Method Article

Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak Hücre Çekirdeğinde Mutlak DNA Yoğunluğunun Haritalanması

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu verilerinin, bilinen hacmin, genom boyutunun ve hücre döngüsü aşamasının Voronoi mozaiklemesini kullanarak yapışık hücre çekirdekleri içindeki mutlak DNA yoğunluklarını ölçen bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre çekirdeği içinde, sessiz genler genellikle heterokromatin adı verilen yüksek yoğunluklu kromatin alanlarında bulunurken, aktif genler çoğunlukla kromatin ile ökromatin adı verilen kromatinler arası boşluk arasındaki arayüzde bulunabilir. Şu anda, eu- ve heterokromatinin karakterizasyonu çoğunlukla DNA dizisi boyunca histon proteinlerinin epigenetik modifikasyonlarına dayanırken, hücre çekirdeği boyunca mutlak DNA yoğunlukları ve bunların fonksiyonel etkileri hakkında çok az şey bilinmektedir. Yalnızca biyokimyasal verilere ve kromatinin bir polimer olarak doğası hakkındaki varsayımlara dayanan çekirdek modelleri, yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile üretilen görüntüleme verilerinden hala temel olarak farklıdır. Bu, yapısal olarak ilgili önemli bilgilerin hala eksik olduğunu gösterir. Uzamsal kısıtlamaların gen düzenlemesinde rol oynayabileceğine inanıyoruz ve bu nedenle, süper çözünürlüklü lokalizasyon verilerini Voronoi mozaikleme ile gerçek ölçekli yoğunluk haritalarına dönüştürerek memeli hücre çekirdeklerindeki mutlak DNA yoğunluklarının ölçülmesine izin veren bir yöntem geliştirdik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre biyolojisinin ilk günlerinden beri, genetik bilginin merkezi olan hücre çekirdeği biyologları büyülemiştir. Emil Heitz, kendi geliştirdiği sitolojik boyama yöntemlerini uyguladıktan sonra, 1928'de hücre çekirdeği1 içinde farklı, yoğun boyalı alanlar keşfetti. Daha yoğun lekeli, yoğun alanlara "heterokromatin" adını verirken, daha az güçlü lekeli, daha az yoğun alanlara "ökromatin" adını verdi. Zamanla, aktif genlerin çoğunlukla ökromatinde yer aldığı, daha yoğun alanların ise tekrarlayan elementler ve sessiz genler açısından zengin olduğu ortaya çıktı. Heterokromatin ve ökromatin terimleri, tanımları yapısaldan moleküler özelliklere değişmiş olsa da günümüze kadar gelmiştir (aşağıya bakınız). Bugün hücre çekirdeğinin iki ana aşamaya ayrıldığını biliyoruz. Nükleer gövdeleri, ekleme bölmesini ve nükleoplazmayı barındıran bir sıvı (kromatin arası bölme) ve kromozom bölgelerini ve nükleol2'yi içeren diğer katı, hidrojel benzeri kromatin alanı. Kromatinler arası boşluğun arayüzünde, kromatin daha az yoğundur ve burası çoğunlukla transkripsiyon, replikasyon ve onarım gibi genetik olarak aktif süreçlerin gerçekleştiği yerdir 3,4,5, laminaya bitişikken, nükleollerin etrafında ve sentromerlerin yakınında, kromatin yüksek sıkıştırma seviyeleri gösterir ve genel olarak transkripsiyonel olarak oldukça aktif değildir6.

Moleküler düzeyde, kromatin, nükleozomların (çekirdek histon proteinlerinin bir oktameri) etrafına sarılmış DNA'dan yapılır. Histonlar, çeşitli kimyasal gruplar (metil-, asetil, fosfor-, biyotin), amino asitler (arginin) ve hatta proteinler (SUMO, Ubiquitin)7 eklenerek translasyon sonrası modifiye edilebilen özünde düzensiz kuyruk alanlarına sahiptir. Bu modifikasyonlar okunabilir ve diğer proteinleri (örneğin, kromatin yeniden şekillendirici, HP1, onarım proteinleri, RNA) çekebilir ve böylece dizisini doğrudan değiştirmeden DNA dizisinin fizyolojik durumunu (transkripsiyonel olarak izin verici/kısıtlayıcı) tanımlayabilir (dolayısıyla "epi"genetik)7. Belirli bir dizi etrafındaki modifikasyonların türü ve sayısı, hücre tipleri arasında derinden farklılık gösterebilir, tersine çevrilebilir ve gelişim, yaşlanma ve hastalıkboyunca değişebilir 8,9,10. Yüksek oranda kopyalanan bölgelerde daha yaygın olan histon kuyruklarının modifikasyonları ve genomun transkripsiyonel aktivitesi çok az olan veya hiç olmayan bölgelerinde baskın olan modifikasyonlar vardır.

Örneğin, H3K4 modifikasyonları açısından zengin olan veya histon kuyrukları asetillenmiş yüksek oranda kopyalanmış bölgeler genellikle ökromatin olarak tanımlanırken, baskılayıcı histon modifikasyonları açısından zengin alanlar (H3K9me3, H3K27me3 veya H4K20me3) heterokromatin olarak adlandırılır ve ayrıca kurucu heterokromatin (tüm hücrelerde transkripsiyonel olarak aktif değildir) (örneğin, H4K20me3) ve fakültatif heterokromatin (hücre tipine bağlı olarak kromatin susturulur, örneğin, H3K27me3)6. Biyokimyasal ve moleküler biyolojik yöntemler, dizi düzeyinde kimyasal değişiklikleri ölçmek için çok uygun olsa da, bu yöntemleri kullanarak orta ölçekte uzamsal özellikler hakkında açıklamalar yapmak için bunları kullanmak çok daha zordur.

Örneğin, genom11'in uzamsal modellerini yeniden yapılandırmak için, dizi bölgeleri arasındaki DNA'nın yakın yakınlıklarını tespit eden ve haritalayan Hi-C deneylerinden elde edilen yakınlık bilgileri kullanılarak girişimlerde bulunulmuştur. Ancak yüksek çözünürlüklü ışık ve elektron mikroskobu görüntüleri ile doğrudan karşılaştırma bunun ancak sınırlı ölçüde mümkün olduğunu göstermektedir (Şekil 1). Hi-C12 gibi yöntemler, interfaz hücrelerindeki kromozom bölgelerini ayrı varlıklar olarak doğru bir şekilde tespit edebilse de, bu modeller oldukça "miyoptur", çünkü DNA dizisi yakınlıkları tek başına genomun daha uzak kısımları arasındaki uzamsal ilişkileri yansıtmak için kördür ve bu nedenle uygun bir 3D genom rekonstrüksiyonu için çok uygun değildir. Bu nedenle yoğunluk farklılıkları da temas frekansı bilgisi ile doğru şekilde yansıtılamaz. Bu, çekirdekteki genomun "spagettileştirilmiş" temsillerine yol açar (bkz. Şekil 1B), bunlar yün benzeri, serbestçe erişilebilen halkalardan oluşan bir topta meydana geliyor gibi görünmektedir.

Biyokimyasal bilgiyi biyofiziksel ve yapısal verilerle birleştiren bütünleştirici, daha gerçekçi bir çekirdek resminin önünü açmak için, nükleer organizasyonun farklı yönleri hakkında veri üretilmesine izin veren yöntemlerin geliştirilmesi gerekmektedir. Yakın zamana kadar, görüntüleme verilerinden hücre çekirdeğindeki mutlak DNA yoğunluklarını belirlemek de zordu. Bunun nedenleri, geleneksel ışık mikroskoplarının sınırlı çözünürlüğü, DNA'yı spesifik olarak boyamak için elektron mikroskobundaki problemler ve elektron mikroskobundaki küçük gözlem hacimleriydi.

Geleneksel floresan mikroskopların çözünürlüğü, ışığın kırınımı ile sınırlıdır. Bir nokta ışık kaynağının görüntüsü, kırınım sınırı nedeniyle yayılır ve Nokta Yayılma Fonksiyonu (PSF) ile tanımlanabilir. PSF'ye göre, iyi bir yaklaşımla nokta ışık kaynağı olarak kabul edilebilecek bir floroforun görüntüsü, menşe kaynağının (florofor) çevresinde belirli bir büyüklükte bir hacim kaplar13. Kırınımla sınırlı görüntülerinin boyutlarından çok daha yakın olan birçok florofor aynı anda uyarıldığında, görüntülenen yoğunluk dağılımları üst üste bindirilir ve tek floroforların konumu çözülemez. Floroforlardan sıralı, stokastik ışık emisyonu (yanıp sönme), tek tek moleküllerin optik izolasyonuna ve böylece sinyallerinin yoğunluk ağırlık merkezlerini belirleyerek tam konumlarını bulmaya izin verir.

Bu, kaydedilen birçok görüntüden florofor lokalizasyon verilerinin birikmesiyle numunelerin yapısal bilgilerini yeniden oluşturmak için kullanılabilir. Bu yöntem genellikle tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) olarak adlandırılır (daha fazla bilgi için bkz.14). Bir florofor 'zamanında' ne kadar çok foton yayarsa, yoğunluk yerçekimi merkezleri o kadar kesin olarak belirlenebilir. Işın yolundaki astigmatik mercekler, optik odak düzleminin üstündeki veya altındaki florofor sinyallerini, optik eksen boyunca konumlarını belirlemek için kullanılabilen elipslere dönüştürür. Odak düzleminin altındaki floresan sinyallerden kaynaklanan elipslerin uzun eksenleri, odak düzleminin üzerindeki floroforlardan kaynaklanan elipslerin eksenlerine kıyasla 90° döndürülür. Ayrıca, bu elipslerin eksen oranı, molekülün optik eksen boyunca odak düzlemine göre ±300nm15 aralığında konumunun belirlenmesine izin verir.

Stokastik yanıp sönme olaylarının yeniden yapılandırılmasıyla oluşturulan süper çözünürlüklü görüntülerin kalitesi, büyük ölçüde etiketleme yoğunluğuna ve yanıp sönme olaylarının sayısına bağlıdır. İkincisi, floroforların fotostabilitesine ve sonunda başarısız olmadan önce yanıp sönme olaylarının sayısına (açma/kapama döngülerinin sayısı) bağlıdır. Nükleer DNA dağılımının süper çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için burada açıklanan yöntem, fBALM (DNA yapısı dalgalanan-yardımlı, bağlanma-aktive olan lokalizasyon mikroskobu) olarak adlandırılır. Geçici olarak nükleik asitlere karışan ve yalnızca DNA'ya16,17 bağlandıktan sonra floresan veren floroforlara dayanır. Fosfor-diester omurgasının yüklü kalıntıları nedeniyle DNA, oldukça negatif yüklü bir polimerdir. Canlı hücrelerde tamamlayıcı DNA zincirlerinin stabilizasyonu, pozitif yüklü proteinler (örneğin histonlar) ve iyonlar tarafından nötralizasyon gerektirir. pH'ı düşürerek, bazların tamamlayıcı eşleşmesinin stabilitesi, araya giren boyaların içeri ve dışarı yayılmasına izin verecek şekilde azaltılır16,17.

Araya giren floresan boyaya bağlı olarak bu duruma belirli bir pH aralığında ulaşılabilir. YoYo-1 ve SYTOX Orange gibi floresan boyalar yalnızca DNA'ya bağlandıklarında floresan verirler ve interkalasyon boyaları (Hoechst ve 4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI] gibi DNA'nın küçük oluğunu bağlayan boyaların aksine) genellikle diziden bağımsız bir şekilde bağlanır, lokalizasyon mikroskobu ile DNA'nın hücre çekirdeği içindeki dağılımını haritalamak için çok uygundurlar.

Voronoi mozaikleme, noktaların konumuna bağlı olarak uzayın farklı bölümlere bölünmesine izin veren matematiksel bir yöntemdir. 2B-Uzayda, ortaya çıkan karoların boyutu,18. noktaların yoğunluğunun tersini yansıtır. Lokalizasyon mikroskobu, görüntüleri floroforların konumunu temsil eden bir dizi nokta olarak yeniden oluşturduğundan, Voronoi mozaikleme, lokalizasyon sinyallerinin yoğunluğunun belirlenmesine yardımcı olabilir (Şekil 2). Bu nedenle, florofor olarak DNA'ya özgü bir boyanın kullanılması, DNA yoğunluklarının ölçülmesine izin verir.

