Method Article

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir. Bu nedenle, uygun preklinik kardiyak güvenlik değerlendirme modellerinin kullanılması, ilaç geliştirme sırasında kritik bir adımdır. Şu anda, kardiyak güvenlik değerlendirmesi hala hayvan çalışmalarına büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modelleri, özellikle kardiyak elektrofizyolojik özellikler açısından, türe özgü farklılıklar nedeniyle, insanlara zayıf translasyonel özgüllükten muzdariptir. Bu nedenle, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için paha biçilmez bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. hiPSC-CM'ler, farklı genetik geçmişlere ve çeşitli hastalıklı koşullara sahip bireylerden elde edilebilir, bu da onları ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi ayrı ayrı değerlendirmek için ideal bir vekil haline getirir. Bu nedenle, hiPSC-CM'lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturulmalıdır. Bu protokolde, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum işleme ölçümü de dahil olmak üzere hiPSC-CM'ler üzerinde değerlendirilebilecek çeşitli fonksiyonel testleri detaylandırıyoruz. Genel olarak, hiPSC-CM'lerin klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesine dahil edilmesi, ilaç geliştirmede devrim yaratma potansiyeline sahiptir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaç geliştirme uzun ve pahalı bir süreçtir. 2009 ve 2018 yılları arasında ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan yeni terapötik ilaçların bir çalışması, kapitalize edilmiş araştırma ve klinik çalışmaların tahmini medyan maliyetinin ürün başına 985 milyon dolar olduğunu bildirmiştir1. İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir2. Özellikle, kardiyotoksisite birden fazla terapötik ilaç sınıfı arasında bildirilmiştir3. Bu nedenle, kardiyak güvenlik değerlendirmesi, ilaç geliştirme sürecinde çok önemli bir bileşendir. Kardiyak güvenlik ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması

  1. 10 mL'lik bir şişe 50x B27 takviyesi ve 500 mL RPMI 1640 ortamını karıştırarak hiPSC-CM bakım ortamını hazırlayın. Ortamı 4 ° C'de saklayın ve bir ay içinde kullanın. Kullanmadan önce ortamdan oda sıcaklığına (RT) dengeleyin.
  2. 20 mL serum replasmanı ve 180 mL hiPSC-CM bakım ortamı (%10 seyreltme, v/v) karıştırarak hiPSC-CM tohumlama ortamı hazırlayın. Taze hazırlanmış tohumlama ortamı tercih edilirken, 4 ° C'de en fazla 2 hafta saklanabilir. Kullanmadan önce ortamı RT'ye dengeleyin.
  3. Bir şişe (10 mL) bazal membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözerek ve steril 1,5 mL tüplerde 500 μL b....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hiPSC-CM'lerin büzülme hareketinin, alan potansiyelinin, aksiyon potansiyelinin ve Ca2+ geçiciliğinin nasıl ölçüleceğini açıklar. Enzimatik sindirim, hücre tohumlaması, bakım ve fonksiyonel tahlil iletimini içeren şematik bir diyagram Şekil 1'de gösterilmiştir. HiPSC-CM tek katmanının oluşumu, büzülme hareketi ölçümü için gereklidir (Şekil 2B). HiPSC-CM'lerin büzülme-gevşeme hareketinin temsili bir izi Şekil 2C'de

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan iPSC teknolojisi, hastalık modelleme ve ilaç taraması için güçlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM kontraktilitesini, alan potansiyelini, aksiyon potansiyelini ve Ca2 + geçicisini ölçmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, hiPSC-CM kontraktilitesinin ve elektrofizyolojisinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bu fonksiyonel testler grubumuzun 12,13,18,24,25,26,27<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W., Greenstone Biosciences'ın kurucu ortaklarından biridir, ancak burada sunulan çalışma tamamen bağımsız olduğu için rakip çıkarları yoktur. Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blake Wu'ya el yazmasını düzelttiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 ve NASA NNX16A069A (JCW) ve AHA Doktora Sonrası Burs 872244 (GMP) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20 mm mikro kuyulu 35 mm cam alt tabak #1.5 kapak camıCellvisD35-20-1.5-NYama kelepçesi
50x B27 takviyeleriYaşam Teknolojileri17504-044hiPSC-CM kültür ortamı
6 kuyulu kültür plakasıE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM kültürü
96 kuyulu düz şeffaf dipli siyah polistiren TC ile tedavi edilmiş mikroplakalarCorning3603Büzülme hareketi ölçümü
AccutaseSigma-AldrichA6964Enzimatik ayrışma
Axion'un Entegre Stüdyosu (AxIS)AxionBiosystemsnavigatör yazılımı
Borosilikat cam kılcal damarlarHarvard AparatıBF 100-50-10,Yama kelepçesi
CaCl2< / sub> H2< / sub>OSigma-Aldrich21115Tyrode' s çözeltisi
Hücre sayma odası kızaklarıThermoFisher ScientificC10228Hücre sayımı
CytoView 48 oyuklu MEA plakalarıAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Hücre dışı matris ortamı
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Hücre içi pipet çözeltisi
EPC 10 USB  yama kelepçesi amplifikatörüWarner Instruments89-5000Yama kelepçesi
Fura-2,, hücre tabanlıThermoFisher ScientificF1221Ca2+ geçici ölçüm
GlikozSigma-AldrichG8270Tyrode' s çözümü
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s çözümü
hiPSC'lerStanford Kardiyovasküler Enstitüsü iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode' s solution
KnockOut Serum ReplasmanıThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM tohumlama ortamı
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Hücre içi pipet çözeltisi
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ geçici durum ölçümü; ultra yüksek hızlı dalga boyu anahtarlamalı ışık kaynağı
Luna-FL otomatik floresan hücre sayacıWISBIOMEDLB-L20001Hücre sayımı
Maestro Pro  MEA sistemiAxion BiosystemsMEA
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran MatrisiCorning356231Hücre dışı matris ortamı
MgATPSigma-AldrichA9187Hücre içi pipet çözeltisi
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s çözümü
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s çözeltisi
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s çözümü
NIS Elemanları AR
Pluronic F-127 (DMSO'da %20 Çözelti)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ geçici durum ölçümü
RPMI 1640 ortamıYaşam Teknolojileri11875-119hiPSC-CM kültür ortamı
Sony SI8000 Hücre Hareket Görüntüleme SistemiSony BiyoteknolojiKasılma hareketi ölçümü
Sutter Mikropipet çektirmeSutter AletleriP-97Yama kelepçesi
Tripan mavi lekeYaşam TeknolojileriT10282Hücre sayımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles