Method Article

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir. Bu nedenle, uygun preklinik kardiyak güvenlik değerlendirme modellerinin kullanılması, ilaç geliştirme sırasında kritik bir adımdır. Şu anda, kardiyak güvenlik değerlendirmesi hala hayvan çalışmalarına büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modelleri, özellikle kardiyak elektrofizyolojik özellikler açısından, türe özgü farklılıklar nedeniyle, insanlara zayıf translasyonel özgüllükten muzdariptir. Bu nedenle, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için paha biçilmez bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. hiPSC-CM'ler, farklı genetik geçmişlere ve çeşitli hastalıklı koşullara sahip bireylerden elde edilebilir, bu da onları ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi ayrı ayrı değerlendirmek için ideal bir vekil haline getirir. Bu nedenle, hiPSC-CM'lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturulmalıdır. Bu protokolde, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum işleme ölçümü de dahil olmak üzere hiPSC-CM'ler üzerinde değerlendirilebilecek çeşitli fonksiyonel testleri detaylandırıyoruz. Genel olarak, hiPSC-CM'lerin klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesine dahil edilmesi, ilaç geliştirmede devrim yaratma potansiyeline sahiptir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaç geliştirme uzun ve pahalı bir süreçtir. 2009 ve 2018 yılları arasında ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan yeni terapötik ilaçların bir çalışması, kapitalize edilmiş araştırma ve klinik çalışmaların tahmini medyan maliyetinin ürün başına 985 milyon dolar olduğunu bildirmiştir1. İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir2. Özellikle, kardiyotoksisite birden fazla terapötik ilaç sınıfı arasında bildirilmiştir3. Bu nedenle, kardiyak güvenlik değerlendirmesi, ilaç geliştirme sürecinde çok önemli bir bileşendir. Kardiyak güvenlik değerlendirmesi için mevcut paradigma hala hayvan modellerine büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modellerinin kullanımından kaynaklanan tür farklılıkları, insan hastalarında ilaca bağlı kardiyotoksisite için yanlış tahminlerin birincil nedeni olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir4. Örneğin, kardiyak aksiyon potansiyelinin morfolojisi, farklı repolarize akımların katkıları nedeniyle insanlar ve fareler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir5. Ek olarak, kardiyak miyozin ve dairesel RNA'ların kardiyak fizyolojiyi etkileyebilecek diferansiyel izoformları,türler arasında iyi belgelenmiştir 6,7. Bu boşlukları kapatmak için, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model oluşturmak zorunludur.

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin çığır açan icadı, benzeri görülmemiş ilaç tarama ve hastalık modelleme platformları oluşturmuştur. Son on yılda, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) üretme yöntemleri iyi kurulmuş 8,9 haline gelmiştir. hiPSC-CM'ler, hastalık modelleme, ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hassas tıptaki potansiyel uygulamalarına büyük ilgi duymuştur. Örneğin, uzun QT sendromu 10, hipertrofik kardiyomiyopati 11,12 ve dilate kardiyomiyopati 13,14,15 gibi genetik kalıtımın neden olduğu kalp hastalıklarının patolojik fenotiplerini modellemek için hiPSC-CM'ler kullanılmıştır. Sonuç olarak, kalp hastalıklarının patogenezinde rol oynayan ve etkili tedavi için potansiyel terapötik stratejilere ışık tutabilecek anahtar sinyal yolları tanımlanmıştır. Ayrıca, hiPSC-CM'ler, doksorubisin, trastuzumab ve tirozin kinaz inhibitörleri16,17,18 dahil olmak üzere antikanser ajanlarla ilişkili ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi taramak için kullanılmıştır; Ortaya çıkan kardiyotoksisiteyi hafifletmek için stratejiler araştırılmaktadır. Son olarak, hiPSC-CM'lerde tutulan genetik bilgi, ilaca bağlı kardiyotoksisitenin hem bireysel hem de popülasyon seviyelerindetaranmasına ve tahmin edilmesine izin verir 19,20. Toplu olarak, hiPSC-CM'lerin kişiselleştirilmiş kardiyak güvenlik tahmini için paha biçilmez bir araç olduğu kanıtlanmıştır.

Bu protokolün genel amacı, hiPSC-CM'lerin hastalık modellemesine, ilaca bağlı kardiyotoksisite taramasına ve hassas tıbba uygulanmasında büyük önem taşıyan hiPSC-CM'lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı ve verimli bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturmaktır. Burada, hiPSC-CM'lerin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum (Ca2+) kullanımının ölçümü de dahil olmak üzere bir dizi fonksiyonel tahlili detaylandırıyoruz (Şekil 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması

  1. 10 mL'lik bir şişe 50x B27 takviyesi ve 500 mL RPMI 1640 ortamını karıştırarak hiPSC-CM bakım ortamını hazırlayın. Ortamı 4 ° C'de saklayın ve bir ay içinde kullanın. Kullanmadan önce ortamdan oda sıcaklığına (RT) dengeleyin.
  2. 20 mL serum replasmanı ve 180 mL hiPSC-CM bakım ortamı (%10 seyreltme, v/v) karıştırarak hiPSC-CM tohumlama ortamı hazırlayın. Taze hazırlanmış tohumlama ortamı tercih edilirken, 4 ° C'de en fazla 2 hafta saklanabilir. Kullanmadan önce ortamı RT'ye dengeleyin.
  3. Bir şişe (10 mL) bazal membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözerek ve steril 1,5 mL tüplerde 500 μL bazal membran matrisini alıntılayarak hücre dışı matris kaplama çözeltisi hazırlayın. Daha fazla kullanım için -20 ° C'de saklayın. Bodrum membranı matris kaplama çözeltisi yapmak için 500 μL bazal membran matrisi ve 100 mL buz gibi soğuk DMEM / F12 ortamını (1:200 seyreltme, v / v) karıştırın.
  4. 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl2, 5 mM glikoz ve 10 mM HEPES içeren 50 mL Tyrode çözeltisi hazırlayın. NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Deney gününde taze Tyrode çözeltisini hazırlayın.
  5. 120 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 10 mM EGTA ve 10 mM HEPES içeren 50 mL hücre içi pipet çözeltisi hazırlayın. KOH ile pH'ı 7,2'ye ayarlayın. Hücre içi pipet çözeltisini steril 5 mL tüplerde alıkoyun ve -20 °C'de saklayın. Deney gününde, 3 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için çözeltiye taze olarak MgATP ekleyin.
  6. 2 μM Fura-2 ve% 0.1 Pluronik F-127 içeren 1 mL Fura-2 yükleme çözeltisi hazırlayın. Deney gününde taze yükleme çözeltisi hazırlayın ve ışıktan koruyun.

2. HiPSC-CM büzülme hareketinin ölçülmesi

  1. 96 delikli plakaların her bir kuyucuğuna 100 μL hücre dışı matris kaplama çözeltisi ekleyerek bazal membran matris kaplı plakalar hazırlayın. 96 kuyucuklu plakaları nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  2. HiPSC-CM'lerin enzimatik ayrışması
    1. Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank'tan (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html) hiPSC talep edin. Önceki yayınlara göre hiPSC-CM'ler oluşturun 8,9. Altı kuyucuklu plakalarda kültürlenmiş hiPSC-CM'leri mikroskop altında 10x büyütmede gözlemleyin.
      NOT: Hücreleri hala proliferatif olduklarında ayırmayın. Aksi takdirde, hücreler yeniden kaplandıktan sonra kuyucuklarda aşırı büyüyecek ve fonksiyonel testlerin yanlış sonuçlarına yol açacaktır. Genellikle, hiPSC-CM'ler 18-23. günlerde proliferasyonu durdurur.
    2. HiPSC-CM'lerin güçlü bir şekilde attığından ve% 95'in üzerinde bir saflığa sahip olduğundan emin olun. Kardiyomiyositlerin spesifik bir belirteci olan kardiyak troponin T'ye karşı immün boyama yaparak saflığı değerlendirin 8,9.
    3. Bakım ortamını aspire edin ve hücreleri iki kez 1x DPBS ile yıkayın. Altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Kuluçka süresi düzenli olarak izlenmelidir. Hücre canlılığını azaltacağı için hücreleri aşırı sindirmediğinizden emin olun.
    4. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için 5 mL'lik bir pipet kullanarak hiPSC-CM'leri birkaç kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek için eşit miktarda hiPSC-CMs tohumlama ortamı ekleyin.
    5. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de hiPSC-CM'leri santrifüj yapın. süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 1-2 mL hiPSC-CM tohumlama ortamında yeniden askıya alın.
    6. Bir tripan mavisi dışlama yöntemi kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını ölçün. Kısaca, 10 μL hücre süspansiyonunu eşit miktarda tripan mavisi ile karıştırın, bir hücre sayma slaytına aktarın ve daha önce açıklandığı gibi bir hücre sayacı kullanarak sayın21.
  3. Tohumlama hiPSC-CM'ler
    1. Hücre dışı matris kaplama solüsyonunu 96 delikli plakalardan çıkarın.
    2. 100 μL hiPSC-CM tohumlama ortamında kuyucuk başına 50.000 hücre tohumlayın ve 96 kuyucuklu plakaları nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatörüne 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'ye yerleştirin.
    3. Kaplamadan 1 gün sonra hiPSC-CM tohumlama ortamını 100 μL hiPSC-CM bakım ortamı ile değiştirin. Kayda kadar hiPSC-CM bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin.
  4. Veri toplama
    1. HiPSC-CM kasılma hareketini kaplamadan en az 10 gün sonra ölçün (önerilir).
    2. Sıcaklık kontrol cihazını açın ve tercih edilen sıcaklık olarak 37 °C ayarlayın. Mikroskop, kamera ve CO2 beslemesini açın.
    3. Plaka tutucunun su ceketini uygun miktarda steril deiyonize su ile doldurun (Şekil 2A). 96 delikli plakayı plaka tutucuya yerleştirin ve hücrelerin en az 5 dakika boyunca alışmasına izin verin.
    4. Görüntüleme yazılımını açın, kamera kare hızını saniyede 75 kare (fps) ve video/görüntü çözünürlüğünü 1024 × 1024 piksel olarak ayarlayın. Otomatik odaklama ve otomatik parlaklık işlevlerini uygulayın. HiPSC-CM'lerin videolarını ve görüntülerini kaydedin.
      NOT: Kayıt sırasında mikroskop tablosunun titreşiminden kaçının.
    5. Otomatik analiz için analizör yazılımını açın.

3. HiPSC-CM alan potansiyelinin ölçülmesi

  1. Bodrum membranı matris kaplı plakaların hazırlanması
    1. 48 delikli mikroelektrot dizisi (MEA) plakalarının her bir kuyucuğunun kayıt elektrot alanı üzerine 8 μL'lik bir hücre dışı matris kaplama çözeltisi damlacığını dikkatlice yerleştirin. Damlacık yerleştirme için uygun elektrot alanı için Şekil 3A'ya bakınız. Bu adım, hiPSC-CM monokatmanının elektrotlar üzerinde yoğunlaşmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Hiçbir koşulda elektrotlara dokunmaktan kaçının.
    2. Kaplama çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için 48 kuyulu MEA plakalarının kuyularını çevreleyen alana 3 mL steril deiyonize su ekleyin (Şekil 3A). 48 kuyucuklu MEA plakalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, 45-60 dakika boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Bodrum membran matrisinin kurumasını önlemek için çok uzun süre kuluçkaya yatmayın.
  2. Adım 2.2'de açıklandığı gibi hiPSC-CM'lerin enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.
  3. Tohumlama hiPSC-CM'ler
    1. Aynı tek sıra veya sütun içinde 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak elektrotlara dokunmadan hücre dışı matris ortamının çoğunu kuyu yüzeyinden çıkarın.
    2. Aynı sıra veya sütundaki her bir kuyucuğun kayıt elektrodu alanı üzerinde 8 μL'lik bir hiPSC-CM tohumlama ortamı damlacığında kuyucuk başına 50.000 hücre tohumlayın.
    3. Tüm kuyular hücrelerle kaplanana kadar son iki adımı tekrarlayın. Mikroskop altında tüm kuyucukların hiPSC-CM süspansiyonuna sahip olup olmadığını kontrol edin. İstenilen yoğunluk için bkz: Şekil 3B.
      NOT: Bodrum membran matrisi tamamen kuruduğunda hiPSC-CM'lerin bağlantısı tehlikeye girer ve hücre bağlanması optimal değildir.
    4. 48 kuyucuklu MEA plakalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, 60 dakika boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
    5. 48 delikli MEA plakalarının her bir kuyucuğuna yavaşça ve nazikçe 150 μL hiPSC-CM tohumlama ortamı ekleyin. Daha önce tohumlanmış hiPSC-CM'leri dağıtmadan ortam eklemek için, plakayı 45° açıyla tutun, pipet ucunu her bir kuyucuğun duvarına yaslayın ve ortamı yavaşça serbest bırakın.
      NOT: Ortamın çok hızlı veya yüksek basınçla eklenmesi, yapıştırılan kardiyomiyositleri yerinden çıkaracaktır. Yüksek PSC-CM düşme süspansiyonu ile doğrudan temastan kaçının.
    6. 48 kuyucuklu MEA plakalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
    7. Kaplamadan 1 gün sonra hiPSC-CM tohumlama ortamını 300 μL hiPSC-CM bakım ortamı ile yenileyin. Kayıttan önce her 2 günde bir hiPSC-CM bakım ortamını değiştirin.
  4. Veri toplama
    1. Kaplamadan en az 10 gün sonra MEA ölçümü yapın (önerilir). Kaplama sonrası 10. günde, Şekil 3C'de gösterildiği gibi olması gereken 10x büyütmede mikroskop altında spontan dayak hiPSC-CM tek katmanının yoğunluğunu kontrol edin.
    2. 48 delikli MEA plakasını kayıt cihazına yerleştirin. Dokunmatik ekran, sıcaklık (37 ° C) ve CO2 (% 5) durumunu gözlemlemenizi sağlar.
    3. Gezgin yazılımını açın. Deney kurulum penceresinde, Kardiyak Gerçek Zamanlı Yapılandırma ve Alan Potansiyel Kayıtları'nı seçin. Spontane veya tempolu vuruş yapılandırmaları uygulayın.
    4. Vuruş algılama parametrelerinde, algılama eşiğini 300 μV'ye, minimum vuruş süresini 250 ms'ye ve maksimum vuruş süresini 5 sn'ye ayarlayın. Alan potansiyel süresi (FPD) hesaplaması için Polinom Regresyonu'nu seçin.
    5. Temel elektriksel aktivite sinyalinin olgun ve kararlı olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Çok kuyulu MEA plakasından her elektrot tarafından kaydedilen olgun dalga formları, Şekil 3D-F'de gösterildiği gibi, kardiyak depolarizasyon artışı ve repolarizasyon fazı ile çakışan kolayca tanımlanabilen özelliklere sahip kardiyak alan potansiyelini yansıtmalıdır.
    6. 1-3 dakika boyunca temel kardiyak aktiviteleri edinin. İlaç tedavisine ihtiyaç duyulursa, temel kayıttan sonra kuyucuklara bileşikler ekleyin. Bir sonraki kayıttan önce plakayı en az 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.