DNA içeriği (baz çiftlerinin sayısı) ve çekirdeğin uzamsal boyutu hakkında önceden bilgi, nispi DNA yoğunluklarının mutlak DNA yoğunluklarına dönüştürülmesine izin verir. Aşağıdaki protokol, SMLM kullanılarak yapışık hücrelerdeki mutlak DNA yoğunluklarının çok yüksek çözünürlükte haritalanmasını gösterir ve bu yoğunlukların büyük varyasyonlara tabi olduğunu gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Şekil 3 , bu bölümde açıklanan iş akışına genel bir bakış sağlar. Bu protokolde kullanılan reaktifler, malzemeler, ekipman ve yazılımla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Bu yayın için kullanılan kod buradan görüntülenebilir ve indirilebilir: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Hücre kültürü

  1. %5 CO 2 ile desteklenmiş nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM'de C3H10T1/2, HFB ve HeLa hücrelerini yetiştirin. Hücreler birleşmeye yakın olduğunda, hücreleri sırasıyla 1:3 (C3H10T1/2, HFB) ve 1:10 (HeLa) oranında bölerek alt kültürleyin.
  2. Ölçümleri yapmadan bir gün önce, üstel olarak büyüyen kültürlerden hücreleri 35 mm'lik ızgaralı bir tabağa tohumlayın. Gözlem kaplarının floresan mikroskobu için mükemmel optik kalite sağladığından (170 μm kalınlığında cam taban, #1.5) ve hücrelerin yerini kesin olarak belirlemek için bir ızgaraya sahip olduğundan emin olun. Ayrıca hücrelerin tek hücreli bir süspansiyon halinde olduğundan ve çanak yüzeyinin tüm alanının homojen bir şekilde hücrelerle kaplandığından emin olun.
    NOT: Belirli bir hücre döngüsü aşamasına atanan hücreleri bir kez daha bulmak için baskılı ızgaralı tabakların kullanılması önerilir.
  3. Deney gerektiriyorsa, hücre kültürü ortamına 100 nM Trikostatin A (TSA) ekleyin ve hücreleri daha önce adım 1.1'de açıklanan koşullar altında inkübe edin.

2. Numune hazırlama

  1. Ölçüm gününde, hücreleri 1x DPBS içinde %4 paraformaldehit (PFA) içinde 30 dakika sabitlemeden önce 1x DPBS ile bir kez yıkayın.
    NOT: Tekrarlanabilir sonuçlar için, her seferinde yeni bir PFA çözeltisinin hazırlandığından emin olun ve PFA konsantrasyonunun doğru olmasına özellikle dikkat edin.
  2. Fiksatifi çıkardıktan sonra, hücreleri %0.4 Triton X-100 içeren 1x DPBS'de 20 dakika geçirgenleştirmeden önce 1x DPBS ile tekrar 2x yıkayın.
  3. Geçirgenleştirme tamponunu bir pipetle çıkarın ve hücrelere bir RNase kokteyli (1x DPBS'de 1:1.000 seyreltme) uygulamadan önce 1x DPBS ile ek bir yıkama adımı gerçekleştirin. Hücreleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
  4. fBALM özellikli SYTOX Orange stok çözeltisini (1:10.000 seyreltmede 1x DPBS'de 5 mM) seyrelterek boyama çözeltisini hazırlayın.
  5. Bir pipet kullanarak RNase tamponunu çıkarın ve boyama solüsyonunu eklemeden önce 1x DPBS ile ek bir yıkama adımı uygulayın. Hücreleri oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 5 dakika inkübe edin.
  6. SYTOX Orange boyama solüsyonunu bir pipetle hücrelerden çıkarın, 1x DPBS ile yıkayın ve hücreleri yoğun ışıktan koruyarak 1x DPBS'de saklayın.

3. Sitometrik hücre döngüsü tayini

NOT: Bu adım için, burada ters çevrilmiş yüksek içerikli bir tarama mikroskobu kullanılmıştır, ancak herhangi bir otomatik, ters geniş alan floresan mikroskobu kullanılabilir. Tüm çekirdeğin yoğunluğu, DNA içeriğinin bir ölçüsüdür; Bu nedenle, konfokal bir sistem kullanıyorsanız iğne deliğini tamamen açtığınızdan emin olun. Düşük sayısal açıklıklı (NA) objektif havalı lensler, yağa daldırmalı objektif lenslere tercih edilir.

  1. Hücrelerin bulunduğu çanağı, otomatik olarak kaydedilen görüntüleri bir araya getirerek numune üzerindeki geniş alanların yeniden yapılandırılmasına izin veren motorlu bir sahne ve yazılımla donatılmış bir ters floresan mikroskobuna koyun.
  2. Hücre döngüsü belirleme için görüntü alımının makul bir süre içinde gerçekleştirilebilmesi için görüş alanı başına yeterli hücrenin (toplamda en az 900 tek çekirdek [ayrıntılar için bakınız Roukos ve ark.19]) kaydedilmesine izin veren bir objektif lens seçin. Merkez ve sınırlar arasında büyük yoğunluk farklılıkları göstermeyen bir lens kullanın. Böyle bir lens mevcut değilse, görüntülere düz alan düzeltmesi uygulayın (bkz. adım 7). Bu protokolü takip etmek için, odak derinliği = 8 μm olan 20x NA 0.4 hava merceği ile donatılmış geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanın.
  3. Görüntü elde etme sırasında, kullanılan florofor için uygun filtreler kullanarak çanağın orta alanını kaplayın. İletilen ışık modunda parlak alan görüntüleri çekin.
    NOT: Parlak alan görüntüleri, adım 4.6'daki ızgaradaki hücrelerin yeniden konumlandırılması için önemlidir.
  4. Hücrelerle birlikte kabı 4.4. adıma kadar 4 °C'de buzdolabına koyun.
  5. Kaydedilen tek görüntüleri bir araya getirerek taranan alanı tek görüntülerden yeniden oluşturun.
  6. Floresan DNA boyasının görüntü verilerini açık kaynaklı yazılım CellProfiler4.2.120'yi çalıştıran bir bilgisayara aktarın.
  7. Floresan görüntülerin düz alan düzeltmesi gerekiyorsa, kaydedilen resimlerden kullanılan mikroskobun bir referans görüntüsünü oluşturun. Illumination Correction.cpproj işlem hattını açın ( Ek Dosya 1 olarak dahil edilir); Ardışık düzenin, ekranda farklı adımların tıklanabileceği bir sıra olarak göründüğünü gözlemleyin. Görüntüleri, işlem hattının ilk adım görüntülerinde belirlenen alana sürükleyip bırakın.
    NOT: Pencerenin alt kısmındaki filtre seçeneklerini kullanarak listelenen dosyalardaki tüm görüntü olmayan verileri hariç tuttuğunuzdan emin olun.
  8. Aydınlatma düzeltme hattının son adımında, referans görüntülerin depolanacağı bir konum tanımlamak için Görüntüleri Kaydet'e tıklayın ve ardından Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayın.
  9. CellCycleAnalysis.cpproj işlem hattını açın (Ek Dosya 2 olarak dahil edilir). Adım 3.3'te kaydedilen görüntüleri sürükleyip bırakın (örnek olarak Şekil 4A), referans görüntü (adım 3.8) dahil olmak üzere, ilk adımda belirlenen alana Boru hattının görüntüleri.
    NOT: Pencerenin alt kısmındaki filtre seçeneklerini kullanarak listelenen dosyalardaki tüm görüntü olmayan verileri hariç tuttuğunuzdan emin olun.
  10. İşlem hattının CorrectIlluminationApply adımında, Aydınlatmayı Seç işlevini seçerek açılan menüden referans görüntüyü seçin.
  11. Hücre döngüsü analizi boru hattının son adımında, referans görüntünün adım 3.7'de depolandığı bir konum tanımlayın ve adım 3.3'te kaydedilen görüntülerdeki tüm çekirdeklerin entegre floresan yoğunluklarını toplu olarak ölçmeye başlamak için Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayın.
    NOT: CellProfiler4.2.1, ölçülen her çekirdeğin verilerini (Görüntü, ObjectID, entegre floresan yoğunluğu, Görüntü koordinatları) CSV formatında içeren bir "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt" metin dosyası oluşturacaktır.
  12. İşlem hattının DisplayHistogram öğesinin etkin olarak denetlendiğinden emin olun.
  13. G1 ve G2 tepe noktaları için histogramdaki entegre floresan yoğunluklarına dikkat edin (örnek olarak Şekil 4B'ye bakın) ve etraflarındaki aralıkları boru hattının FilteredObjects öğelerine girin. Onay kutularına tıklayarak ardışık düzen öğelerini etkinleştirin.
  14. G1 veya G2 fazındaki hücreleri vurgulayan bir görüntü oluşturmak için ilgili DisplayDataOnImage ardışık düzen öğelerini etkinleştirin ve ardışık düzeni yeniden çalıştırın (örnek olarak Şekil 4C'ye bakın).
  15. Gözlem odasının işaretli alanında oluşturulan görüntüden istenen hücre döngüsü fazını temsil eden en fazla beş hücre seçin ve hücreleri SMLM mikroskobunda yeniden konumlandırmaya çalışın.
    NOT: Burada genom boyutu bilinmeyen iki hücre dizisi kullanıldığından, genom boyutları, bir insan fibroblast hücre hattının G1 pikleri ile HeLa ve C3H10T1/2 hücrelerinin G1 pikleri karşılaştırılarak belirlendi. Histogramlar ve genom boyutları arasındaki orantılı ilişki Ek Şekil S1'de görüntülenebilir.

4. SMLM-fBALM

NOT: Bu kombine biyokimyasal reaksiyonlardaki net oksijen toplamı sıfır olmasına rağmen, sınırlı oksijen konsantrasyonları D-glukono-1,5-lakton üretimini yavaşlatabileceğinden, reaksiyonun kapalı olmayan bir kapta gerçekleştirilmesi önerilir. Artan D-glukono-1,5-lakton konsantrasyonu, pH'ın hemen düşürülmesi numunenin üst yapısını değiştireceğinden gerekli olan pH'ı kademeli olarak düşürür.

  1. Aşağıdaki bileşenleri karıştırarak 1 mL görüntüleme tamponu hazırlayın: 900 μL glikoz (1x DPBS'de 1 g/mL glikoz), 50 μL glikoz oksidaz (1x DPBS'de 0.5 mg/mL) ve 50 μL katalaz (1x DPBS'de 40 μg/mL).
  2. Bir pipet kullanarak numuneden 1x DPBS'yi çıkarın ve hücreleri içeren kaba 1 mL görüntüleme tamponu ekleyin.
  3. Çanağı SMLM özellikli bir mikroskobun tablasına monte edin. Yüksek NA objektif merceği ve yüksek optik büyütme kullanın.
  4. Çanağın koordinat sistemini kullanarak seçilen çekirdeklerden birini (adım 3.15'ten itibaren) bulun ve kameranın görüş alanında ortalayın.
    NOT: Enzimatik reaksiyon, fBALM yöntemi için doğru pH'a ulaşılana ve uygun yanıp sönmeyi kolaylaştırana kadar ~60-180 dakika sürer. Sıcaklık değişiklikleri eksenel kaymaya yol açabileceğinden, numunenin cihazın sıcaklığına uyum sağlaması için yeterli zaman sağlamak amacıyla gözlem kabının mümkün olan en kısa sürede monte edilmesi önerilir. SMLM mikroskobunun bulunduğu odadaki sıcaklığın ölçüm boyunca sabit olduğundan emin olun.
  5. Mikroskobun z-sürücüsü ile odağı değiştirerek ve üst ve alt sınırların konumunu kaydederek çekirdeğin yüksekliğini belirleyin.
  6. Farklı zaman noktalarında, lazer gücünü artırarak fBALM işlemi tarafından üretilen düzgün yanıp sönmeyi kontrol edin. Örnek uygun stokastik yanıp sönmeyi gösterdiğinde, süper çözümlenmiş SMLM'nin yeniden yapılandırılması için gereken görüntü serisini elde etmeye başlayın.
    NOT: fBALM için kullanılan mikroskop, kullanılan floroforu uyarmaya uygun ve çerçeve başına yeterli foton sayısını sağlamak için yeterince yüksek foton yoğunlukları üretebilen uyarma lazerleri ile donatılmalıdır. Bunu diğer tüm deneylerden önce bir pilot deneyde test edin.
  7. fBALM işleminin düzgün bir şekilde yanıp sönmesi sağlandıktan sonra, ~20 fps'lik bir kare hızıyla sonuçlanan 50 ms'lik bir pozlama süresi kullanarak görüntü serisini almaya başlayın.
  8. 200 nm adım aralıkları ve ışık optik bölümü başına yalnızca 500 kare ile çekirdekten (orta bölüm etrafında) bir z-yığını alın. Orta bölüme geri dönün, yapısal ayrıntıların yüksek yerelleştirme hassasiyetinde iyi bir şekilde yeniden yapılandırılması için yeterli yanıp sönme olayını toplamak için 50.000 karelik bir görüntü serisi çekin (bu ~45 dakika sürecektir).
    NOT: Z-yığını, tüm çekirdeğe göre DNA sinyalinin orta bölümün fraksiyonunu belirlemek için önemlidir. Etkin piksel boyutunun SMLM22 için çok uygun olduğundan ve kameradaki sinyalin sensörü doyurmadığından emin olun.
  9. Aşağıdaki gereksinimlerin karşılandığından emin olun
    1. 16 bitlik görüntülerin sayısına ve boyutuna bağlı olarak, görüntü yığınlarının dosya boyutları oldukça büyük olabileceğinden, edinme bilgisayarının yeterli disk alanı içerdiğinden emin olun.
    2. Edinme yazılımını çalıştıran bilgisayarın, kullanılan depolama aygıtında büyük dosya boyutlarını (>4 GB) işleyebilen bir dosya sistemini işleyebildiğinden ve görüntü verilerini doğrudan depolama aygıtına kaydederken depolama aygıtına aktarım hızının dosyaları gerçek zamanlı olarak yazmak için yeterince yüksek olduğundan emin olun.
    3. Görüntü alındıktan sonra verileri kaydederken, bilgisayarın yeterli RAM (örn. 64 GB) ile donatıldığından emin olun.

5. SMLM mikroskobunun z-kalibrasyonu için floresan boncuklu bir kap hazırlama ve kaydetme

NOT: Optik eksen boyunca doğru konumları atamak için mikroskobun astigmatik lenslerinin uygun eksenel kalibrasyonu için, floresan 100 nm boncukların z yığınlarının kaydedilmesi düşünülmelidir.

  1. Boncukları 1x DPBS'de 1:10.000 oranında seyreltin ve 100 nm boncukları SMLM ölçümleri için kullanılan aynı tip tabağa tohumlayın.
    NOT: Yalnızca #1.5 lameller gibi en iyi optik kaliteyi ve özellikleri kullanın.
  2. Kalibrasyon kabını mikroskoba monte edin; Boncukların odak düzlemi boyunca görüntü yığınlarını kaydedin (toplamda ~1,5 μm; burada 10 nm'lik adımlar kullanılmıştır)15.
  3. Verileri veri analiz bilgisayarına aktarın.
    NOT: Kalibrasyon slaytlarını uzun süre saklamayın ve kullanmayın.

6. SMLM veri işleme

NOT: Yerelleştirmelerin kaydı için ImageJ23 eklentisi "ThunderSTORM"24 kullanıldı (örneğin, görüntü yığınındaki yanıp sönen noktaların yerelleştirme koordinatlarını, çerçeve numarasını vb. içeren bir listeye dönüştürülmesi). ImageJ veya Fiji25 , tüm büyük masaüstü işletim sistemlerinde (Linux/Windows/macOS) çalışır ve ücretsiz olarak indirilebilir ve kullanılabilir.

  1. ThunderSTORM'u FijI'de kullanmak için Hohlbein Lab'ın güncelleme sitesini YARDIM | Güncelleme | Güncelleme Sitelerini Yönetin, Hohlbein Laboratuvarı onay kutusunu işaretleyin ve Fiji'yi yeniden başlatın. Programın yeterli belleğe erişimi olduğundan emin olun.
    NOT: Görüntü verilerinin ImageJ/Fiji tarafından okunabilecek bir dosya biçiminde olması gerekir. Verileri standart bir ticari sisteme kaydederken, ImageJ için Bio-Formats eklentisini (otomatik olarak Fiji ile birlikte gelir) kullanarak verileri doğrudan açın. Bu durumda, özel kurulumumuz tarafından kaydedilen verileri hdf5 formatından TIFF formatına dönüştürmek için bir MATLAB betiği h52tif.m (protokolün başında bahsedilen GitHub sayfasında sağlanır) kullanıldı.
    1. Kullanılan sistemde bulunan bellek miktarına ve kaydedilecek kare sayısına bağlı olarak, belleğin tükenmesini önlemek için verileri birkaç alt yığına bölün.
      NOT: Aşağıda, sonuçlar bölümünde gösterilen verileri çıkarmak için kullanılan ayarlar kullanılmaktadır. ThunderSTORM ayarlarının daha ayrıntılı bir açıklaması için, çevrimiçi olarak bulabileceğiniz ThunderSTORM eğitimlerine bakın.
  2. ThunderSTORM ayarlarını istenen kayıt koşullarına göre uyarlayarak yanıp sönen sinyallerin algılanması için ayarları optimize edin. ThunderSTORM'a tıklayın | Analizi çalıştırın, Kamera Kurulumu'nu seçin ve görüntü verilerinin doğru piksel boyutunu, A/D sayısını, kullanılan kameranın kuantum verimliliğini, temel seviyeyi ve EM kazancını girin (bu kurulum için piksel boyutu: 65 nm, A/D sayısı: 0,64, kuantum verimliliği: 0,8).
  3. Ardından, yanıp sönen sinyalleri uydurarak yerelleştirme koordinatlarını belirlemek için algoritmayı seçin. Görüntü Filtreleme bölümünde, B-Spline sıra 3 ve B-Spline ölçeği 2.0 ile Dalgacık filtresini (B-Spline) kullanın. Diğer ayarlar için Moleküllerin yaklaşık lokalizasyonu yöntemini Yerel maksimum, Tepe yoğunluğu eşiğini 2*std(Wave.F1) ve Bağlantı'yı 8 komşuluk olarak ayarlayın. Moleküllerin alt piksel lokalizasyonu bölümünde PSF: Entegre Gauss, Sığdırma yarıçapı [px]: 3, Sığdırma yöntemi: Maksimum olasılık ve İlk sigma [px]: 1.6'yı seçin.
  4. Algılanan her yerelleştirme ve özellikleri için bir giriş içeren bir tablo oluşturmak üzere eklentiyi çalıştırın. Tabloyu sabit sürücüye kaydedin.
  5. Birden fazla görüntü yığınının analiz edilmesi gerekiyorsa veya görüntü yığınlarının birkaç yığına bölünmesi gerekiyorsa (örneğin, büyük veri kümelerinin analizine izin vermek için veya veri analiz bilgisayarında fazla bellek yoksa), bir makro çalıştırarak yerelleştirme algılamasını otomatikleştirin.
  6. Edinme verilerinin birden çok görüntü yığınına bölünmesi gerekiyorsa, bir dosyayı birbiri ardına içe aktararak ThunderSTORM'daki yerelleştirme tablolarını birleştirin. İçe Aktar menüsündeki Geçerli Tabloya Ekle seçeneğinin etkinleştirildiğinden ve tablodaki yerelleştirmelerin üzerine yazılmasını önlemek için doğru başlangıç numarasının kullanıldığından emin olun.
  7. Tam yerelleştirme tablosu oluşturulduktan sonra, sonuç tablosundaki konumlardan görüntüyü yeniden oluşturarak sonucu kontrol edin. ThunderSTORM sonuçları penceresindeki Görselleştirme düğmesine basın ve yeniden oluşturulan görüntünün (örneğin, yerelleştirmelerin histogramı) görünmesini bekleyin.
  8. Yanal kayma ve diğer görüntüleme artefaktları gibi sorunlar için yeniden oluşturulan resmi kontrol edin. Veri yığınının (burada kullanılan) özetlenmiş alt bölümlerinin çapraz korelasyonunu belirleyerek veya örnekte referans işaretleyicileri kullanarak Sürüklenme alt menüsünde kaymayı ölçün ve düzeltin. >> menüsüne bastıktan sonra 5 bölme ve büyütme faktörünü (bu protokolde 6,5 ) girin. x ve y kaymasını gösteren bir pencerenin görünmesini bekleyin.
    NOT: Kayıttan sonraki ilk görüntülerde hala güçlü bir arka plan floresansı olabilir (floroforları karanlık duruma getirirken); bu nedenle, ilk birkaç yüz görüntüyü analizden çıkarmak gerekebilir (örneğin, ThunderSTORM ana penceresindeki Filtre alanına "kare >500" yazın).
  9. Ardışık birkaç karede görülebilen sinyallerin fazla sayılmasını önlemek için, ortalama yerelleştirme hassasiyetini (burada 20 nm ), 1 koyu çerçeveyi ve 0 maksimum kareyi (bir molekülün maksimum açık kalma süresinde kısıtlama yoktur) dikkate alan bir yarıçap kullanarak yerelleştirme verilerine birleştirme uygulayın.
  10. Yalnızca ince bir ışık optik ultra ince kesitin analiz edilmesi gerekiyorsa, odak düzleminin üstündeki ve altındaki tüm lokalizasyonları veri kümesinden hariç tutun. İlk olarak, sonuç tablosunu içeren pencerede Histogramı Çiz'e basarak z'de en fazla yerelleştirmeyi içeren noktayı arayın ve ardından filtreleme komutunu kullanarak bu noktanın 50 nm üstündeki ve altındaki yerelleştirmeleri atın:
    z > "histogram tepesi" - 50 & z < "histogram tepesi" + 50
  11. Kaydedilen bölümdeki DNA fraksiyonunu belirlemek için, adım 4.7.1'de kaydedilen görüntü yığınının her düzlemindeki (kalınlık 200 nm; her iki tarafta 100 nm) lokalizasyonları belirleyin. Eklentiler | Fırtına | İçe/İhracat | Sonuçları İçe Aktarın ve kaydedilen her dilimi 200 nm'ye filtreleyin. Bunun için filtre alanına yazdıktan sonra Uygula'ya tıklayın:
    z > -100 & z < 100
  12. Görselleştirme'ye tıklayın ve her dilimin bir görüntüsünü oluşturmak için Histogramlar seçeneğini seçin. Ortaya çıkan görüntüyü TIFF formatında bir klasöre kaydedin. Tüm açık görüntüleri kapatın. Bunu tüm görüntü düzlemleri için tekrarlayın.
  13. Tüm dilimleri açın ve Görüntü | Yığınlar | İstiflenecek Görüntüler. Resim Seç | Yığınlar | Z-Project'e gidin ve Toplam seçeneğini seçin. ImageJ'de ROI Yöneticisini açın (Analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi); ardından ImageJ ana penceresindeki ImageJ araç çubuğundan Poligon Seçim Aracını seçin ve çekirdeğin ana hatlarını çizin. ROI Yöneticisinde Ekle'ye tıklayın.
    1. Analiz Et'e tıklayın | Ölçümler'i ayarlayın ve Entegre Yoğunluk'u seçin. Analiz Et'e tıklayın | Ölçün. ThunderSTORM'da, yukarıda açıklandığı gibi merkez düzlemin sonuç tablosunu açın ve filtre alanında aşağıdaki komutu kullanarak 100 nm Kalınlığa filtreleyin:
      z > -50 & z < 50
  14. Yukarıda açıklandığı gibi filtrelenmiş yerelleştirmelerin bir histogramını oluşturun, tanımlanan ROI'yi ROI Yöneticisi'nde seçerek etkinleştirin ve Analiz Et | Ölçün.
  15. Ölçülen entegre yoğunlukları bölerek toplam lokalizasyon sayısına göre 100 nm kalınlığındaki orta bölümdeki lokalizasyonların fraksiyonunu belirleyin - mutlak DNA yoğunluklarını hesaplamak için adım 8.2'de gereken dönüştürme faktörü.
    NOT: DNA içeriği, lokalizasyon sayısı ile orantılıdır. Bu nedenle, görüntülenen süper çözünürlüklü görüntüdeki (orta bölüm) DNA fraksiyonunu tahmin etmek için, tüm çekirdeğin hacmi boyunca toplam lokalizasyon sayısını belirlemek ve ilgilenilen bölümdeki toplam lokalizasyon sayısını belirlemek yeterlidir. Bu, lokalizasyonların 2B histogramları oluşturularak gerçekleştirilebilir.

7. SMLM mikroskobunun Z kalibrasyonu

  1. Fiji'de bölüm 5'te kaydedilen görüntü yığınlarını açın.
  2. ThunderSTORM eklentisi menüsünde 3D kalibrasyon alt menüsünü seçin | Silindirik lens kalibrasyonu.
  3. Kalibrasyon verilerini kaydetmek için kullanılan adım boyutunu (10 nm) girin ve kalibrasyon için kullanılacak görüntü yığınının alanını tanımlayın.
  4. Kalibrasyon dosyasının kaydedileceği konumu belirtin.
  5. Moleküllerin alt piksel lokalizasyonu panelinde PSF: Eliptik Gauss (3D Astigmatizma) öğesini seçerek ve bölüm 5'te oluşturulan kalibrasyon dosyasının dosya yolunu ayarlayarak Analizi Çalıştır iletişim penceresinde kalibrasyon verilerini kullanın.

8. Voronoi Mozaikleme

NOT: Yerelleştirme tablosu oluşturulduktan ve düzenlendikten sonra, görüntü analizinin son adımı olan Voronoi mozaiklemeye geçin. Bu adım için MATLAB 2021'i kullanın; MATLAB komut dosyaları, "Nano Ölçekli Dağıtımlar için Yerelleştirme Analizörü" (LAND) yazılım paketinin bir parçasıdır ve Malzeme Tablosundaki bağlantılardan indirilebilir. Verilerin kaydedilmesine ve yerelleştirme tablosunun oluşturulmasına benzer şekilde, bellek ve işlem gücü ile iyi donatılmış bir sistem kullanmak önemlidir. Bu yayın için görüntüleri oluşturmak için kullanılan sistem, 128 GB RAM ve 9 çekirdekli Intel i9 CPU ile donatılmıştı.

  1. Yerelleştirme tablosunu bir MATLAB matrisine dönüştüren ve ".mat" formatında kaydeden MATLAB betiği "TS2Orte.m"yi çalıştırarak ThunderSTORM yerelleştirme tablosunu .csv formatından Orte formatına dönüştürün.
  2. Veriler doğru formatta olduğunda, Voronoi mozaikleme ve DNA yoğunluğu hesaplaması için hazırlıklara başlayın. Çekirdekteki baz çiftlerinin sayısını, hacme göre görüntülenen bölümdeki nispi lokalizasyon sayısına bölerek dönüştürme faktörünü hesaplayın (bkz. adım 6.15). LAND-Voronoi klasörüne gidin ve /coreAlgorithm alt klasöründe voronoiCluster.m dosyasını açın ve 13. satırdaki mutlak yoğunluk hesaplamaları için dönüştürme faktörünü ayarlayın.
    NOT: G1 HeLa çekirdeğinin bir örneği için Şekil 5'e bakın; 265'lik bir dönüşüm faktörü ölçüldü.
  3. Analizi başlatan komut dosyasını düzenleyin "VonoRoi.m". Orte yerelleştirme verilerinin dosya yolunu ve sonuç dosyaları için çıktı klasörünü ayarlayın. Koordinat listesinde, mozaiklemenin yapılması gereken alanı tanımlayan koordinatları belirtin. Voronoi mozaiklemesinin hesaplanması uzun zaman alabileceğinden (kullanılan makinenin özelliklerine bağlı olarak), aynı girdi veri kümesi içinde hesaplanacak birden fazla alan tanımlayın.
  4. Komut dosyasını çalıştırdıktan sonra, alan dağılımının histogramını gösteren grafikler içeren diğer dosyalarla birlikte mutlak DNA yoğunluklarını gösteren görüntüyü ve çıktı klasöründeki hesaplanan her bir Voronoi hücresinin yoğunluklarını içeren bir "densities.mat" dosyasını arayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 5'te gösterilen HeLa çekirdeği, Şekil 5'te gösterilen histogramdaki ilk tepe noktasına yakın entegre bir floresan yoğunluğuna sahip olmak için bölüm 3'te CellProfiler4.2.1 tarafından oluşturulan tablodan, G 1 fazındaki çekirdekleri temsil eden seçilmiştir. Küçük boyutu ve belirgin iç yapısı göz önüne alındığında, mitozdan sonra kromatinini yoğunlaştırma sürecinde olan erken bir G1 çekirdeği olması muh...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, SMLM kullanılarak memeli hücre çekirdeklerindeki mutlak DNA yoğunluklarının nasıl ölçüleceğini özetlemektedir. Ek olarak, kültürlenmiş hücrelerin hücre döngüsü aşamasının nasıl belirleneceğini ve bu bilginin hafif optik ultra ince bir kesitte bulunan DNA miktarını tahmin etmek için nasıl kullanılacağını gösterdik. Ayrıca, fBALM SMLM mikroskobu için yapışık hücrelerin hazırlanması ve hücre çekirdeklerinde genomik DNA'nın süper çözünürlüklü mikroskobik görüntülerini oluşturmak i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IMB Görüntüleme Çekirdek Tesisini kullanmamıza izin verdiği için Dr. Sandra Ritz'e, özel yapım SMLM mikroskobunu kullanmamıza izin verdiği için Dr. Shih-Ya Chen'e, insan fibroblastları sağladığı için Dr. Leonard Kubben'e (IMB), C3H10T1/2 hücre hattını sağladığı için Dr. Christof Niehrs'e (IMB) ve bu çalışma için değiştirdiğimiz MATLAB-Script için Dr. Jan Neumann'a teşekkür ederiz. Ayrıca verimli tartışmalar için Dr. Marion Cremer, Dr. Thomas Cremer ve Dr. Christoph Cremer'e teşekkür etmek istiyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hücre Kültürü
µ-Çanak 35 mm, yüksek ızgara-500 Cam tabanİbidi81168
C3H 10T1/2IMB (Niehrs Laboratuvarı)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSYaşam Teknolojileri16000-044
HelaMikroskopi Çekirdek Tesisi (IMB)
HFBIMB (Kubben Laboratuvarı)
L-GlutaminSigma-AldrichG7513
HFB için Temel Olmayan Aminoasitler ve Vitaminler
Sodyum PiruvatS8636
Örnek Hazırlık
KatalazMerck2593710
GlikozThermoFisher241922500
Glikoz OksidazMerck49180
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127
RNase KokteyliThermoFisherAM2286
SYTOX OrangeThermoFisherS11368
TetraSpeck Floresan Mikrosferler Örnekleyici KitiThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
Software
BioFormatlarOpenMicroscopy.orgAçık kaynak yazılım https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgAçık kaynak yazılım https://cellprofiler.org
Fijinih.govAçık kaynak yazılım https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
KARAnih.govAçık kaynak yazılım https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Matematik Eserleriticari yazılım - "Görüntü İşleme Araç Kutusu" gerektirir
R v.4.. 0.3r-project.orgAçık kaynak yazılım https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3Açık kaynak yazılım https://zitmen.github.io/thunderstorm/
mikroskoplar:
AF 7000Leica
Leica GSDLeica
SMLM MikroskobuCremer LaboratuvarıDr. S-Y tarafından özel olarak üretildi. Çetin

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Passarge, E. Emil Heitz and the concept of heterochromatin: longitudinal chromosome differentiation was recognized fifty years ago. American Journal of Human Genetics. 31 (2), 106-115 (1979).
  2. Cremer, T., Cremer, M. Chromosome territories. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (3), 003889(2010).
  3. Vecchio, L., Solimando, L., Biggiogera, M., Fakan, S. Use of halogenated precursors for simultaneous DNA and RNA detection by means of immunoelectron and immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (1), 45-55 (2008).
  4. Solimando, L., et al. Spatial organization of nucleotide excision repair proteins after UV-induced DNA damage in the human cell nucleus. Journal of Cell Science. 122, 83-91 (2009).
  5. Niedojadlo, J., et al. Transcribed DNA is preferentially located in the perichromatin region of mammalian cell nuclei. Experimental Cell Research. 317 (4), 433-444 (2011).
  6. Padeken, J., Heun, P. Nucleolus and nuclear periphery: velcro for heterochromatin. Current Opinion in Cell Biology. 28, 54-60 (2014).
  7. Zhang, Y., et al. Overview of histone modification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1283, 1-16 (2021).
  8. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Frontiers in Bioscience (Landmark Ed). 25 (6), 1058-1109 (2020).
  9. Saul, D., Kosinsky, R. L. Epigenetics of aging and aging-associated diseases). International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 401(2021).
  10. Eckersley-Maslin, M. A., Alda-Catalinas, C., Reik, W. Dynamics of the epigenetic landscape during the maternal-to-zygotic transition. Nature Reviews, Molecular Cell Biology. 19 (7), 436-450 (2018).
  11. Stevens, T. J., et al. 3D structures of individual mammalian genomes studied by single-cell Hi-C. Nature. 544 (7648), 59-64 (2017).
  12. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  13. Cremer, C., Masters, B. R. Resolution enhancement techniques in microscopy. The European Physical Journal H. 38 (3), 281-344 (2013).
  14. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  16. Szczurek, A., et al. Super-resolution binding activated localization microscopy through reversible change of DNA conformation. Nucleus. 9 (1), 182-189 (2018).
  17. Szczurek, A., et al. Imaging chromatin nanostructure with binding-activated localization microscopy based on DNA structure fluctuations. Nucleic Acids Research. 45 (8), 56(2017).
  18. Levet, F., et al. SR-Tesseler: a method to segment and quantify localization-based super-resolution microscopy data. Nature Methods. 12 (11), 1065-1071 (2015).
  19. Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  21. Team, R. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).
  22. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  24. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Maeshima, K., et al. The physical size of transcription factors is key to transcriptional regulation in chromatin domains. Journal of Physics. Condensed Matter. 27 (6), 064116(2015).
  27. Itoh, Y., Woods, E. J., Minami, K., Maeshima, K., Collepardo-Guevara, R. Liquid-like chromatin in the cell: What can we learn from imaging and computational modeling. Current Opinion in Structural Biology. 71, 123-135 (2021).
  28. Strickfaden, H., Xu, Z. Z., Hendzel, M. J. Visualization of miniSOG tagged DNA repair proteins in combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI). Journal of Visualized Experiments. (103), e52893(2015).
  29. Xie, L., et al. BRD2 compartmentalizes the accessible genome. Nature Genetics. 54 (4), 481-491 (2022).
  30. Heo, S. J., et al. Nuclear softening expedites interstitial cell migration in fibrous networks and dense connective tissues. Science Advances. 6 (25), (2020).
  31. Gelléri, M., et al. True-to-scale DNA-density maps correlate with major accessibility differences between active and inactive chromatin. bioRxiv. , (2022).
  32. Derenzini, M., Olins, A. L., Olins, D. E. Chromatin structure in situ: the contribution of DNA ultrastructural cytochemistry. European Journal of Histochemistry. 58 (1), 2307(2014).
  33. Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589, 2931-2943 (2015).
  34. Shah, F. A., Johansson, B. R., Thomsen, P., Palmquist, A. Ultrastructural evaluation of shrinkage artefacts induced by fixatives and embedding resins on osteocyte processes and pericellular space dimensions. Journal of Biomedical Materials Research A. 103 (4), 1565-1576 (2015).
  35. Gavelis, G. S., et al. Dinoflagellate nucleus contains an extensive endomembrane network, the nuclear net. Scientific Reports. 9 (1), 839(2019).
  36. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: a novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801-810 (2009).
  37. Gorisch, S. M., Richter, K., Scheuermann, M. O., Herrmann, H., Lichter, P. Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by microinjected macromolecules. Experimental Cell Research. 289 (2), 282-294 (2003).
  38. Lenart, P., et al. Nuclear envelope breakdown in starfish oocytes proceeds by partial NPC disassembly followed by a rapidly spreading fenestration of nuclear membranes. The Journal of Cell Biology. 160 (7), 1055-1068 (2003).
  39. Verschure, P. J., et al. Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules. EMBO Reports. 4 (9), 861-866 (2003).
  40. Strickfaden, H., et al. Condensed chromatin behaves like a solid on the mesoscale in vitro and in living cells. Cell. 183 (7), 1772-1784 (2020).
  41. Lin, Y. R., et al. M33 condenses chromatin through nuclear body formation and methylation of both histone H3 lysine 9 and lysine 27. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1868 (11), 119100(2021).
  42. Strickfaden, H., Sharma, A. K., Hendzel, M. J. A charge-dependent phase transition determines interphase chromatin organization. bioRxiv. , (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Density MappingCell NucleiSingle Molecule LocalizationSuper Resolution MicroscopyChromatin StructureVoronoi TessellationFPALM ImagingEpigenetic ModificationsCell Cycle StagesHeterochromatin Euchromatin

Related Articles