Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak Hücre Çekirdeğinde Mutlak DNA Yoğunluğunun Haritalanması

Hücre biyolojisinin ilk günlerinden beri, genetik bilginin merkezi olan hücre çekirdeği biyologları büyülemiştir. Emil Heitz, kendi geliştirdiği sitolojik boyama yöntemlerini uyguladıktan sonra, 1928'de hücre çekirdeği¹ içinde farklı, yoğun boyalı alanlar keşfetti. Daha yoğun lekeli, yoğun alanlara "heterokromatin" adını verirken, daha az güçlü lekeli, daha az yoğun alanlara "ökromatin" adını verdi. Zamanla, aktif genlerin çoğunlukla ökromatinde yer aldığı, daha yoğun alanların ise tekrarlayan elementler ve sessiz genler açısından zengin olduğu ortaya çıktı. Heterokromatin ve ökromatin terimleri, tanımları yapısaldan moleküler özelliklere değişmiş olsa da günümüze kadar gelmiştir (aşağıya bakınız). Bugün hücre çekirdeğinin iki ana aşamaya ayrıldığını biliyoruz. Nükleer gövdeleri, ekleme bölmesini ve nükleoplazmayı barındıran bir sıvı (kromatin arası bölme) ve kromozom bölgelerini ve nükleol^2'yi içeren diğer katı, hidrojel benzeri kromatin alanı. Kromatinler arası boşluğun arayüzünde, kromatin daha az yoğundur ve burası çoğunlukla transkripsiyon, replikasyon ve onarım gibi genetik olarak aktif süreçlerin gerçekleştiği yerdir ^3,4,5, laminaya bitişikken, nükleollerin etrafında ve sentromerlerin yakınında, kromatin yüksek sıkıştırma seviyeleri gösterir ve genel olarak transkripsiyonel olarak oldukça aktif değildir⁶.

Moleküler düzeyde, kromatin, nükleozomların (çekirdek histon proteinlerinin bir oktameri) etrafına sarılmış DNA'dan yapılır. Histonlar, çeşitli kimyasal gruplar (metil-, asetil, fosfor-, biyotin), amino asitler (arginin) ve hatta proteinler (SUMO, Ubiquitin)⁷ eklenerek translasyon sonrası modifiye edilebilen özünde düzensiz kuyruk alanlarına sahiptir. Bu modifikasyonlar okunabilir ve diğer proteinleri (örneğin, kromatin yeniden şekillendirici, HP1, onarım proteinleri, RNA) çekebilir ve böylece dizisini doğrudan değiştirmeden DNA dizisinin fizyolojik durumunu (transkripsiyonel olarak izin verici/kısıtlayıcı) tanımlayabilir (dolayısıyla "epi"genetik)⁷. Belirli bir dizi etrafındaki modifikasyonların türü ve sayısı, hücre tipleri arasında derinden farklılık gösterebilir, tersine çevrilebilir ve gelişim, yaşlanma ve hastalık^{boyunca değişebilir 8,9,10}. Yüksek oranda kopyalanan bölgelerde daha yaygın olan histon kuyruklarının modifikasyonları ve genomun transkripsiyonel aktivitesi çok az olan veya hiç olmayan bölgelerinde baskın olan modifikasyonlar vardır.

Örneğin, H3K4 modifikasyonları açısından zengin olan veya histon kuyrukları asetillenmiş yüksek oranda kopyalanmış bölgeler genellikle ökromatin olarak tanımlanırken, baskılayıcı histon modifikasyonları açısından zengin alanlar (H3K9me3, H3K27me3 veya H4K20me3) heterokromatin olarak adlandırılır ve ayrıca kurucu heterokromatin (tüm hücrelerde transkripsiyonel olarak aktif değildir) (örneğin, H4K20me3) ve fakültatif heterokromatin (hücre tipine bağlı olarak kromatin susturulur, örneğin, H3K27me3)⁶. Biyokimyasal ve moleküler biyolojik yöntemler, dizi düzeyinde kimyasal değişiklikleri ölçmek için çok uygun olsa da, bu yöntemleri kullanarak orta ölçekte uzamsal özellikler hakkında açıklamalar yapmak için bunları kullanmak çok daha zordur.

Örneğin, genom^11'in uzamsal modellerini yeniden yapılandırmak için, dizi bölgeleri arasındaki DNA'nın yakın yakınlıklarını tespit eden ve haritalayan Hi-C deneylerinden elde edilen yakınlık bilgileri kullanılarak girişimlerde bulunulmuştur. Ancak yüksek çözünürlüklü ışık ve elektron mikroskobu görüntüleri ile doğrudan karşılaştırma bunun ancak sınırlı ölçüde mümkün olduğunu göstermektedir (Şekil 1). Hi-C¹² gibi yöntemler, interfaz hücrelerindeki kromozom bölgelerini ayrı varlıklar olarak doğru bir şekilde tespit edebilse de, bu modeller oldukça "miyoptur", çünkü DNA dizisi yakınlıkları tek başına genomun daha uzak kısımları arasındaki uzamsal ilişkileri yansıtmak için kördür ve bu nedenle uygun bir 3D genom rekonstrüksiyonu için çok uygun değildir. Bu nedenle yoğunluk farklılıkları da temas frekansı bilgisi ile doğru şekilde yansıtılamaz. Bu, çekirdekteki genomun "spagettileştirilmiş" temsillerine yol açar (bkz. Şekil 1B), bunlar yün benzeri, serbestçe erişilebilen halkalardan oluşan bir topta meydana geliyor gibi görünmektedir.

Biyokimyasal bilgiyi biyofiziksel ve yapısal verilerle birleştiren bütünleştirici, daha gerçekçi bir çekirdek resminin önünü açmak için, nükleer organizasyonun farklı yönleri hakkında veri üretilmesine izin veren yöntemlerin geliştirilmesi gerekmektedir. Yakın zamana kadar, görüntüleme verilerinden hücre çekirdeğindeki mutlak DNA yoğunluklarını belirlemek de zordu. Bunun nedenleri, geleneksel ışık mikroskoplarının sınırlı çözünürlüğü, DNA'yı spesifik olarak boyamak için elektron mikroskobundaki problemler ve elektron mikroskobundaki küçük gözlem hacimleriydi.

Geleneksel floresan mikroskopların çözünürlüğü, ışığın kırınımı ile sınırlıdır. Bir nokta ışık kaynağının görüntüsü, kırınım sınırı nedeniyle yayılır ve Nokta Yayılma Fonksiyonu (PSF) ile tanımlanabilir. PSF'ye göre, iyi bir yaklaşımla nokta ışık kaynağı olarak kabul edilebilecek bir floroforun görüntüsü, menşe kaynağının (florofor) çevresinde belirli bir büyüklükte bir hacim ^kaplar13. Kırınımla sınırlı görüntülerinin boyutlarından çok daha yakın olan birçok florofor aynı anda uyarıldığında, görüntülenen yoğunluk dağılımları üst üste bindirilir ve tek floroforların konumu çözülemez. Floroforlardan sıralı, stokastik ışık emisyonu (yanıp sönme), tek tek moleküllerin optik izolasyonuna ve böylece sinyallerinin yoğunluk ağırlık merkezlerini belirleyerek tam konumlarını bulmaya izin verir.

Bu, kaydedilen birçok görüntüden florofor lokalizasyon verilerinin birikmesiyle numunelerin yapısal bilgilerini yeniden oluşturmak için kullanılabilir. Bu yöntem genellikle tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) olarak adlandırılır (daha fazla bilgi için bkz.¹⁴). Bir florofor 'zamanında' ne kadar çok foton yayarsa, yoğunluk yerçekimi merkezleri o kadar kesin olarak belirlenebilir. Işın yolundaki astigmatik mercekler, optik odak düzleminin üstündeki veya altındaki florofor sinyallerini, optik eksen boyunca konumlarını belirlemek için kullanılabilen elipslere dönüştürür. Odak düzleminin altındaki floresan sinyallerden kaynaklanan elipslerin uzun eksenleri, odak düzleminin üzerindeki floroforlardan kaynaklanan elipslerin eksenlerine kıyasla 90° döndürülür. Ayrıca, bu elipslerin eksen oranı, molekülün optik eksen boyunca odak düzlemine göre ±300^nm15 aralığında konumunun belirlenmesine izin verir.

Stokastik yanıp sönme olaylarının yeniden yapılandırılmasıyla oluşturulan süper çözünürlüklü görüntülerin kalitesi, büyük ölçüde etiketleme yoğunluğuna ve yanıp sönme olaylarının sayısına bağlıdır. İkincisi, floroforların fotostabilitesine ve sonunda başarısız olmadan önce yanıp sönme olaylarının sayısına (açma/kapama döngülerinin sayısı) bağlıdır. Nükleer DNA dağılımının süper çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için burada açıklanan yöntem, fBALM (DNA yapısı dalgalanan-yardımlı, bağlanma-aktive olan lokalizasyon mikroskobu) olarak adlandırılır. Geçici olarak nükleik asitlere karışan ve yalnızca DNA'ya^16,17 bağlandıktan sonra floresan veren floroforlara dayanır. Fosfor-diester omurgasının yüklü kalıntıları nedeniyle DNA, oldukça negatif yüklü bir polimerdir. Canlı hücrelerde tamamlayıcı DNA zincirlerinin stabilizasyonu, pozitif yüklü proteinler (örneğin histonlar) ve iyonlar tarafından nötralizasyon gerektirir. pH'ı düşürerek, bazların tamamlayıcı eşleşmesinin stabilitesi, araya giren boyaların içeri ve dışarı yayılmasına izin verecek şekilde azaltılır^16,17.

Araya giren floresan boyaya bağlı olarak bu duruma belirli bir pH aralığında ulaşılabilir. YoYo-1 ve SYTOX Orange gibi floresan boyalar yalnızca DNA'ya bağlandıklarında floresan verirler ve interkalasyon boyaları (Hoechst ve 4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI] gibi DNA'nın küçük oluğunu bağlayan boyaların aksine) genellikle diziden bağımsız bir şekilde bağlanır, lokalizasyon mikroskobu ile DNA'nın hücre çekirdeği içindeki dağılımını haritalamak için çok uygundurlar.

Voronoi mozaikleme, noktaların konumuna bağlı olarak uzayın farklı bölümlere bölünmesine izin veren matematiksel bir yöntemdir. 2B-Uzayda, ortaya çıkan karoların boyutu,¹⁸. noktaların yoğunluğunun tersini yansıtır. Lokalizasyon mikroskobu, görüntüleri floroforların konumunu temsil eden bir dizi nokta olarak yeniden oluşturduğundan, Voronoi mozaikleme, lokalizasyon sinyallerinin yoğunluğunun belirlenmesine yardımcı olabilir (Şekil 2). Bu nedenle, florofor olarak DNA'ya özgü bir boyanın kullanılması, DNA yoğunluklarının ölçülmesine izin verir.

DNA içeriği (baz çiftlerinin sayısı) ve çekirdeğin uzamsal boyutu hakkında önceden bilgi, nispi DNA yoğunluklarının mutlak DNA yoğunluklarına dönüştürülmesine izin verir. Aşağıdaki protokol, SMLM kullanılarak yapışık hücrelerdeki mutlak DNA yoğunluklarının çok yüksek çözünürlükte haritalanmasını gösterir ve bu yoğunlukların büyük varyasyonlara tabi olduğunu gösterir.

NOT: Şekil 3 , bu bölümde açıklanan iş akışına genel bir bakış sağlar. Bu protokolde kullanılan reaktifler, malzemeler, ekipman ve yazılımla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Bu yayın için kullanılan kod buradan görüntülenebilir ve indirilebilir: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Hücre kültürü

1. %5 CO 2 ile desteklenmiş nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM'de C3H10T1/2, HFB ve HeLa hücrelerini yetiştirin_. Hücreler birleşmeye yakın olduğunda, hücreleri sırasıyla 1:3 (C3H10T1/2, HFB) ve 1:10 (HeLa) oranında bölerek alt kültürleyin.
2. Ölçümleri yapmadan bir gün önce, üstel olarak büyüyen kültürlerden hücreleri 35 mm'lik ızgaralı bir tabağa tohumlayın. Gözlem kaplarının floresan mikroskobu için mükemmel optik kalite sağladığından (170 μm kalınlığında cam taban, #1.5) ve hücrelerin yerini kesin olarak belirlemek için bir ızgaraya sahip olduğundan emin olun. Ayrıca hücrelerin tek hücreli bir süspansiyon halinde olduğundan ve çanak yüzeyinin tüm alanının homojen bir şekilde hücrelerle kaplandığından emin olun.
   NOT: Belirli bir hücre döngüsü aşamasına atanan hücreleri bir kez daha bulmak için baskılı ızgaralı tabakların kullanılması önerilir.
3. Deney gerektiriyorsa, hücre kültürü ortamına 100 nM Trikostatin A (TSA) ekleyin ve hücreleri daha önce adım 1.1'de açıklanan koşullar altında inkübe edin.

2. Numune hazırlama

1. Ölçüm gününde, hücreleri 1x DPBS içinde %4 paraformaldehit (PFA) içinde 30 dakika sabitlemeden önce 1x DPBS ile bir kez yıkayın.
   NOT: Tekrarlanabilir sonuçlar için, her seferinde yeni bir PFA çözeltisinin hazırlandığından emin olun ve PFA konsantrasyonunun doğru olmasına özellikle dikkat edin.
2. Fiksatifi çıkardıktan sonra, hücreleri %0.4 Triton X-100 içeren 1x DPBS'de 20 dakika geçirgenleştirmeden önce 1x DPBS ile tekrar 2x yıkayın.
3. Geçirgenleştirme tamponunu bir pipetle çıkarın ve hücrelere bir RNase kokteyli (1x DPBS'de 1:1.000 seyreltme) uygulamadan önce 1x DPBS ile ek bir yıkama adımı gerçekleştirin. Hücreleri nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
4. fBALM özellikli SYTOX Orange stok çözeltisini (1:10.000 seyreltmede 1x DPBS'de 5 mM) seyrelterek boyama çözeltisini hazırlayın.
5. Bir pipet kullanarak RNase tamponunu çıkarın ve boyama solüsyonunu eklemeden önce 1x DPBS ile ek bir yıkama adımı uygulayın. Hücreleri oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 5 dakika inkübe edin.
6. SYTOX Orange boyama solüsyonunu bir pipetle hücrelerden çıkarın, 1x DPBS ile yıkayın ve hücreleri yoğun ışıktan koruyarak 1x DPBS'de saklayın.

3. Sitometrik hücre döngüsü tayini

NOT: Bu adım için, burada ters çevrilmiş yüksek içerikli bir tarama mikroskobu kullanılmıştır, ancak herhangi bir otomatik, ters geniş alan floresan mikroskobu kullanılabilir. Tüm çekirdeğin yoğunluğu, DNA içeriğinin bir ölçüsüdür; Bu nedenle, konfokal bir sistem kullanıyorsanız iğne deliğini tamamen açtığınızdan emin olun. Düşük sayısal açıklıklı (NA) objektif havalı lensler, yağa daldırmalı objektif lenslere tercih edilir.

1. Hücrelerin bulunduğu çanağı, otomatik olarak kaydedilen görüntüleri bir araya getirerek numune üzerindeki geniş alanların yeniden yapılandırılmasına izin veren motorlu bir sahne ve yazılımla donatılmış bir ters floresan mikroskobuna koyun.
2. Hücre döngüsü belirleme için görüntü alımının makul bir süre içinde gerçekleştirilebilmesi için görüş alanı başına yeterli hücrenin (toplamda en az 900 tek çekirdek [ayrıntılar için bakınız Roukos ve ^ark.19]) kaydedilmesine izin veren bir objektif lens seçin. Merkez ve sınırlar arasında büyük yoğunluk farklılıkları göstermeyen bir lens kullanın. Böyle bir lens mevcut değilse, görüntülere düz alan düzeltmesi uygulayın (bkz. adım 7). Bu protokolü takip etmek için, odak derinliği = 8 μm olan 20x NA 0.4 hava merceği ile donatılmış geniş alanlı bir floresan mikroskobu kullanın.
3. Görüntü elde etme sırasında, kullanılan florofor için uygun filtreler kullanarak çanağın orta alanını kaplayın. İletilen ışık modunda parlak alan görüntüleri çekin.
   NOT: Parlak alan görüntüleri, adım 4.6'daki ızgaradaki hücrelerin yeniden konumlandırılması için önemlidir.
4. Hücrelerle birlikte kabı 4.4. adıma kadar 4 °C'de buzdolabına koyun.
5. Kaydedilen tek görüntüleri bir araya getirerek taranan alanı tek görüntülerden yeniden oluşturun.
6. Floresan DNA boyasının görüntü verilerini açık kaynaklı yazılım CellProfiler4.2.1^20'yi çalıştıran bir bilgisayara aktarın.
7. Floresan görüntülerin düz alan düzeltmesi gerekiyorsa, kaydedilen resimlerden kullanılan mikroskobun bir referans görüntüsünü oluşturun. Illumination Correction.cpproj işlem hattını açın ( Ek Dosya 1 olarak dahil edilir); Ardışık düzenin, ekranda farklı adımların tıklanabileceği bir sıra olarak göründüğünü gözlemleyin. Görüntüleri, işlem hattının ilk adım görüntülerinde belirlenen alana sürükleyip bırakın.
   NOT: Pencerenin alt kısmındaki filtre seçeneklerini kullanarak listelenen dosyalardaki tüm görüntü olmayan verileri hariç tuttuğunuzdan emin olun.
8. Aydınlatma düzeltme hattının son adımında, referans görüntülerin depolanacağı bir konum tanımlamak için Görüntüleri Kaydet'e tıklayın ve ardından Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayın.
9. CellCycleAnalysis.cpproj işlem hattını açın (Ek Dosya 2 olarak dahil edilir). Adım 3.3'te kaydedilen görüntüleri sürükleyip bırakın (örnek olarak Şekil 4A), referans görüntü (adım 3.8) dahil olmak üzere, ilk adımda belirlenen alana Boru hattının görüntüleri.
   NOT: Pencerenin alt kısmındaki filtre seçeneklerini kullanarak listelenen dosyalardaki tüm görüntü olmayan verileri hariç tuttuğunuzdan emin olun.
10. İşlem hattının CorrectIlluminationApply adımında, Aydınlatmayı Seç işlevini seçerek açılan menüden referans görüntüyü seçin.
11. Hücre döngüsü analizi boru hattının son adımında, referans görüntünün adım 3.7'de depolandığı bir konum tanımlayın ve adım 3.3'te kaydedilen görüntülerdeki tüm çekirdeklerin entegre floresan yoğunluklarını toplu olarak ölçmeye başlamak için Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayın.
    NOT: CellProfiler4.2.1, ölçülen her çekirdeğin verilerini (Görüntü, ObjectID, entegre floresan yoğunluğu, Görüntü koordinatları) CSV formatında içeren bir "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt" metin dosyası oluşturacaktır.
12. İşlem hattının DisplayHistogram öğesinin etkin olarak denetlendiğinden emin olun.
13. G₁ ve G₂ tepe noktaları için histogramdaki entegre floresan yoğunluklarına dikkat edin (örnek olarak Şekil 4B'ye bakın) ve etraflarındaki aralıkları boru hattının FilteredObjects öğelerine girin. Onay kutularına tıklayarak ardışık düzen öğelerini etkinleştirin.
14. G₁ veya G₂ fazındaki hücreleri vurgulayan bir görüntü oluşturmak için ilgili DisplayDataOnImage ardışık düzen öğelerini etkinleştirin ve ardışık düzeni yeniden çalıştırın (örnek olarak Şekil 4C'ye bakın).
15. Gözlem odasının işaretli alanında oluşturulan görüntüden istenen hücre döngüsü fazını temsil eden en fazla beş hücre seçin ve hücreleri SMLM mikroskobunda yeniden konumlandırmaya çalışın.
    NOT: Burada genom boyutu bilinmeyen iki hücre dizisi kullanıldığından, genom boyutları, bir insan fibroblast hücre hattının G₁ pikleri ile HeLa ve C3H10T1/2 hücrelerinin G₁ pikleri karşılaştırılarak belirlendi. Histogramlar ve genom boyutları arasındaki orantılı ilişki Ek Şekil S1'de görüntülenebilir.

4. SMLM-fBALM

NOT: Bu kombine biyokimyasal reaksiyonlardaki net oksijen toplamı sıfır olmasına rağmen, sınırlı oksijen konsantrasyonları D-glukono-1,5-lakton üretimini yavaşlatabileceğinden, reaksiyonun kapalı olmayan bir kapta gerçekleştirilmesi önerilir. Artan D-glukono-1,5-lakton konsantrasyonu, pH'ın hemen düşürülmesi numunenin üst yapısını değiştireceğinden gerekli olan pH'ı kademeli olarak düşürür.

1. Aşağıdaki bileşenleri karıştırarak 1 mL görüntüleme tamponu hazırlayın: 900 μL glikoz (1x DPBS'de 1 g/mL glikoz), 50 μL glikoz oksidaz (1x DPBS'de 0.5 mg/mL) ve 50 μL katalaz (1x DPBS'de 40 μg/mL).
2. Bir pipet kullanarak numuneden 1x DPBS'yi çıkarın ve hücreleri içeren kaba 1 mL görüntüleme tamponu ekleyin.
3. Çanağı SMLM özellikli bir mikroskobun tablasına monte edin. Yüksek NA objektif merceği ve yüksek optik büyütme kullanın.
4. Çanağın koordinat sistemini kullanarak seçilen çekirdeklerden birini (adım 3.15'ten itibaren) bulun ve kameranın görüş alanında ortalayın.
   NOT: Enzimatik reaksiyon, fBALM yöntemi için doğru pH'a ulaşılana ve uygun yanıp sönmeyi kolaylaştırana kadar ~60-180 dakika sürer. Sıcaklık değişiklikleri eksenel kaymaya yol açabileceğinden, numunenin cihazın sıcaklığına uyum sağlaması için yeterli zaman sağlamak amacıyla gözlem kabının mümkün olan en kısa sürede monte edilmesi önerilir. SMLM mikroskobunun bulunduğu odadaki sıcaklığın ölçüm boyunca sabit olduğundan emin olun.
5. Mikroskobun z-sürücüsü ile odağı değiştirerek ve üst ve alt sınırların konumunu kaydederek çekirdeğin yüksekliğini belirleyin.
6. Farklı zaman noktalarında, lazer gücünü artırarak fBALM işlemi tarafından üretilen düzgün yanıp sönmeyi kontrol edin. Örnek uygun stokastik yanıp sönmeyi gösterdiğinde, süper çözümlenmiş SMLM'nin yeniden yapılandırılması için gereken görüntü serisini elde etmeye başlayın.
   NOT: fBALM için kullanılan mikroskop, kullanılan floroforu uyarmaya uygun ve çerçeve başına yeterli foton sayısını sağlamak için yeterince yüksek foton yoğunlukları üretebilen uyarma lazerleri ile donatılmalıdır. Bunu diğer tüm deneylerden önce bir pilot deneyde test edin.
7. fBALM işleminin düzgün bir şekilde yanıp sönmesi sağlandıktan sonra, ~20 fps'lik bir kare hızıyla sonuçlanan 50 ms'lik bir pozlama süresi kullanarak görüntü serisini almaya başlayın.
8. 200 nm adım aralıkları ve ışık optik bölümü başına yalnızca 500 kare ile çekirdekten (orta bölüm etrafında) bir z-yığını alın. Orta bölüme geri dönün, yapısal ayrıntıların yüksek yerelleştirme hassasiyetinde iyi bir şekilde yeniden yapılandırılması için yeterli yanıp sönme olayını toplamak için 50.000 karelik bir görüntü serisi çekin (bu ~45 dakika sürecektir).
   NOT: Z-yığını, tüm çekirdeğe göre DNA sinyalinin orta bölümün fraksiyonunu belirlemek için önemlidir. Etkin piksel boyutunun SMLM²² için çok uygun olduğundan ve kameradaki sinyalin sensörü doyurmadığından emin olun.
9. Aşağıdaki gereksinimlerin karşılandığından emin olun
   1. 16 bitlik görüntülerin sayısına ve boyutuna bağlı olarak, görüntü yığınlarının dosya boyutları oldukça büyük olabileceğinden, edinme bilgisayarının yeterli disk alanı içerdiğinden emin olun.
   2. Edinme yazılımını çalıştıran bilgisayarın, kullanılan depolama aygıtında büyük dosya boyutlarını (>4 GB) işleyebilen bir dosya sistemini işleyebildiğinden ve görüntü verilerini doğrudan depolama aygıtına kaydederken depolama aygıtına aktarım hızının dosyaları gerçek zamanlı olarak yazmak için yeterince yüksek olduğundan emin olun.
   3. Görüntü alındıktan sonra verileri kaydederken, bilgisayarın yeterli RAM (örn. 64 GB) ile donatıldığından emin olun.

5. SMLM mikroskobunun z-kalibrasyonu için floresan boncuklu bir kap hazırlama ve kaydetme

NOT: Optik eksen boyunca doğru konumları atamak için mikroskobun astigmatik lenslerinin uygun eksenel kalibrasyonu için, floresan 100 nm boncukların z yığınlarının kaydedilmesi düşünülmelidir.

1. Boncukları 1x DPBS'de 1:10.000 oranında seyreltin ve 100 nm boncukları SMLM ölçümleri için kullanılan aynı tip tabağa tohumlayın.
   NOT: Yalnızca #1.5 lameller gibi en iyi optik kaliteyi ve özellikleri kullanın.
2. Kalibrasyon kabını mikroskoba monte edin; Boncukların odak düzlemi boyunca görüntü yığınlarını kaydedin (toplamda ~1,5 μm; burada 10 nm'lik adımlar kullanılmıştır)¹⁵.
3. Verileri veri analiz bilgisayarına aktarın.
   NOT: Kalibrasyon slaytlarını uzun süre saklamayın ve kullanmayın.

6. SMLM veri işleme

NOT: Yerelleştirmelerin kaydı için ImageJ²³ eklentisi "ThunderSTORM"²⁴ kullanıldı (örneğin, görüntü yığınındaki yanıp sönen noktaların yerelleştirme koordinatlarını, çerçeve numarasını vb. içeren bir listeye dönüştürülmesi). ImageJ veya Fiji²⁵ , tüm büyük masaüstü işletim sistemlerinde (Linux/Windows/macOS) çalışır ve ücretsiz olarak indirilebilir ve kullanılabilir.

1. ThunderSTORM'u FijI'de kullanmak için Hohlbein Lab'ın güncelleme sitesini YARDIM | Güncelleme | Güncelleme Sitelerini Yönetin, Hohlbein Laboratuvarı onay kutusunu işaretleyin ve Fiji'yi yeniden başlatın. Programın yeterli belleğe erişimi olduğundan emin olun.
   NOT: Görüntü verilerinin ImageJ/Fiji tarafından okunabilecek bir dosya biçiminde olması gerekir. Verileri standart bir ticari sisteme kaydederken, ImageJ için Bio-Formats eklentisini (otomatik olarak Fiji ile birlikte gelir) kullanarak verileri doğrudan açın. Bu durumda, özel kurulumumuz tarafından kaydedilen verileri hdf5 formatından TIFF formatına dönüştürmek için bir MATLAB betiği h52tif.m (protokolün başında bahsedilen GitHub sayfasında sağlanır) kullanıldı.
   1. Kullanılan sistemde bulunan bellek miktarına ve kaydedilecek kare sayısına bağlı olarak, belleğin tükenmesini önlemek için verileri birkaç alt yığına bölün.
      NOT: Aşağıda, sonuçlar bölümünde gösterilen verileri çıkarmak için kullanılan ayarlar kullanılmaktadır. ThunderSTORM ayarlarının daha ayrıntılı bir açıklaması için, çevrimiçi olarak bulabileceğiniz ThunderSTORM eğitimlerine bakın.
2. ThunderSTORM ayarlarını istenen kayıt koşullarına göre uyarlayarak yanıp sönen sinyallerin algılanması için ayarları optimize edin. ThunderSTORM'a tıklayın | Analizi çalıştırın, Kamera Kurulumu'nu seçin ve görüntü verilerinin doğru piksel boyutunu, A/D sayısını, kullanılan kameranın kuantum verimliliğini, temel seviyeyi ve EM kazancını girin (bu kurulum için piksel boyutu: 65 nm, A/D sayısı: 0,64, kuantum verimliliği: 0,8).
3. Ardından, yanıp sönen sinyalleri uydurarak yerelleştirme koordinatlarını belirlemek için algoritmayı seçin. Görüntü Filtreleme bölümünde, B-Spline sıra 3 ve B-Spline ölçeği 2.0 ile Dalgacık filtresini (B-Spline) kullanın. Diğer ayarlar için Moleküllerin yaklaşık lokalizasyonu yöntemini Yerel maksimum, Tepe yoğunluğu eşiğini 2*std(Wave.F1) ve Bağlantı'yı 8 komşuluk olarak ayarlayın. Moleküllerin alt piksel lokalizasyonu bölümünde PSF: Entegre Gauss, Sığdırma yarıçapı [px]: 3, Sığdırma yöntemi: Maksimum olasılık ve İlk sigma [px]: 1.6'yı seçin.
4. Algılanan her yerelleştirme ve özellikleri için bir giriş içeren bir tablo oluşturmak üzere eklentiyi çalıştırın. Tabloyu sabit sürücüye kaydedin.
5. Birden fazla görüntü yığınının analiz edilmesi gerekiyorsa veya görüntü yığınlarının birkaç yığına bölünmesi gerekiyorsa (örneğin, büyük veri kümelerinin analizine izin vermek için veya veri analiz bilgisayarında fazla bellek yoksa), bir makro çalıştırarak yerelleştirme algılamasını otomatikleştirin.
6. Edinme verilerinin birden çok görüntü yığınına bölünmesi gerekiyorsa, bir dosyayı birbiri ardına içe aktararak ThunderSTORM'daki yerelleştirme tablolarını birleştirin. İçe Aktar menüsündeki Geçerli Tabloya Ekle seçeneğinin etkinleştirildiğinden ve tablodaki yerelleştirmelerin üzerine yazılmasını önlemek için doğru başlangıç numarasının kullanıldığından emin olun.
7. Tam yerelleştirme tablosu oluşturulduktan sonra, sonuç tablosundaki konumlardan görüntüyü yeniden oluşturarak sonucu kontrol edin. ThunderSTORM sonuçları penceresindeki Görselleştirme düğmesine basın ve yeniden oluşturulan görüntünün (örneğin, yerelleştirmelerin histogramı) görünmesini bekleyin.
8. Yanal kayma ve diğer görüntüleme artefaktları gibi sorunlar için yeniden oluşturulan resmi kontrol edin. Veri yığınının (burada kullanılan) özetlenmiş alt bölümlerinin çapraz korelasyonunu belirleyerek veya örnekte referans işaretleyicileri kullanarak Sürüklenme alt menüsünde kaymayı ölçün ve düzeltin. >> menüsüne bastıktan sonra 5 bölme ve büyütme faktörünü (bu protokolde 6,5 ) girin. x ve y kaymasını gösteren bir pencerenin görünmesini bekleyin.
   NOT: Kayıttan sonraki ilk görüntülerde hala güçlü bir arka plan floresansı olabilir (floroforları karanlık duruma getirirken); bu nedenle, ilk birkaç yüz görüntüyü analizden çıkarmak gerekebilir (örneğin, ThunderSTORM ana penceresindeki Filtre alanına "kare >500" yazın).
9. Ardışık birkaç karede görülebilen sinyallerin fazla sayılmasını önlemek için, ortalama yerelleştirme hassasiyetini (burada 20 nm ), 1 koyu çerçeveyi ve 0 maksimum kareyi (bir molekülün maksimum açık kalma süresinde kısıtlama yoktur) dikkate alan bir yarıçap kullanarak yerelleştirme verilerine birleştirme uygulayın.
10. Yalnızca ince bir ışık optik ultra ince kesitin analiz edilmesi gerekiyorsa, odak düzleminin üstündeki ve altındaki tüm lokalizasyonları veri kümesinden hariç tutun. İlk olarak, sonuç tablosunu içeren pencerede Histogramı Çiz'e basarak z'de en fazla yerelleştirmeyi içeren noktayı arayın ve ardından filtreleme komutunu kullanarak bu noktanın 50 nm üstündeki ve altındaki yerelleştirmeleri atın:
    z > "histogram tepesi" - 50 & z < "histogram tepesi" + 50
11. Kaydedilen bölümdeki DNA fraksiyonunu belirlemek için, adım 4.7.1'de kaydedilen görüntü yığınının her düzlemindeki (kalınlık 200 nm; her iki tarafta 100 nm) lokalizasyonları belirleyin. Eklentiler | Fırtına | İçe/İhracat | Sonuçları İçe Aktarın ve kaydedilen her dilimi 200 nm'ye filtreleyin. Bunun için filtre alanına yazdıktan sonra Uygula'ya tıklayın:
    z > -100 & z < 100
12. Görselleştirme'ye tıklayın ve her dilimin bir görüntüsünü oluşturmak için Histogramlar seçeneğini seçin. Ortaya çıkan görüntüyü TIFF formatında bir klasöre kaydedin. Tüm açık görüntüleri kapatın. Bunu tüm görüntü düzlemleri için tekrarlayın.
13. Tüm dilimleri açın ve Görüntü | Yığınlar | İstiflenecek Görüntüler. Resim Seç | Yığınlar | Z-Project'e gidin ve Toplam seçeneğini seçin. ImageJ'de ROI Yöneticisini açın (Analiz | Araçlar | ROI Yöneticisi); ardından ImageJ ana penceresindeki ImageJ araç çubuğundan Poligon Seçim Aracını seçin ve çekirdeğin ana hatlarını çizin. ROI Yöneticisinde Ekle'ye tıklayın.
    1. Analiz Et'e tıklayın | Ölçümler'i ayarlayın ve Entegre Yoğunluk'u seçin. Analiz Et'e tıklayın | Ölçün. ThunderSTORM'da, yukarıda açıklandığı gibi merkez düzlemin sonuç tablosunu açın ve filtre alanında aşağıdaki komutu kullanarak 100 nm Kalınlığa filtreleyin:
       z > -50 & z < 50
14. Yukarıda açıklandığı gibi filtrelenmiş yerelleştirmelerin bir histogramını oluşturun, tanımlanan ROI'yi ROI Yöneticisi'nde seçerek etkinleştirin ve Analiz Et | Ölçün.
15. Ölçülen entegre yoğunlukları bölerek toplam lokalizasyon sayısına göre 100 nm kalınlığındaki orta bölümdeki lokalizasyonların fraksiyonunu belirleyin - mutlak DNA yoğunluklarını hesaplamak için adım 8.2'de gereken dönüştürme faktörü.
    NOT: DNA içeriği, lokalizasyon sayısı ile orantılıdır. Bu nedenle, görüntülenen süper çözünürlüklü görüntüdeki (orta bölüm) DNA fraksiyonunu tahmin etmek için, tüm çekirdeğin hacmi boyunca toplam lokalizasyon sayısını belirlemek ve ilgilenilen bölümdeki toplam lokalizasyon sayısını belirlemek yeterlidir. Bu, lokalizasyonların 2B histogramları oluşturularak gerçekleştirilebilir.

7. SMLM mikroskobunun Z kalibrasyonu

1. Fiji'de bölüm 5'te kaydedilen görüntü yığınlarını açın.
2. ThunderSTORM eklentisi menüsünde 3D kalibrasyon alt menüsünü seçin | Silindirik lens kalibrasyonu.
3. Kalibrasyon verilerini kaydetmek için kullanılan adım boyutunu (10 nm) girin ve kalibrasyon için kullanılacak görüntü yığınının alanını tanımlayın.
4. Kalibrasyon dosyasının kaydedileceği konumu belirtin.
5. Moleküllerin alt piksel lokalizasyonu panelinde PSF: Eliptik Gauss (3D Astigmatizma) öğesini seçerek ve bölüm 5'te oluşturulan kalibrasyon dosyasının dosya yolunu ayarlayarak Analizi Çalıştır iletişim penceresinde kalibrasyon verilerini kullanın.

8. Voronoi Mozaikleme

NOT: Yerelleştirme tablosu oluşturulduktan ve düzenlendikten sonra, görüntü analizinin son adımı olan Voronoi mozaiklemeye geçin. Bu adım için MATLAB 2021'i kullanın; MATLAB komut dosyaları, "Nano Ölçekli Dağıtımlar için Yerelleştirme Analizörü" (LAND) yazılım paketinin bir parçasıdır ve Malzeme Tablosundaki bağlantılardan indirilebilir. Verilerin kaydedilmesine ve yerelleştirme tablosunun oluşturulmasına benzer şekilde, bellek ve işlem gücü ile iyi donatılmış bir sistem kullanmak önemlidir. Bu yayın için görüntüleri oluşturmak için kullanılan sistem, 128 GB RAM ve 9 çekirdekli Intel i9 CPU ile donatılmıştı.

1. Yerelleştirme tablosunu bir MATLAB matrisine dönüştüren ve ".mat" formatında kaydeden MATLAB betiği "TS2Orte.m"yi çalıştırarak ThunderSTORM yerelleştirme tablosunu .csv formatından Orte formatına dönüştürün.
2. Veriler doğru formatta olduğunda, Voronoi mozaikleme ve DNA yoğunluğu hesaplaması için hazırlıklara başlayın. Çekirdekteki baz çiftlerinin sayısını, hacme göre görüntülenen bölümdeki nispi lokalizasyon sayısına bölerek dönüştürme faktörünü hesaplayın (bkz. adım 6.15). LAND-Voronoi klasörüne gidin ve /coreAlgorithm alt klasöründe voronoiCluster.m dosyasını açın ve 13. satırdaki mutlak yoğunluk hesaplamaları için dönüştürme faktörünü ayarlayın.
   NOT: G₁ HeLa çekirdeğinin bir örneği için Şekil 5'e bakın; 265'lik bir dönüşüm faktörü ölçüldü.
3. Analizi başlatan komut dosyasını düzenleyin "VonoRoi.m". Orte yerelleştirme verilerinin dosya yolunu ve sonuç dosyaları için çıktı klasörünü ayarlayın. Koordinat listesinde, mozaiklemenin yapılması gereken alanı tanımlayan koordinatları belirtin. Voronoi mozaiklemesinin hesaplanması uzun zaman alabileceğinden (kullanılan makinenin özelliklerine bağlı olarak), aynı girdi veri kümesi içinde hesaplanacak birden fazla alan tanımlayın.
4. Komut dosyasını çalıştırdıktan sonra, alan dağılımının histogramını gösteren grafikler içeren diğer dosyalarla birlikte mutlak DNA yoğunluklarını gösteren görüntüyü ve çıktı klasöründeki hesaplanan her bir Voronoi hücresinin yoğunluklarını içeren bir "densities.mat" dosyasını arayın.

Şekil 5'te gösterilen HeLa çekirdeği, Şekil 5'te gösterilen histogramdaki ilk tepe noktasına yakın entegre bir floresan yoğunluğuna sahip olmak için bölüm 3'te CellProfiler4.2.1 tarafından oluşturulan tablodan, G 1 fazındaki çekirdekleri temsil eden seçilmiştir. Küçük boyutu ve belirgin iç yapısı göz önüne alındığında, mitozdan sonra kromatinini yoğunlaştırma sürecinde olan erken bir G1 çekirdeği olması muhtemeldir. G1'de olmak, hesaplamalar için 3N'lik bir DNA içeriğinin (~9 × 109 bp) varsayılabileceği anlamına gelir (bkz. Ek Şekil S1). 50.000 kareden oluşan fBALM ölçümü, 100 nm kalınlığında bir optik orta bölüm içinde 2,68 × 106 tespit edilen lokalizasyonla sonuçlandı (Şekil 5A). Yeniden oluşturulan görüntünün lokalizasyon doğruluğu 10 nm'dir. Bu bölümdeki lokalizasyonlar, 2.8 μm yüksekliğindeki çekirdekteki (~321 Mbp) tüm genomun ~0.036'sını temsil eder. Bu, Voronoi hücrelerinin mutlak yoğunluğunu hesaplayan MATLAB betiği için 265'lik bir dönüştürme faktörü ile sonuçlanır.

Işık-optik ultra ince kesit içindeki lokalizasyonların Voronoi mozaiklenmesinden kaynaklanan görüntü, DNA'nın mutlak yoğunluk dağılımını göstermektedir (Şekil 5B). Çok sayıda lokalizasyon, mutlak DNA yoğunluklarını gösterirken süper çözünürlüklü görüntülemenin kombinasyonuna izin verir. Ölçülen DNA yoğunluklarının çekirdek boyunca düzgün bir şekilde dağılmadığı ve geniş bir dinamik aralığı (5 ila >350 Mbp/μm3) kapsadığı açıktır. Önceki çalışmalardan bilindiği gibi, yüksek DNA yoğunlukları (>40 MB/μm3) nükleer çevrede, nükleollerin çevresinde ve özellikle bu erken G1 çekirdeğinde, son mitozdan kalan kompakt kromatin açısından hala zengin alanlarda bulunabilir. Buna karşılık, nükleollerde (rDNA hariç, çoğunlukla preribozomlar ve protein içeren) ve nükleoplazma nükleer gövdelerini ve beneklerini içeren interkromatin lakunalarında düşük DNA yoğunlukları bulunur.

Çekirdek içindeki alanların daha yüksek büyütmeleri (Şekil 5C('),D('),E(')) tek Voronoi hücrelerini gösterir. Burada, daha büyük Voronoi hücrelerinin düşük DNA yoğunluklarını, daha küçük hücrelerin ise yüksek DNA yoğunluklarını gösterdiği görülüyor. Çekirdekte meydana gelen yoğunluklar geniş bir aralığı kapsadığından, iki farklı arama tablosunda temsil edilirler. "Jet" arama tablosu, 0 ila 40 Mbp/μm arasındaki nispi düşük DNA yoğunluklarını kapsar 3-nükleoplazmanın26 serbestçe yayılabilir elemanları tarafından erişilebilir olduğu kabul edilen bir aralık. İkinci arama tablosu 40 Mbp/μm3'ün üzerindeki alanları gösterir. İlginç bir şekilde, 40 Mbp/μm3'ten 350 Mbp/μm3'e kadar çok daha büyük DNA yoğunlukları bu yöntemle ölçülebilir.

Bir G1 C3H10T1/2 çekirdeğinde ölçülen DNA yoğunluklarına bakıldığında (Şekil 6), farklı bir tip (embriyonal fibroblast) ve tür (fare) çekirdeği içindeki mutlak DNA yoğunluğu dağılımını gösterir. Nükleer çevre ve perinükleolar çevre ile ilgili temel organizasyon, erken G1 HeLa çekirdeğine benzese de, bu çekirdek ayrıca (fare hücreleri için tipik olduğu gibi) kurucu perisentrik heterokromatin kümelerine (kromomerkezler) sahiptir. Bunlar, merkezde 30 Mbp/μm3 ve çevrede 300 Mbp/μm3'e kadar değişen DNA yoğunluğunda kayda değer farklılıklar gösterir. Bu hücre hattındaki kromatin, merkezde kompakt bir bölgeye sahip olan ve nükleoplazma ile arayüze doğru giderek daha az yoğun hale gelen bir kromatin alanları ağı halinde organize edilmiş gibi görünmektedir. Ek Şekil S2'de görülebileceği gibi, bir G2 çekirdeğinde biraz artan nükleer boyuta rağmen dramatik bir mimari değişiklik gözlenemedi. Bu çekirdekteki küçük bir eğim, görüntünün alt kısmındaki nükleer çevreyi sıyıran odak düzleminden sorumludur; Nükleer çevre yoğun kromatin açısından daha zengindir.

Şekil 7 , bir HeLa çekirdeğinin başka bir görüntüsünü göstermektedir, ancak bir histon asetiltransferaz inhibitörü olan 100 nM TSA ile 24 saatlik tedaviden sonra. Histon proteinlerinin hiperasetillenmiş kuyrukları negatif yüklüdür ve bu nedenle negatif yüklü DNA'ya27 daha az bağlanır, bu da genomun ayrışmasına yol açar. Şekil 5'te gösterilen çekirdeğin aksine, nükleer topografya ve DNA yoğunluğu açısından dikkate değer bir fark görüyoruz. Daha yüksek DNA yoğunluğuna sahip adalar gösteren periferik heterokromatin dışında, kromatinin geri kalanı çok daha homojen görünür, çok daha yoğunlaşmıştır ve 20 ila 30 Mbp/μm3 arasında dalgalanır. Benzer şekilde, TSA tedavisi (Ek Şekil S3), kromatin Şekil 7'de gösterilen HeLa hücresindeki kadar sıkıştırılmamış olmasına rağmen, C3H10T1/2 çekirdeklerinde daha düşük genel sıkıştırma seviyelerine yol açar. Bunun nedeni ilaca daha kısa süre (~6 saat) maruz kalma olabilir. Yüksek DNA sıkıştırma seviyeleri ve DNA açısından zengin ve DNA açısından fakir alanlar arasında daha büyük bir kontrast, hücrelerin daha fazla çözünmüş partikül içeren ortamda inkübe edilerek hiperozmotik muamelesi ile elde edilebilir (290 mOsm'ye kıyasla 560 mOsm; bkz. Ek Şekil S4). Sıkıştırma 350 Mb/μm3'ü geçmemesine rağmen, kromatinin daha fazlası 40 Mb/μm3'ten daha yüksek sıkıştırıldı.

Şekil 1: Elektron mikroskobu ve biyokimyasal yakınlık ölçümleri ile üretilen haritalanmış kromatin dağılımları arasındaki karşılaştırma. (A) görüntüleme (ESI-TEM)28 ve (B) DNA dizisi yakınlıklarına dayalı 3D genom rekonstrüksiyonu. A , kümeler halinde meydana gelen bir fare hücre çekirdeği içindeki kromatini (sarı) ve protein açısından zengin boşluk (mavi) nükleik asit boşluğu ile serpiştirilmiş daha az yoğun lif benzeri yapıları gösterirken, B , DNA temas verilerine dayalı bir 3D kromatin rekonstrüksiyonunda önemli yoğunluk farklılıkları göstermez ( B'de gösterilen resmi oluşturmak için kod) open3Dgenome (https://github.com/tzeitim/genome-blender, ve açık kaynaklı yazılım "Blender" kullanıldı). Şekil 1A , Strickfaden ve ark.28'den modifiye edilmiştir. Ölçek çubuğu = 1 μm (A). Kısaltma: ESI-TEM = elektron spektroskopik görüntüleme-transmisyon elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Süper çözünürlüklü görüntüler oluşturmanın farklı yollarının karşılaştırılması. (A-C) Piksel tabanlı ve (D-F) Voronoi mozaikleme. (A) Lokalizasyonları içeren alanın kutulara bölünmesi; (B) kutu başına yerelleştirmenin sayılması; (C) sayıları bir renk haritasına eşleyerek resim matrisinin resme dönüştürülmesi. (D) Yerelleştirme koordinatlarının kaydı; Voronoi hücrelerinin kenarlarını hesaplamak için lokalizasyon koordinatlarını kullanma (Voronoi mozaikleme (E)); (F) Voronoi hücrelerini yoğunluklarına göre renklendirmek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mutlak DNA yoğunluğu ölçümü adımlarının iş akışı şeması. Kısaltma: SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Logaritmik olarak büyüyen bir C3H10T1/2 hücre kültürünün entegre floresan yoğunluğu ile hücre döngüsü evrelemesi. (A) SYTOX Logaritmik olarak büyüyen C3H10T1/2 hücre kültürünün turuncu lekeli çekirdekleri. (B) CellProfiler tarafından oluşturulan A'da gösterilen çekirdeklerin entegre floresan yoğunluklarının histogramı, karakteristik iki modlu dağılımı gösterir. İlk tepe noktası G1 fazındaki hücreleri gösterir; ikinci tepe noktası G2 fazındaki hücreleri temsil eder. (C) Çekirdekler, tek tek çekirdeklerin hücre döngüsü fazını tanımlamaya yardımcı olan entegre yoğunluklarına göre renk kodludur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: HeLa G1 çekirdeği. (A) Süper çözümlenmiş fBALM görüntüsü ("ateş" arama tablosu). (B) Mutlak DNA yoğunluklarını gösteren Voronoi mozaikli görüntü. (C) C ve C', B'de belirtilen alanın 2,5 x 3,5 μm büyütmesini gösterir. D ve D', C'de ana hatlarıyla belirtilen alanın 1 x 1 μm büyütmesini gösterir. E ve E', D'de belirtilen alanın 200 nm büyütmelerini gösterir. "Jet" arama tablosu (B-E'de kullanılan, 5 ila 40 Mbp/μm3 arasındaki DNA sıkıştırmalarını gösterir; kırmızı arama tabloları (C', D' ve E'de kullanılır) 40 Mbp/μm3'> DNA yoğunluklarını görselleştirmek için kullanılır. Ölçek çubuğu = 5 μm (A). Kısaltma: fBALM = DNA yapısı dalgalanması Bağlanmayla Aktive Edilen Lokalizasyon Mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: C3H10T1/2 G1 çekirdeği. (A) Süper çözümlü fBALM görüntüsü ("ateş" arama tablosu); (B ve E) Mutlak DNA yoğunluklarını gösteren Voronoi mozaikli görüntüler; (C, D) B'de belirtilen alanın büyütülmesi. "Jet" arama tablosu (B ve C'de kullanılır), sağdaki renk çubuğuyla gösterildiği gibi 5 ila 40 Mbp/μm3 arasındaki DNA sıkıştırmalarını gösterir. Kırmızı renk haritası (D ve E'de kullanılır) 40 Mbp/μm3> DNA yoğunluklarını gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm (A). Kısaltma: fBALM = DNA yapısı dalgalanması Bağlanmayla Aktive Edilen Lokalizasyon Mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: TSA ile tedavi edilen HeLa G1 çekirdeği. (A) Süper çözünürlüklü fBALM görüntüsü ("ateş" arama tablosu). (B) Mutlak DNA yoğunluklarını gösteren Voronoi mozaikli görüntü; (C) B'de belirtilen alanın büyütülmesi. "Jet" arama tablosu (B ve C'de kullanılır) 2 ile 40 Mbp/μm3 arasındaki DNA sıkıştırmalarını gösterir. Ölçek çubuğu = 5 μm (A). Kısaltmalar: fBALM = DNA yapı dalgalanması Bağlanma ile Aktive Olan Lokalizasyon Mikroskobu; TSA = Trikostatin A. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Tam olarak aynı konsantrasyonda DNA boyası ile boyanmış yapışık hücre kültürlerinin görüntü sitometrisi histogramları, bir diploid hücre hattına göre hücre hatlarının bilinmeyen genom boyutlarını belirlemek için kullanılabilir. (A) Logaritmik olarak büyüyen bir HFB hücre hattının entegre floresan yoğunluk histogramı. (B) Logaritmik olarak büyüyen bir HeLa hücre hattının entegre floresan yoğunluk histogramı. G1 pikinin entegre yoğunluğunun HFB hattının (2n) G1 pik ile karşılaştırılması, hipotriploid (3n) olan HeLa hücre hattının sitogenetik tanımına çok iyi uyan faktör 1.5'te orantılı bir artış sağlar. (C) Logaritmik olarak büyüyen bir C3H10T1/2 hücre hattının entegre floresan yoğunluğu histogramı. 3 × 109 bp insan genomu ile karşılaştırıldığında, fare genomu biraz daha küçüktür (2.6 × 109). Faktör 1.7'nin CH310T1/2 ve HFB G1 zirveleri arasındaki yoğunluk farkı, bu hücre hattındaki üç Barr cisminin gözlemine uyan bir tetraploid karyotipe iyi karşılık gelir. Kısaltmalar: HFB = insan fibroblastı; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Hafifçe eğik bir G2 C3H10T1/2 çekirdeğinden geçen 100 nm'lik bir kesit. (A) Süper çözünürlüklü fBALM görüntüsü; (B ve E) Mutlak DNA yoğunluklarını gösteren Voronoi mozaikli görüntüler; (C,D) B'de belirtilen alanın büyütülmesi. "Jet" arama tablosu (B ve C'de kullanılır) 5 ila 40 Mbp/μm3 arasındaki DNA sıkıştırmalarını gösterir. Kırmızı renkli harita, 40 Mbp/μm3> DNA yoğunluklarını gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm (A). Kısaltma: fBALM = DNA yapısı dalgalanması Bağlanmayla Aktive Edilen Lokalizasyon Mikroskobu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: TSA ile tedavi edilen CH310T1/2 G1 çekirdeği. (A) Süper çözünürlüklü fBALM görüntüsü; (B,E) Mutlak DNA yoğunluklarını gösteren Voronoi mozaikli görüntüler; (C,D) B'de belirtilen alanın büyütülmesi. "Jet" arama tablosu (B,C'de kullanılır) 5 ile 40 Mbp/μm3 arasındaki DNA sıkışmalarını gösterir. Kırmızı renk haritası (D,E'de kullanılır) 40 Mbp/μm3> DNA yoğunluklarını gösterir. Ölçek çubukları = 10 μm (A). Kısaltmalar: fBALM = DNA yapı dalgalanması Bağlanma ile Aktive Olan Lokalizasyon Mikroskobu; TSA = trikostatin A. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S4: Hiperosmolar ortam ile tedaviden sonra hiperkondensasyona uğramış kromatin gösteren CH310T1/2 G1 çekirdeği. (A) Süper çözünürlüklü fBALM görüntüsü; (B,E) Mutlak DNA yoğunluklarını gösteren Voronoi mozaikli görüntüler; (C,D) B'de belirtilen alanın büyütülmesi. "Jet" arama tablosu, 5 ila 40 Mbp/μm3 arasındaki DNA sıkışmalarını gösterir. Kırmızı renk haritası (D ve E'de kullanılır) 40 Mbp/μm3> DNA yoğunluklarını gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm (A). Kısaltma: fBALM = DNA yapısı dalgalanması Bağlanmayla Aktive Edilen Lokalizasyon Mikroskobu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Aydınlatma Düzeltme.cpproj işlem hattı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Cell CycleAnalysis.cpproj işlem hattı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.