4. HiPSC-CM aksiyon potansiyelinin ölçülmesi

  1. 35 mm'lik tabakların cam alt kısmına 500 μL hücre dışı matris kaplama çözeltisi yerleştirerek bazal membran matris kaplı tabaklar hazırlayın (Şekil 4A). 35 mm'lik bulaşıkları nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  2. Adım 2.2'de açıklandığı gibi hiPSC-CM'lerin enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.
  3. Tohumlama hiPSC-CM'ler
    1. Hücre dışı matris kaplama solüsyonunu 35 mm'lik tabaklardan çıkarın. 35 mm'lik tabakların cam alt kısmında 500 μL hiPSC-CM tohumlama ortamında kuyu başına 50.000 hücre tohumlayın.
    2. 35 mm'lik bulaşıkları nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin. hiPSC-CM tohumlama ortamını çıkarın ve 35 mm'lik tabaklara 2 mL hiPSC-CM bakım ortamı ekleyin.
      NOT: Hücrelere dokunmamak üzere harcanan ortamı çıkarmak için 2 mL aspirasyon pipetinin üzerine 200 μL filtrelenmemiş bir uç yerleştirilmesi önerilir.
    3. Kayıttan önce her 2 günde bir hiPSC-CM kültür ortamını değiştirin.
  4. Veri toplama
    1. Kaplamadan en az 10 gün sonra aksiyon potansiyeli ölçümü yapın (önerilir). Adım 1.4'te açıklandığı gibi taze Tyrode çözeltisini hazırlayın. Bir hücre içi pipet çözeltisinin bir alikotunu çözün ve taze olarak 3 mM'lik son konsantrasyona MgATP ekleyin.
    2. Mikropipetleri bir mikropipet çektirici kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan çekin.
      NOT: Mikropipetlerin 2-5 MΩ direnci tercih edilir.
    3. HiPSC-CM bakım ortamını Tyrode çözeltisi ile değiştirin ve hücrelerin 15 dakika boyunca Tyrode'un çözeltisine alışmasına izin verin (Şekil 4C). Sıcaklık sensörlerini hazneye yerleştirin, 35 mm'lik çanağı Şekil 4C'de gösterildiği gibi hazneye yerleştirin ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın (Şekil 4D).
    4. Mikropipetleri hücre içi çözelti ile doldurun ve yama kelepçeli amplifikatör baş kısmına bağlı tutucuya yerleştirin (Şekil 4E). Stimülasyon/alma yazılımını açın, aksiyon potansiyeli kayıt protokolünü yükleyin ve voltaj kelepçesi yapılandırmasını seçin.
    5. Mikropipeti banyo çözeltisine yerleştirin, uygun tek hiPSC-CM'leri seçin ve bir mikromanipülatör kullanarak seçilen hücrenin yanındaki mikropipetin konumunu ayarlayın ve indirin. Pipet ucu banyo çözeltisine yerleştirildiğinde, osiloskop monitöründe gözlemlenebilecek pipet direncini kontrol edin.
    6. Pipetin hücreye yakın bir yere yerleştirilmesi durumunda, akım darbeleri artan sızdırmazlık direncini yansıtacak şekilde hafifçe azalacaktır. Bir gigaseal oluşturacak olan direnci arttırmak için negatif basınçla nazik bir emme uygulayın. Mühür işlevini uygulayın.
    7. Tüm hücre kayıt konfigürasyonunu elde etmek için zarı kırmak için ek emme uygulayın. Pipet alanındaki membran kısmı emme ile yırtıldıktan sonra, iç çözelti hücre sitoplazması ile dengededir. Bu noktada, amplifikatör iletişim kutusunu kullanarak voltaj kelepçesi modundan (V-kelepçesi) akım kelepçesi moduna veya akım enjeksiyonu yapmamaya (C-Kelepçesi) geçin. Eylem potansiyel kayıt dosyalarını oluşturmak ve kaydetmek için Kaydet düğmesine basın.
      NOT: Mod değişikliği, hiPSC-CM'lerin spontan aksiyon potansiyellerinin, yama kelepçeli amplifikatörün V-mon çıkışında izlenebilen tetikleyici ve stimülasyon kayıt protokolü olmadan sürekli olarak kaydedilmesini sağlar.

5. hiPSC-CM Ca2+ geçici ölçümü

  1. Ca2+ görüntüleme21 için özelleştirilmiş hücre odacıkları hazırlamak için önceki protokole bakın. Bodrum membran matris kaplı hücre odasının hazırlanması için, hücre odalarına 200 μL hücre dışı matris kaplama çözeltisi yerleştirin. Hücre odalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  2. Adım 2.2'de açıklandığı gibi hiPSC-CM'lerin enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.
  3. Tohumlama hiPSC-CM'ler
    1. Hücre dışı matris kaplama solüsyonunu hücre odalarından çıkarın. 200 μL hiPSC-CM tohumlama ortamında kuyu başına 20.000 hücre tohumlayın.
    2. Kaplamadan 1 gün sonra hiPSC-CM tohumlama ortamını 200 μL hiPSC-CM bakım ortamı ile değiştirin. Kayıttan önce her 2 günde bir hiPSC-CM bakım ortamını değiştirin.
  4. Veri toplama
    1. Kaplamadan en az 10 gün sonra Ca2+ geçici ölçüm yapın (önerilir). Adım 1.4'te açıklandığı gibi taze Tyrode çözeltisini hazırlayın. Adım 1.6'da açıklandığı gibi taze Fura-2 yükleme çözeltisi hazırlayın.
    2. HiPSC-CM bakım ortamını aspire edin ve Tyrode çözeltisi ile iki kez yıkayın. 100 μL Fura-2 yükleme çözeltisi uygulayın ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Fura-2 yükleme çözümünü Tyrode çözeltisiyle değiştirin ve Fura-2'nin tamamen deesterifikasyonu için en az 5 dakika bekleyin.
    4. 40x yağ daldırma hedefi (0.95 NA) ile donatılmış ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobun 40x hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin. Hücre odasını mikroskobun sahne adaptörüne yerleştirin (Şekil 5A).
    5. Sıcaklık kontrol cihazı tellerini banyo odasına takın ve 37 ° C'ye ayarlayın. Elektrik alan stimülasyon elektrotlarını takın ve darbeleri 20 ms süreyle 0,5 Hz'ye ayarlayın.
    6. Ultra yüksek hızlı dalga boyu değiştirme ışık kaynağını açın ve cihazın talimatlarına göre 340 nm ve 380 nm hızlı geçiş moduna ayarlayın.
    7. Yazılımda hem dalga boyları hem de 20 sn'lik bir kayıt süresi için 20 ms'lik bir pozlama süresi uygulayın. HiPSC-CM'lerde geçici Ca2+ 'nın gerçek zamanlı değişikliklerini yansıtan videoyu kaydedin. Verileri bir elektronik tabloya aktarın ve verileri daha önce açıklandığı gibi analiz edin23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hiPSC-CM'lerin büzülme hareketinin, alan potansiyelinin, aksiyon potansiyelinin ve Ca2+ geçiciliğinin nasıl ölçüleceğini açıklar. Enzimatik sindirim, hücre tohumlaması, bakım ve fonksiyonel tahlil iletimini içeren şematik bir diyagram Şekil 1'de gösterilmiştir. HiPSC-CM tek katmanının oluşumu, büzülme hareketi ölçümü için gereklidir (Şekil 2B). HiPSC-CM'lerin büzülme-gevşeme hareketinin temsili bir izi Şekil 2C'de

