Method Article

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin dış sinyallere cevap verme yeteneği, hücresel gelişim, büyüme ve hayatta kalma için gereklidir. Ortamdan gelen bir sinyale yanıt vermek için, bir hücre onu tanıyabilmeli ve işleyebilmelidir. Bu görev esas olarak, rolü sinyalleri hücrenin biyokimyasal diline dönüştürmek olan membran reseptörlerinin işlevine dayanır. G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), insanlarda membran reseptör proteinlerinin en büyük ailesini oluşturur. GPCR'ler arasında, metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR'ler), zorunlu dimerler olarak işlev gören ve ligand bağlanma bölgesini içeren geniş bir hücre dışı alana sahip benzersiz bir alt sınıftır. mGluR'lerin yapısal çalışmalarındaki son gelişmeler, aktivasyon süreçlerinin anlaşılmasını geliştirmiştir. Bununla birlikte, aktivasyon ve modülasyon sırasında mGluR'ler yoluyla büyük ölçekli konformasyonel değişikliklerin yayılması tam olarak anlaşılamamıştır. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), biyomoleküllerin yapısal dinamiklerini tek protein seviyesinde görselleştirmek ve ölçmek için güçlü bir tekniktir. mGluR2 aktivasyonunun dinamik sürecini görselleştirmek için, reseptörlerin doğal yapısını bozmadan bölgeye özgü protein etiketlemesine izin veren doğal olmayan amino asit (UAA) entegrasyonuna dayanan floresan konformasyonel sensörler geliştirilmiştir. Burada açıklanan protokol, yeni UAA etiketleme yaklaşımı, numune hazırlama ve smFRET veri toplama ve analizi dahil olmak üzere bu deneylerin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Bu stratejiler genelleştirilebilir ve çeşitli membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini araştırmak için genişletilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazma zarı boyunca bilgi aktarımı büyük ölçüde membran reseptörlerinin işlevine bağlıdır1. Bir reseptöre bağlanan ligand, konformasyonel bir değişikliğe ve reseptör aktivasyonuna yol açar. Bu süreç genellikle doğada allosteriktir2. 800'den fazla üyesi olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), insanlarda membran reseptörlerinin en büyük ailesidir3. Neredeyse tüm hücresel süreçlerdeki rolleri nedeniyle, GPCR'ler terapötik gelişim için önemli hedefler haline gelmiştir. GPCR sinyallemesinin kanonik modelinde, agonist aktivasyonu, daha sonra Gα nükleotid bağlanma cebinde GTP için GDP değişimi yoluyla heterotrimerik G protein kompleksini aktive eden reseptörün konformasyonel değişiklikleriyle sonuçlanır. Aktive edilen Gα-GTP ve Gβγ alt üniteleri daha sonra aşağı akış efektör proteinlerinin aktivitesini kontrol eder ve sinyal kaskadın 4,5'i yayar. Bu sinyal verme işlemi esas olarak ligandların reseptörün üç boyutlu şeklini değiştirme yeteneğine bağlıdır. Ligandların bunu nasıl başardığına dair mekanik bir anlayış, yeni terapötikler geliştirmek ve sentetik reseptörler ve sensörler tasarlamak için kritik öneme sahiptir.

Metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR'ler) C sınıfı GPCR ailesinin üyeleridir ve glutamatın yavaş nöromodülatör etkileri ve nöronal uyarılabilirliğin ayarlanması için önemlidir 6,7. Tüm GPCR'ler arasında, C sınıfı GPCR'ler, zorunlu dimerler olarak işlev görmeleri nedeniyle yapısal olarak benzersizdir. mGluR'ler üç yapısal alan içerir: Venüs flytrap (VFT) alanı, sistein bakımından zengin etki alanı (CRD) ve transmembran alanı (TMD)8. Aktivasyon işlemi sırasındaki konformasyonel değişiklikler karmaşıktır ve 12 nm mesafeye yayılan yerel ve küresel konformasyonel kuplajın yanı sıra dimer kooperatifçiliğini de içerir. Ara konformasyonlar, devletlerin zamansal sıralaması ve devletler arasındaki geçiş hızı bilinmemektedir. Bireysel reseptörlerin konformasyonunu gerçek zamanlı olarak takip ederek, geçici ara durumları ve aktivasyon sırasında konformasyonel değişikliklerin sırasını tanımlamak mümkündür. Bu, mGluR2 11'in aktivasyonu sırasında konformasyonel değişikliklerin yayılımını görselleştirmek için yakın zamanda uygulandığı gibi, tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi 9,10 (smFRET) uygulanarak elde edilebilir. FRET deneylerinde önemli bir adım, donör ve alıcı floroforların ilgili proteine bölgeye özgü yerleştirilmesiyle FRET sensörlerinin üretilmesidir. Sisteinsiz mutantların oluşturulmasını veya genetik olarak kodlanmış büyük bir etiketin eklenmesini gerektiren tipik bölgeye özgü floresan etiketleme teknolojilerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için doğal olmayan bir amino asit (UAA) birleştirme stratejisi 12,13,14,15 benimsenmiştir. Bu, mGluR2'nin ligand bağlama ve sinyal alanlarını birleştiren temel kompakt allosterik bağlayıcının konformasyonel olarak yeniden düzenlenmesinin gözlenmesine izin verdi. Bu protokolde, bakır katalizörlü azid siklizasyon reaksiyonunu kullanarak floroforları bağlamak için mGluR2'nin UAA ile sahaya özgü etiketlenmesi yaklaşımı da dahil olmak üzere, mGluR2 üzerinde smFRET deneyleri gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sunulmaktadır. Ayrıca, bu protokol membran proteinlerinin doğrudan yakalanması ve veri analizi için metodolojiyi açıklamaktadır. Burada özetlenen protokol, diğer membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini incelemek için de geçerlidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün genel iş akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.

1. Numune odasının hazırlanması

  1. Sürgü ve kapak kayması temizliği
    NOT: Bu adımlar, kızakların yüzeylerini ve kapak kaymalarını temizlemeyi ve bunları aminosilanizasyona hazırlamayı amaçlamaktadır. Yüzeye bağlı moleküller üzerinde tek moleküllü floresan deneyleri yapmak için kritik bir gereklilik, pasifleştirilmiş bir yüzeydir. En güvenilir ve tekrarlanabilir pasivasyon tekniği, inert polimer zincirlerinin cam yüzeye yoğun bir tabaka olarak kovalent olarak tutturulmasını içerir. Polietilen glikol (PEG), yüzey pasivasyonu için kullanılan en verimli polimerdir16. PEG (PEGylation) kullanan pasivasyon prosedürünün ayrıntıları aşağıda açıklanmıştır:
    1. Kızaklarda delinecek delikleri bir işaretleyici ile işaretleyin (~6 mm uzakta ve kenardan uzakta). Cam kızak üzerinde küçük delikler (1 mm çapında) açmak için bir Dremel kullanın. Sondaj işlemi sırasında kaydırakları suya batırın.
    2. İşaretçiden kalan mürekkebi çıkarmak için slaytları asetonla yıkayın.
    3. Asetondan çıkarın ve slaytları suyla durulayın, ardından yüksek güçte (700 W) suda 5 dakika boyunca mikrodalgada pişirin.
    4. Slaytları, sonikleştirilecek bir cam vitray kavanoza koymadan önce suyla temizleyin. Kapak kapaklarını farklı bir boyama kavanozuna yerleştirin.
    5. Slaytları ve kapakları asetonda 30 ° C'de bir banyo sonikatöründe 23 dakika boyunca sonikleştirin.
    6. Bu arada, bir sonraki adımda kullanılan aminosilantizasyon çözeltisini hazırlamak için bir cam şişeyi temizleyin. Şişeyi 1 M KOH ile doldurun, şişeyi 30 dakika boyunca sonikleştirin, KOH'yi suyla iyice durulayın ve ardından metanol içinde 30 dakika daha sonikleştirin. Şişeyi aminosilantizasyon adımına kadar metanol içinde bırakın.
    7. Bu arada, aminosilan, mPEG ve biotin-PEG'i dondurucudan (-20 ° C) çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığına (RT) gelmelerine izin verin.
    8. Asetonu slayttan ve kapaklı kavanozlardan uygun kimyasal atık kabına atın, suyla iyice durulayın ve ardından slaytları 30 dakika boyunca 5 M KOH'da sonikleştirin.
    9. Slaytları ve örtüleri suyla durulayın ve ardından 2 dakika boyunca metanol içinde sonikasyon yapın (iki kez tekrarlayın). Kavanozları metanol ile dolu olarak aminosilizasyon adımına kadar bırakın.
      NOT: Bu çalışmada, aksi belirtilmedikçe deiyonize su kullanılmıştır. 23 ° C'de çalışan bir banyo sonicator kullanılır.
  2. Aminosilantizasyon
    NOT: Bu adım, aminosilanı temiz sürgü ve kapak kayması yüzeyine kovalent olarak bağlamayı amaçlamaktadır. İşlevselleştirilmiş mPEG ve biotin-PEG bir sonraki adımda bu yüzeye kovalent olarak bağlanacaktır.
    1. Temiz bir şişede bir aminosilantasyon karışımı hazırlayın (adım 1.6). Metanol (150 mL), asetik asit (7,5 mL, cam pipet kullanın) ve aminosilan (2,5 mL) karıştırarak çözeltiyi hazırlayın.
    2. Çözeltiyi kimyasal duman davlumbazında yavaşça karıştırın, ardından sürgü ve kapak kayması kavanozlarına dökün. Kapak fişleri için 50 mL ve slaytlar için 100 mL kullanın. Kızakların ve kapak kaymalarının çözeltiye tamamen daldırıldığından emin olun.
    3. 10 dakika boyunca inkübe edin, daha sonra kavanozları 1 dakika boyunca sonikleştirin (sonikasyon yüzeydeki safsızlıkları giderir) ve 10 dakika daha kuluçkaya yatırın.
    4. Aminosilatörizasyon çözeltisini atık toplama kabına atın. Kavanozlara metanol ekleyin, kavanozları kapaklarla kapatın ve elle hafifçe sallayın. Metanolü atın ve kavanozları suyla doldurun.
    5. Aminosilan şişeyi dondurucuya geri koyun (-20 ° C).
  3. PEGilasyon
    NOT: Bu adımlarda PEGylation yordamı açıklanmaktadır.
    1. Aminosilanizasyon sırasında, pegilasyon tamponunu hazırlayın. 84 mg sodyum bikarbonat (NaHCO3) tartın ve 10 mL suya (10 mM) ekleyin. Ek olarak, mPEG ve biotin-PEG'i tartın ve bir kenara koyun. Altı slayt ve kapak kapağı için 96 mg mPEG ve 1.2-2.4 mg biotin-PEG kullanın.
      NOT: Arka plan noktalarının sayısını artırabileceğinden çok fazla biotin-PEG eklememek önemlidir. PEG karışımını slaytlara uygulamadan hemen öncesine kadar eritmeyin.
    2. Slaytları suyla durulayın, hafif bir hava üfleme ile kurutun ve ardından nemlendirilmiş montaj kutularına yerleştirin.
      NOT: Temiz bir havayolu kullanmak önemlidir. Camda kalıntı bırakabilecek basınçlı konserve hava kullanmaktan kaçının.
    3. PEG toz karışımına pegilasyon tamponu ekleyin ve çözünmesi için yavaşça birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Slayt başına 55 μL pegilasyon tamponu ekleyin (altı slayt için 330 μL pegilasyon tamponu ekleyin).
    4. Çözünmemiş parçacıkları çökeltmek için 23 ° C'de 1 dakika boyunca 9.600 x g'de santrifüj yapın. Bir sonraki adımda kullanmak üzere süpernatantı toplayın.
      NOT: Biotin-PEG, NHS grubunun varlığı nedeniyle hızla hidrolize olur. Karıştırma ve santrifüjleme adımlarını hızlı bir şekilde yapmak önemlidir.
    5. Her slayta 60 μL PEGilasyon çözeltisi uygulayın ve ardından PEGilasyon çözeltisinin slayt ve kapak kayması arasına sıkıştırılması için kapak kaymasını üstüne yerleştirin.
      NOT: Kızak ve kapak kayması arasına kabarcıklar sokmaktan kaçının, çünkü bu pasivasyon verimliliğini azaltacaktır. Kapak kaymasını ve sürgüyü pipet ucuyla ayarlayarak kabarcıkları çıkarın.
    6. Slaytları düz ve karanlık bir çekmeceye yerleştirin. Slaytlar gece boyunca saklanabilir; Bununla birlikte, 4-6 saat boyunca inkübasyon optimum pasivasyon ile sonuçlanır.
      NOT: Hangi tarafın pegile edildiğini hatırlamak önemlidir.
    7. Depolamadan önce pegile edilmemiş tarafı işaretleyin. Kuluçkadan sonra, slaytları ve kapakları yavaşça sökün ve suyla iyice durulayın.
    8. Slaytları ve kapakları hava üfleyerek kurulayın. Kızakları ve kapak kaymalarını, PEGile edilmiş yüzey birbirinden uzağa bakacak şekilde steril bir tüp (50 mL) içinde tutun. Deney gününe kadar -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Slaytları ve kapak fişlerini hazırlandıktan sonraki 4 hafta içinde kullanmak en iyisidir. PEGile edilmiş yüzeyler birbirinden uzağa bakmalıdır. PEGile edilmiş slaytların ve kapak kapaklarının vakumla kapatılmış torbalarda saklanması raf ömrünü uzatabilir.

2. Doğal olmayan amino asit, floresan etiketleme ve ekstraksiyon içeren mGluR2 ekspresyonu

NOT: Bu protokol, UAA 4-azido-L-fenilalanin (AZP) içeren mGluR2'yi eksprese etmek için hücrelerin hazırlanmasını, reaktiflerini ve tedavisini özetlemektedir. Prosedür, 18 mm cam kapaklar üzerinde yetiştirilen HEK293T hücreleri içindir. Prosedür gerektiğinde büyütülebilir.

  1. Tohumlama
    NOT: DMEM'deki HEK293T hücrelerini, (v/v) fetal sığır serumu, 100 ünite·mL−1 penisilin-streptomisin ve 15 mM HEPES tamponu (Ek Dosya 1) (pH 7.4) ile %5 CO2 altında 37 °C'de saklayın.
    1. Hücreleri% 0.05 tripsin-EDTA ile geçirin. Poli-L/D-lizin (PLL/PDL) cam kapaklar üzerindeki tohum HEK293T hücreleri, transfeksiyon sırasında %≥80 akıcılığa ulaşacak şekilde kayar.
  2. Transfeksiyon
    1. 0,1 M NaOH'de 40 mM'lik bir AZP stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Büyüyen hücreler ve mGluR2 ekspresyonu için AZP takviyeli ortam hazırlayın. 40 mM AZP stok çözümü kullanarak ek standart ortam (+ FBS, kalem/strep, 15 mM HEPES). Son AZP konsantrasyonunu 0,6 mM'ye getirin. 1 M HEPES çözeltisi ekleyin (40 mM AZP stok çözeltisinin hacminin yarısı eklendi). Örneğin, 10 mL AZP takviyeli ortam hazırlamak için 9,775 mL standart ortam, 150 μL 40 mM AZP stok çözeltisi ve 75 μL 1 M HEPES çözeltisini birleştirin.
    3. Bir şırınga filtresi (0,2 μm, PES) kullanarak ortamı filtreleyin (sterilize edin).
    4. Transfeksiyondan önce standart ortamı AZP takviyeli ortam içeren ortamlarla değiştirin.
      NOT: Ortamın değiştirilmesi sırasında hücreleri kurutmamaya dikkat edin.
    5. Hücreleri transfeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosu) ile üreticinin el kitabını izleyerek transfekte edin. Toplam 2 μg DNA (1000 ng tRNA/sentetaz + 1000 ng amber kodon içeren protein plazmidi) kullanılarak 18 mm'lik bir kapak parçası üzerindeki Transfect HEK293T hücreleri. Kullanılan bileşenlerin konsantrasyonu ve hacmi için Tablo 1'e bakınız.
    6. Transfeksiyondan 24 saat sonra medyayı taze AZP takviyeli ortama değiştirin ve hücrelerin 24 saat daha büyümesine izin verin.
  3. Alkinli siyanin boyalarla etiketleme
    1. Etiketlemeden 20 dakika önce, kapak kapaklarını iki kez ılık (37 °C) kayıt arabelleği (RB) (Ek Dosya 1) ile yıkayın ve AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES) içermeyen sıcak (37 °C) standart ortama taşıyın.
    2. Cy3-alkin, Cy5-alkin, BTTES, bakır (II) sülfat (CuSO4), (+) sodyum L-askorbat ve aminoguanidin içeren etiketleme çözeltisini hazırlayın.
    3. Çözüm oluşturma ve ekleme sırasını takip edin (Tablo 2):
      1. 50 mM BTTES hazırlayın.
      2. 100 mM aminoguanidin hazırlayın.
      3. 100 mM Na-askorbat hazırlayın.
      4. 655.5 μL RB hazırlayın.
      5. RB'ye Cy3/Cy5 alkin boyası (DMSO stokunda 10 mM) ekleyin.
        NOT: RB'ye aminoguanidin ekleyin.
      6. 20 mM CuSO4 hazırlayın.
      7. CuSO4 ve BTTES'i yeni bir tüpte karıştırın (çözelti maviye dönecektir).
      8. CuSO4 ve BTTES karışımını RB'ye ekleyin (2.3.3.6.)
      9. Na-Askorbat'ı ekleyin.
      10. 18 mm'lik bir kapak kayması için aşağıdaki Tablo 2'de verilen hacmi takip edin.
    4. Çözeltiyi iyice karıştırın ve hücreleri etiketlemeden önce 10 dakika boyunca buz üzerinde ve karanlıkta inkübe edin.
    5. Etiketleme solüsyonunu kapak kapaklarına eklemeden önce, ortamı çıkarın ve RB ile yıkayın. Etiketleme solüsyonunu ekleyin ve karanlık koşullarda 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    6. NOT: Etiketlemeyi iyileştirmek için, 10 dakika sonra glutamat (son konsantrasyon ~ 0,5 mM) ekleyin ve 5 dakika daha inkübe edin. Bakır hücreler için çok toksiktir ve etiketleme reaksiyonu in vivo olarak 15 dakikadan fazla devam etmemelidir. Tüm bileşenleri taze hazırlayın. En son Na-Askorbat ekleyin. Hazırlanırken reaksiyonu 4°C'de tutun. Bununla birlikte, etiketleme çözeltisinin eklenmesi üzerine, hücreler inkübatörün içinde 37 ° C'de saklanmalıdır.
  4. Hücrelerin toplanması ve proteinlerin çıkarılması (hücre lizisi)
    1. Etiketleme solüsyonunu çıkarın ve mGluR2 transfekte edilmiş hücreleri içeren kapak kapağını (18 mm) RB ile iki kez yıkayın.
    2. Bir pipet kullanarak, hücreleri kapak kapağından yıkayın ve RB'de (1 mL) yeniden askıya alın.
      NOT: Bu noktadan sonra numunenin ışığa maruz kalmasını mümkün olduğunca en aza indirin.
    3. 4 °C'de 1.000 x g'de 5 dakika dönerek hücreleri pelet edin ve süpernatanı çıkarın. Hücre peletini lizis çözeltisinin 80-130 μL'sinde yeniden askıya alın.
      NOT: Hücre peleti gözle görülebilmelidir. Lizis hacmi, etiketleme ve yıkama işlemi sırasında kaybedilen numune miktarına bağlıdır.
    4. Peleti parçalamak için pipetle hafifçe karıştırın. Folyoyu sarın ve hücreleri lize etmek için 4 ° C'de rocker'ın üzerine 0.5-1 saat boyunca yerleştirin.
    5. Çözünmeyen fraksiyonu 20.000 x g ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet edin. Süpernatantı taze bir soğuk tüpe (floresan olarak etiketlenmiş proteini içeren lize protein) aktarın ve deneyler için buz üzerinde saklayın.

3. Tek moleküllü akış odası montajı ve işlevselleştirme

  1. Sürgüyü ve kapak kapağını dondurucudan çıkarın ve karanlıkta RT'de ısınmalarını bekleyin (~ 30 dakika).
  2. Kızak ve kapak kayması arasında çift taraflı bant şeritlerini sandviçleyerek odacığı çift taraflı bant kullanarak monte edin. PEGile edilmiş yüzeylerin akış odasının içini oluşturduğundan emin olun.
  3. Bir pipet ucu kullanarak, bandın hem kapak kayması hem de kızak ile tam temas ettiğinden emin olmak için kapak kapağına basın; kapak fişini kırmamaya dikkat edin. Slaytların kenarlarına epoksi uygulayın.
    NOT: Delinen deliklere epoksi dolacak kadar fazla şey eklemeyin.
  4. Epoksinin kurumasını sağlamak için akış odasını kapak kayması tarafı aşağı bakacak şekilde nemlendirilmiş karanlık bir kutuya yerleştirin (~ 30 dakika).
    NOT: Epoksinin kurutma süresi boyunca delikleri (10-15 μL) kaplamasını önlemek için delinmiş deliklerden T50 tamponu (Ek Dosya 1) ekleyin.
  5. Her bir bölme şeridini 500 nM Neutravidin (T50'de seyreltilmiş) ile her şeride yavaşça ~40 μL uygulayarak inkübe edin.
  6. RT'de nemlendirilmiş karanlık bir kutunun içinde 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Şerit başına ~100 μL T50 tampon ile yıkayın.
  7. Her hazne şeridini 20 nM biyotinillenmiş antikor11 ile inkübe edin. Antikor seçimi, protein üzerindeki etikete bağlıdır.
    NOT: Birincil antikor biyotinile edilmemişse, önce biyotinile sekonder antikor ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra birincil antikor ile inkübe edin.
  8. RT'de nemlendirilmiş karanlık bir kutunun içinde 30 dakika boyunca kuluçkaya yatın. Şerit başına ~200 μL T50 ile yıkayın.
    NOT: Hazırlık işlemi sırasında şeritlerin asla kurumadığından emin olun.

4. Tek moleküllü tamponlar

  1. Trolox tampon
    NOT: Trolox tamponu, görüntüleme tamponu oluşturmak için başlangıç tamponudur. Tamponun bileşenleri deneye bağlıdır ve ilgilenilen proteine bağlı olarak değişebilir. Burada açıklanan protokolde kullanılan tampon, tuzları (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), tamponlama maddesini (HEPES) ve Trolox'u (pH ~ 7.35) içerir.
    1. 9-10 mg Trolox'u 10 mL tek moleküllü kayıt tamponunda çözün (SRB, Ek Dosya 1)
      NOT: Trolox tamponu hafif asidik hale getirir. Bu aşamada pH'ı sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi, 10 M (pH 7.35) kullanarak ayarlayın. İnce pH ayarı, Trolox tamamen çözüldükten sonra yapılacaktır; Bununla birlikte, bu noktada pH'ın arttırılması, Trolox'un çözünürlüğünü arttırır.
    2. Trolox'u tamamen çözmek için çözeltiyi RT'de 4-8 saat boyunca (alüminyum folyoya sarılı) bir tezgah üstü rocker kullanarak karıştırın.
    3. PH'ı kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.
    4. Trolox'un tamamen çözündüğünden emin olun. Çözeltiyi bir şırınga filtresi ile sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Arabellek 2-10 günlük yaşlanmadan sonra kullanılmalıdır. Trolox yanıp sönmeyi bastırmaya yardımcı olur ve tek moleküllü çalışmalarda yaygın olarak kullanılır17. Göz kırpmayı önleyici özellikler, Trolox18'in oksitlenmiş bir türevinden gelir; Bu nedenle, olgunlaşması için RT'de en az birkaç saat tutulması önerilir. Ek olarak, taze Trolox çözeltisinin UV radyasyonu oksidasyon sürecini hızlandırır ve Trolox tamponu18'in "yaşlanmasını" hızlandırmak için kullanılabilir.
  2. Görüntüleme tamponu tarifi: Trolox tamponu + deterjan (deterjanın CMC değerinin ~2 katı) + 4 mM protokateçuik asit (PCA) karıştırın.
    NOT: Yüksek deterjan konsantrasyonları protein denatürasyonunun artmasına neden olabileceğinden deterjan konsantrasyonu CMC'nin yakınında tutulur. Örneğin, aşağıdaki karışım 955 μL Trolox + 5 μL% 10 DDM + kolesterol (W% 10: 1) + 40 μL 100 mM PCA stok çözeltisi kullanılabilir. Burada, PCA bir antioksidan ajan olarak işlev görür ve daha önce smFRET çalışmalarında kullanılmıştır19. DDM iyonik değildir, membran proteinleri 20,21'i çözündürmek için yaygın olarak kullanılır ve tek moleküllü çalışmalarda kullanılmıştır. DDM iyi bir ilk tercih deterjandır; ancak, birden fazla deterjanı test etmenizi ve sonuçların tutarlı olmasını sağlamanızı öneririz.

5. Mikroskop kurulumu ve smFRET veri toplama

  1. Bilgisayarı ve mikroskobu açın. Isınmak için lazerleri açın (Cy3 uyarımı için 532 nm ve Cy5 uyarımı için 640 nm).
    NOT: Burada, 100x TIRF hedefi (N.A. 1.49), görüntü ayırıcı ve EMCCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılmıştır. Kurulum, dört hatlı bir lazer birleştirici, bir dikroik ayna, uzun geçişli bir emisyon filtresi, bir emisyon dikroik filtresi ve bir çentik filtre ile donatılmıştır.
  2. EMCCD kamerayı açın ve kamera yazılımını açın. Fotoğraf makinesinin -69 °C'ye ulaşması ve stabilize olması için 20 dakika bekleyin.
  3. Örnek odasını mikroskop aşamasına monte edin. Görüş alanı başına ~ 400 molekül elde etmek için protein örneğini kademeli olarak ekleyin (adım 2.4.5). Odayı 100 μL görüntüleme tamponu ile yıkayın.
  4. Kazancı, edinme oranını ve lazer güçlerini, hem donör hem de alıcı kanallarında tek moleküllü floresan sinyalleri tespit edilecek şekilde ayarlayın. Gerekirse numune odasındaki proteinlerin konsantrasyonunu ayarlayın.
    NOT: Görüş alanında 400'den fazla molekül bulunduğundan, molekülleri tek tek ayırt etmek daha zor hale gelir ve arka plan gürültüsü daha yüksek olur.
  5. Donörü heyecanlandırın ve görüş alanındaki donör moleküllerinin en az% 80'i fotobeyazlatılana kadar zaman izleri elde edin.
  6. Filmin sonunda, alıcı moleküllerin bir kısmı fotobeyazlatıcıya kadar alıcıyı doğrudan uyarmak için 640 nm lazeri açın ve multimer ayrımcılığından tek molekülü kolaylaştırın.
  7. Farklı bir görüş alanına geçin ve koşul başına en az üç film (teknik çoğaltma) toplamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Yeni bir ilgi alanı (ROI) seçerken ve fotobeyazlatmayı en aza indirmek için odaklanırken mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanın. Satın alma sırasında sahne sürüklenmesine dikkat edin. Yeni bir yatırım getirisine geçtikten sonra gözle görülür bir kayma gözlenirse, satın almaya başlamadan önce 3 dakika bekleyin.

6. Veri analizi

  1. Donör ve alıcı kanal hizalaması (film eşleme)
    1. Floresan boncuk görüntülerini donör ve alıcı kanallarına kaydedin.
    2. Her molekülden22,23 donör ve alıcı floresansını ilişkilendirmek için boncuk verilerini kullanarak eşleme dosyasını oluşturun.
      NOT: Tek bir molekülden gelen emisyon sinyali, görüntü ayırıcının içindeki emisyon dikroik filtresi tarafından donör ve alıcı sinyallere bölünür. Donör ve alıcı görüntüleri kameraya yan yana yansıtılır. İki alan arasındaki tek bir molekülün donör ve alıcı yoğunluklarını doğru bir şekilde ilişkilendirmek için, genellikle floresan boncuk örnekleri kullanılarak bir haritalama dosyası oluşturulur. Bu haritalama dosyası kullanılarak, donör ve alıcı kanallarında tespit edilen tüm moleküller birbirine eşlenir. Analiz daha sonra her molekül için zaman içindeki donör ve alıcı yoğunlukları olan zaman izlerini üretir.
  2. Tek moleküllü FRET izlerinin seçimi (partikül toplama)
    NOT: Tek tek parçacık izleri, MATLAB kullanılarak aşağı akış analizi için incelenir ve seçilir. Tam seçim kriterleri sisteme bağlıdır. Kaliteli bir parçacığı neyin oluşturduğuna dair genel kurallar burada özetlenmiştir. Özel olarak değiştirilmiş tüm kodlar GitHub'da (https://github.com/vafabakhsh-lab) mevcuttur.
    1. İzlerin toplam yoğunluğunun (donör + alıcı) zaman içinde sabit olduğu izleri seçin. Donör ve alıcı yoğunluklarında anti-korelasyon değişiklikleri olan izleri seçin.
    2. Tek adımlı fotobeyazlatma gösteren donör ve alıcı molekülleri seçin. >5 s uzunluğundaki izleri seçin.
      NOT: Ağartmadan sonra her kanaldaki arka plan sıfıra gitmelidir. İzlerde çok fazla yanıp sönen olay olmamalıdır; bu analiz zorluğunu artıracaktır.
    3. FRET verimliliğini E = (I A− 0.088 × I D)/(I D + [I A− 0.088 × I D])24,25,26 denklemini kullanarak hesaplayın, burada I D ve I A sırasıyla ham donör ve alıcı yoğunluklarıdır.
      NOT: Donör emisyonunun alıcı kanala sızması, 532 nm lazer26 kullanılarak uyarılan yalnızca donör etiketli numune kullanılarak belirlenir. Sızıntı düzeltme faktörü 0,088, kullanılan filtre setlerine bağlı olarak farklı kurulumlar için farklılık gösterebilir. FRET verimliliklerinin mutlak mesafelere nicel ve sağlam dönüşümünün, birden fazla faktör için donör ve alıcı yoğunluklarının düzeltilmesini gerektirdiğini ve27'den önce kapsamlı bir şekilde tartışıldığını belirtmek önemlidir.
  3. Gizli Markov Modellemesi (HMM) ile konformasyonel durumu tanımlayın
    1. MATLAB'da vbFRET28 programını çalıştırın ve belirli bir koşul için seçilen izlemeleri içe aktarın. Yürütülecek olası durumların ve yinelemelerin sayısı için kısıtlamaları ayarlayın.
      NOT: Temsili sonuçlardan elde edilen ham verilere dayanarak, konformasyonel sensör tarafından işgal edilen dört ayrı FRET durumu olduğu varsayılmıştır; Böylece, bir ila dört devletten oluşan bir aralık belirlendi. Uyumdaki iyileştirmelerin daha önce >25 yineleme ile ihmal edilebilir bir şekilde artacağı belirlendi; Böylece, temsili verileri sığdırmak için 25 yineleme kullanılmıştır.
    2. smFRET izlemelerini analiz edin ve idealize edilmiş izlemeleri ve analiz oturumunu dışa aktarın. İdealize edilmiş izlemeleri aşağı akış analizi için ayrı bir klasöre kaydedin.
      NOT: İdealize edilmiş izlemelerden durum geçişi ve bekleme süresi verilerini ayıklamak için kullanılan programlar, daha önce yayınlanmış29 numaralı çalışmada kullanıma sunulmuştur.
    3. MATLAB programlarını kullanarak, durum geçişlerini ayıklayın ve bunları başlangıç konformasyonunu gösteren X-koordinatı ve bitiş konformasyonunu gösteren Y-koordinatı ile bir ısı haritası olarak çizin.
      NOT: Geçişler, burada tartışılan temsili sonuçlarda FRET değerindeki >0,1 olarak tanımlanır. Geçişler için eşik, bir ilgi proteininin kapladığı varsayımsal konformasyonel durumlara (geçiş eşiğini en yakın FRET durumları arasındaki farktan daha az olacak şekilde ayarlayın) ve deneysel kurulumun izin verdiği çözünürlüğe bağlıdır. Isı haritalarının çoklu koşullar için incelenmesi, bir sensörün içinden geçtiği ve dolayısıyla işgal ettiği en yaygın konformasyonel durumların tanımlanmasını sağlar. Temsili sonuçlar için dört FRET durumu tanımlandı (FRET = 0.31, 0.51, 0.71 ve 0.89).
    4. MATLAB programlarını kullanarak, tanımlanan her konformasyonel durum için bekleme sürelerini ayıklayın. Veri toplama sırasında her durumu ve zaman çözünürlüğünü tanımlayan bir dizi FRET değeri belirleyin. FRET aralıkları, bitişik FRET durumlarına eşit olarak bölünür. Belirli tedavi koşulları için bekleme sürelerini dışa aktarın.
      NOT: Çoğu durumda, bekleme süresi verileri tek bir üstel bozunma fonksiyonu ile iyi tahmin edilebilir. Bu analiz bir veri analizi ve grafik yazılımında gerçekleştirilebilir.
  4. Devlet doluluğunu ölçmek için smFRET popülasyon histogramlarının Gauss uyumu
    1. İlgilenilen koşullar için popülasyon FRET histogramlarını veri analizine ve çoklu tepe noktası analizi için grafik yazılımına aktarın.
    2. Mevcut tepe noktalarının sayısını belirtin (HMM analizine dayalı dört tepe noktası veya durum). Uydurma, A'nın tepe alanı, xc'nin tepe merkezi ve w'nin her tepe için tepe genişliği olduğu30 olarak figure-protocol-1tanımlanan çoklu Gauss dağılımları kullanılarak gerçekleştirildi.
    3. Montaj parametrelerini A > 0, xc = FRET ± 0,02 ve 0,1 ≤w≤ 0,24 olarak sınırlayın. Bireysel popülasyon FRET histogramları için dört FRET zirvesi aynı anda yerleştirildi. Tüm koşulların bağlantı parçaları için tanımlanmış kısıtlamaları uygulayın.
    4. Doluluk durumunu (yüzde), tüm zirvelerin toplamı olarak tanımlanan toplam alana bölünen ilgi alanı olarak hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UAA tabanlı FRET sensörünün ekspresyon ve floresan etiketlemesi
Burada, mGluR2 (548UAA) CRD'si içinde bir UAA'nın (AZP) yerleştirilmesi ve floresan etiketlemesinin örnek sonuçları tartışılmıştır11. Daha önce de belirtildiği gibi, AZP'yi mGluR2'ye yerleştirmek için, modifiye edilmiş bir tRNA sentetaz ve tamamlayıcı tRNA (pIRE4-Azi) içeren mühendislik translasyonel makinesinin ve mutagenez kullanılarak oluşturulan 548 pozisyonunda bir amber kodon içeren mGluR2'nin birlikte ekspre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GPCR'ler, sinyal iletimini başlatmak için hücre zarı üzerinde çalışan proteinlerdir. Birçok GPCR, birden fazla alandan oluşur ve sinyalleme, etki alanları arasındaki işbirlikçi etkileşime bağlıdır. Bu membran reseptörlerinin özelliklerini modüle etmek için, çoklu alanların dinamik davranışını anlamak önemlidir. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), protein konformasyonu ve dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak ölçülmesini sağlayan bir floresan tekniğidir11,32

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reza Vafabakhsh laboratuvarı üyelerine tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01GM140272 (R.V.'ye), Northwestern Üniversitesi'ndeki Yaşam Bilimleri için Searle Liderlik Fonu ve Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu tarafından Chicago Community Trust'taki Searle Funds'ın desteğiyle desteklenmiştir. B.W.L., Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) Eğitim Hibe T32GM-008061 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-Sodyum L-AskorbatSigma Aldrich Cat# 11140-250G
4-azido-L-fenilalaninChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw ve ark. 2021Nakledilmiş yapı
Asetik AsitFisher Kimyasal64-19-7
AsetonFisher Kimyasal67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Yazılım, algoritma
Aminoguanidin (hidroklorür)Cayman Chemical81530
AminosilanAldrich919-30-2
Banyo Sonikatörü 2.8 LFisher ScientificUltrasonik Banyo 2.8 L
Biotin-PEGLaysan Bio IncÜrün # Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESTıklama Kimyası Araçları1237-500
Bakır (II) sülfatSigma Aldrich Cat# 451657-10G
Kapak kaymasıVWR16004-306Numune odası
Cy3 AlkinTıklama Kimyası AraçlarıTA117-5
Cy5 AlkinTıklama Kimyası AraçlarıTA116-5
DDMAnatraceParça # D310 1 GMDeterjan
DDM-CHS (10: 1)AnatraceParça # D310-CH210 1 MLKoleterrol ile Deterjan
Tanımlı Fetal Sığır SerumuThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405 / 488/561/635SemrockÇentik filtresi
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDAndorDU-897UKamera
ET542lpChromaUzun geçiren emisyon filtresi
FF640-FDi01SemrockEmisyon dikroik filtre
BAYRAK etiketi antikoruGenscriptA01429
Floresan boncukInvitrogen T7279TetraSpeck mikro kürelerKüresel boncuk
Cam slaytlarFisherfinest12-544-4numune odası
GlutamatSigma Aldrich Cat# 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Hücre hattı
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
Görüntü ayırıcıOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LazerOxxius4 hatlı lazer birleştirici
Lipofectamine 3000 Transfeksiyon ReaktifiThermo Fisher ScientificL3000015Transfeksiyon Reaktifi
MetanolFisher Chemical67-56-1
MikroskopOlympusOlympus IX83
Milli-Q suBarnsteadSu Deiyonizer
m-PEGLaysan Bio IncÜrün # MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635SemrockDikroik ayna
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Azaltılmış Serum Ortamı
OptiMEM/Azaltılmış serum ortamıThermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Veri analizi ve grafik yazılımı
Penisilin-StreptomisinGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlazmid # 105829Transfekte edilmiş yapı
Poli-L-lizin hidrobromürSigma AldrichCat # P2636
Protocatechuic asit (PCA)HWI grubu99-50-3
smCamera (Sürüm 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Kamera yazılım
Sodyum bikarbonatFisherBioReagents144-55-8
Sodyum hidroksit (NaOH)Sigma1310-73-2
Şırınga filtresiWhatman UNIFLOCat # 9914-2502Sıvı filtrasyonu
TroloxSigma53188-07
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769(2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518(2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194(2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

Related Articles