bir DNA polimeraz tarafından uzatılmıştır. qPCR yine kimerik ligasyon ürününün oluşumunu ölçmek için kullanılır. DLE testi ile D-döngü uzantısının tespiti de aynı şekilde kısıtlama enzim bölgesi restorasyonu gerektirir. Buna karşılık, çift sarmallı BIR ürünü, hibridize edici oligonükleotidler olmadan DLE tahlil primerleri kullanılarak tespit edilir. R, bir kısıtlama enzim bölgesinin enzim bölünmesi için yetkin olduğunu gösterir; (R) kesilemeyen bir kısıtlama enzim bölgesini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: DSB indüksiyonundan 2 saat sonra D-döngülerinin DLC tahlil analizinden elde edilen temsili sonuçlar. Örnekler, bu protokolde açıklandığı gibi qPCR tarafından toplanmış, hazırlanmış ve analiz edilmiştir. Mavi semboller, n = 3 için hibridize edici oligolarla standart vahşi tip suş için sonuçları temsil eder. Yeşil semboller, n = 3 için oligoları melezleştirmeden vahşi tip suş için sonuçları temsil eder. Kalın kırmızı çizgi medyanı gösterir. Mor semboller, psoralen çapraz bağlantısı olmayan, ancak n = 2 için hibridize edici oligolara sahip örnekleri temsil eder. Semboller, örneklerin aynı kültürden türetildiğini gösterir. Çapraz bağlama verimliliğindeki deneyler arası farklılıklar, belirli qPCR kontrollerine değişkenlik getirebilir, ancak bir deney içindeki bu qPCR kontrollerinde örnekler arası değişkenlik olmadığı sürece sorunlu değildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: DSB indüksiyonu sonrası 6 saat DLE tahlil analizinden elde edilen temsili sonuçlar. Örnekler, bu protokolde açıklandığı gibi qPCR tarafından toplanmış, hazırlanmış ve analiz edilmiştir. Mavi semboller, n = 3 için hibridize edici oligolarla standart vahşi tip suş için sonuçları temsil eder. Yeşil semboller, n = 3 için oligoları melezleştirmeden vahşi tip suş için sonuçları temsil eder. Kalın kırmızı çizgi medyanı gösterir. Melezleştirici oligoların örneklerinin aynı kültürlerden türetildiğini unutmayın. Mor elmas, n = 1 için oligoları melezleştirmeden başarısız bir numuneyi temsil eder. Semboller, örneklerin aynı kültürden türetildiğini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Psoralen çapraz bağının tersine çevrilmesinden elde edilen temsili sonuçlar . (A) Psoralen-DNA mono-adducts (*) ve inter-strand crosslinks (X) özellikle dsDNA üzerinde meydana gelir ve ssDNA şablonlarının aksine, DNA polimerazlar tarafından amplifikasyonunu önler. Bu fark, dsDNA ve ssDNA içeren şablonların qPCR ile nicelleştirilmesinde bir önyargı ortaya çıkarmaktadır. Bu önyargı, psoralen çapraz bağlantısının tersine çevrilmesiyle aşılabilir. (B) DSB indüksiyonundan 4 saat sonra elde edilen dsDNA (genomik, ligasyon), ssDNA ve karışık ds-ssDNA (DLC) amplikonlarının temsili Cp değerleri. Veriler bireysel değerleri ve dört biyolojik kopyanın medyanını temsil eder. (C) (B)'deki Cp değerlerinden hesaplanan çapraz bağlantı tersine çevrilmesi üzerine amplifikasyon geri kazanımı. (D) Psoralen çapraz bağlantı tersine çevrilmesi ile ve psoralen olmadan genomik dsDNA kontrolüne göre ssDNA amplifikasyonu. Tersine çevrildikten sonra, ssDNA amplikonu genomik dsDNA kontrolünün beklenen 0.5'inde çoğalır. (E) Psoralen çapraz bağ tersine çevrilmiş ve psoralen olmadan genomik dsDNA kontrolüne göre dsDNA intramoleküler ligasyon kontrolü. (F) dsDNA ligasyon kontrolüne göre DLC sinyali. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Mevcut DLC/DLE tahlil sistemi ve önerilen değişiklikler. Yukarıda: Mevcut DLC / DLE tahlil mola yeri ve donör gösterilmiştir. Aşağıda: DLC/DLE tahlil mola sahasında ve donörde planlanan değişiklikler. (I) 117 bp HO endonükleaz kesim bölgesi sarı renkle gösterilir. D-döngü bozulmasını izlerken kafa karıştırıcı etkileri önlemek için, HOcs'un (74 bp) sol tarafı donöre sokulacaktır, böylece ikisi arasındaki rekombinasyon, 3' flebi olmayan mükemmel bir D-döngüsü oluşturur. (II) Sistemi onarılabilir hale getirmek ve böylece daha fizyolojik, donöre homolog DNA (deniz mavisi ve leylak ile belirtilir) HOcs'un sağ tarafına yerleştirilecektir. (III) HOcs'un sağındaki iplikçik tarafından istila ve uzatma, kırılmanın o tarafına özgü diziler kullanılarak izlenecektir (turuncu renkle gösterilir). (IV) Donöre özgü ek eşit aralıklı kısıtlama enzim bölgeleri ve dizileri, D-döngü uzantısının (HOcs'un sol tarafından invazyon yoluyla ) daha uzak bölgelerde izlenmesine izin verecektir. Bu modifiye sistemde, deniz mavisi veya leylakta gösterilen bölgelerde senteze bağımlı iplik tavlama (SDSA) veya çift Holliday bağlantı (dHJ) oluşumu meydana gelebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: DLC ve DLE tahlillerinde kullanılan qPCR primerlerinin haritası. DLC ve DLE tahlillerinde analiz için kullanılan genomik lokusların, bunların ilgili özelliklerinin ve yaklaşık primer bağlanma bölgelerinin haritası (qPCR primerlerinin listesi için Tablo 3'e bakınız). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: Büyük amplikonlarda çapraz bağ tersine çevrilmesinin nitel değerlendirmesi. Genomik DNA, protokolde açıklandığı gibi, bölüm 1-5'te belirtildiği gibi, çapraz bağlı veya çapraz bağlı olmayan örneklerden hazırlanmıştır. Kantitatif olmayan PCR, kırılma bölgesi ile donör arasında paylaşılan homoloji bölgesini kapsayan 3 kbp segmentini arttırmak için kullanıldı. Çapraz bağlı ve çapraz bağlı olmayan DNA arasındaki amplifikasyon verimliliğindeki farklılıklar ve sınırlı miktarda numune nedeniyle, giriş DNA'sını standartlaştırmanın mümkün olmadığını unutmayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: DLC ve DLE tahlil analizi için kullanılan S. cerevisiae suşu. Bu çalışmada kullanılan haploid tomurcuklanan maya suşunun genotipi. Suş talep üzerine temin edilebilir. DLC / DLE tahlil analizi için mevcut ek suşlar Piazza ve ark.8 ve Piazza ve ark.9'da bulunabilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: DLC ve DLE tahlil analizi için kullanılan hibridize oligonükleotidler. DLC ve DLE tahlillerinde kullanılan uzun, hibridize edici oligonükleotidlerin dizileri. Özel oligonükleotid sağlayıcısı tarafından hibridize oligonükleotidlerin ilave SDS-PAGE saflaştırılması önerilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: DLC ve DLE tahlil analizi için kullanılan qPCR primerleri. qPCR astarı, DLC ve DLE tahlilleri ve amaçlarının açıklamaları için çiftleşir. olWDH1764, olWDH2009 ve olWDH2010'un iki qPCR'de kullanıldığını unutmayın. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: DLC testi qPCR kurulumu ve analizi için şablon. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S2: DLE testi qPCR kurulumu ve analizi için şablon. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Sıra Dosyaları 1-5. İlgili genomik özellikler ve amplikonlar için ek dizi dosyaları. Sıra dosyaları ApE dosya biçimindedir; ApE, DNA dizilerini görüntülemek ve düzenlemek için ücretsiz olarak kullanılabilen bir yazılımdır. ApE dosyaları ayrıca tüm büyük dizi düzenleme yazılımlarıyla uyumludur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.