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan iPSC teknolojisi, hastalık modelleme ve ilaç taraması için güçlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM kontraktilitesini, alan potansiyelini, aksiyon potansiyelini ve Ca2 + geçicisini ölçmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, hiPSC-CM kontraktilitesinin ve elektrofizyolojisinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bu fonksiyonel testler grubumuzun 12,13,18,24,25,26,27<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W., Greenstone Biosciences'ın kurucu ortaklarından biridir, ancak burada sunulan çalışma tamamen bağımsız olduğu için rakip çıkarları yoktur. Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blake Wu'ya el yazmasını düzelttiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 ve NASA NNX16A069A (JCW) ve AHA Doktora Sonrası Burs 872244 (GMP) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20 mm mikro kuyulu 35 mm cam alt tabak #1.5 kapak camıCellvisD35-20-1.5-NYama kelepçesi
50x B27 takviyeleriYaşam Teknolojileri17504-044hiPSC-CM kültür ortamı
6 kuyulu kültür plakasıE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM kültürü
96 kuyulu düz şeffaf dipli siyah polistiren TC ile tedavi edilmiş mikroplakalarCorning3603Büzülme hareketi ölçümü
AccutaseSigma-AldrichA6964Enzimatik ayrışma
Axion'un Entegre Stüdyosu (AxIS)AxionBiosystemsnavigatör yazılımı
Borosilikat cam kılcal damarlarHarvard AparatıBF 100-50-10,Yama kelepçesi
CaCl2< / sub> H2< / sub>OSigma-Aldrich21115Tyrode' s çözeltisi
Hücre sayma odası kızaklarıThermoFisher ScientificC10228Hücre sayımı
CytoView 48 oyuklu MEA plakalarıAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Hücre dışı matris ortamı
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Hücre içi pipet çözeltisi
EPC 10 USB  yama kelepçesi amplifikatörüWarner Instruments89-5000Yama kelepçesi
Fura-2,, hücre tabanlıThermoFisher ScientificF1221Ca2+ geçici ölçüm
GlikozSigma-AldrichG8270Tyrode' s çözümü
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s çözümü
hiPSC'lerStanford Kardiyovasküler Enstitüsü iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode' s solution
KnockOut Serum ReplasmanıThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM tohumlama ortamı
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Hücre içi pipet çözeltisi
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ geçici durum ölçümü; ultra yüksek hızlı dalga boyu anahtarlamalı ışık kaynağı
Luna-FL otomatik floresan hücre sayacıWISBIOMEDLB-L20001Hücre sayımı
Maestro Pro  MEA sistemiAxion BiosystemsMEA
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran MatrisiCorning356231Hücre dışı matris ortamı
MgATPSigma-AldrichA9187Hücre içi pipet çözeltisi
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s çözümü
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s çözeltisi
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s çözümü
NIS Elemanları AR
Pluronic F-127 (DMSO'da %20 Çözelti)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ geçici durum ölçümü
RPMI 1640 ortamıYaşam Teknolojileri11875-119hiPSC-CM kültür ortamı
Sony SI8000 Hücre Hareket Görüntüleme SistemiSony BiyoteknolojiKasılma hareketi ölçümü
Sutter Mikropipet çektirmeSutter AletleriP-97Yama kelepçesi
Tripan mavi lekeYaşam TeknolojileriT10282Hücre sayımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216(2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345(2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628(2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859(2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117(2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662(2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565(2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles