Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak Hücre Çekirdeğinde Mutlak DNA Yoğunluğunun Haritalanması

Summary

Mevcut protokol, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu verilerinin, bilinen hacmin, genom boyutunun ve hücre döngüsü aşamasının Voronoi mozaiklemesini kullanarak yapışık hücre çekirdekleri içindeki mutlak DNA yoğunluklarını ölçen bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

Hücre çekirdeği içinde, sessiz genler genellikle heterokromatin adı verilen yüksek yoğunluklu kromatin alanlarında bulunurken, aktif genler çoğunlukla kromatin ile ökromatin adı verilen kromatinler arası boşluk arasındaki arayüzde bulunabilir. Şu anda, eu- ve heterokromatinin karakterizasyonu çoğunlukla DNA dizisi boyunca histon proteinlerinin epigenetik modifikasyonlarına dayanırken, hücre çekirdeği boyunca mutlak DNA yoğunlukları ve bunların fonksiyonel etkileri hakkında çok az şey bilinmektedir. Yalnızca biyokimyasal verilere ve kromatinin bir polimer olarak doğası hakkındaki varsayımlara dayanan çekirdek modelleri, yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile üretilen görüntüleme verilerinden hala temel olarak farklıdır. Bu, yapısal olarak ilgili önemli bilgilerin hala eksik olduğunu gösterir. Uzamsal kısıtlamaların gen düzenlemesinde rol oynayabileceğine inanıyoruz ve bu nedenle, süper çözünürlüklü lokalizasyon verilerini Voronoi mozaikleme ile gerçek ölçekli yoğunluk haritalarına dönüştürerek memeli hücre çekirdeklerindeki mutlak DNA yoğunluklarının ölçülmesine izin veren bir yöntem geliştirdik.

Introduction

Hücre biyolojisinin ilk günlerinden beri, genetik bilginin merkezi olan hücre çekirdeği biyologları büyülemiştir. Emil Heitz, kendi geliştirdiği sitolojik boyama yöntemlerini uyguladıktan sonra, 1928'de hücre çekirdeği¹ içinde farklı, yoğun boyalı alanlar keşfetti. Daha yoğun lekeli, yoğun alanlara "heterokromatin" adını verirken, daha az güçlü lekeli, daha az yoğun alanlara "ökromatin" adını verdi. Zamanla, aktif genlerin çoğunlukla ökromatinde yer aldığı, daha yoğun alanların ise tekrarlayan elementler ve sessiz genler açısından zengin olduğu ortaya çıktı. Heterokromatin ve ökromatin terimleri, tanımları yapı....

Protocol

NOT: Şekil 3 , bu bölümde açıklanan iş akışına genel bir bakış sağlar. Bu protokolde kullanılan reaktifler, malzemeler, ekipman ve yazılımla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Bu yayın için kullanılan kod buradan görüntülenebilir ve indirilebilir: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Hücre kültürü

1. %5 CO 2 ile desteklenmiş nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM'de C3H10T1/2, HFB ve HeLa hücrelerini yetiştirin_.....

Results

Şekil 5'te gösterilen HeLa çekirdeği, Şekil 5'te gösterilen histogramdaki ilk tepe noktasına yakın entegre bir floresan yoğunluğuna sahip olmak için bölüm 3'te CellProfiler4.2.1 tarafından oluşturulan tablodan, G ₁ fazındaki çekirdekleri temsil eden seçilmiştir. Küçük boyutu ve belirgin iç yapısı göz önüne alındığında, mitozdan sonra kromatinini yoğunlaştırma sürecinde olan erken bir G₁ çekirdeği olması muh.......

Discussion

Bu makale, SMLM kullanılarak memeli hücre çekirdeklerindeki mutlak DNA yoğunluklarının nasıl ölçüleceğini özetlemektedir. Ek olarak, kültürlenmiş hücrelerin hücre döngüsü aşamasının nasıl belirleneceğini ve bu bilginin hafif optik ultra ince bir kesitte bulunan DNA miktarını tahmin etmek için nasıl kullanılacağını gösterdik. Ayrıca, fBALM SMLM mikroskobu için yapışık hücrelerin hazırlanması ve hücre çekirdeklerinde genomik DNA'nın süper çözünürlüklü mikroskobik görüntülerini oluşturmak i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hücre Kültürü
µ-Çanak 35 mm, yüksek ızgara-500 Cam taban	İbidi	81168
C3H 10T1/2	IMB (Niehrs Laboratuvarı)
DMEM	ThermoFisher	12320032
dPBS	ThermoFisher	14190144
FBS	Yaşam Teknolojileri	16000-044
Hela	Mikroskopi Çekirdek Tesisi (IMB)
HFB	IMB (Kubben Laboratuvarı)
L-Glutamin	Sigma-Aldrich	G7513
HFB için Temel Olmayan Aminoasitler ve Vitaminler
Sodyum Piruvat	S8636
Örnek Hazırlık
Katalaz	Merck	2593710
Glikoz	ThermoFisher	241922500
Glikoz Oksidaz	Merck	49180
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	158127
RNase Kokteyli	ThermoFisher	AM2286
SYTOX Orange	ThermoFisher	S11368
TetraSpeck Floresan Mikrosferler Örnekleyici Kiti	ThermoFisher	T7284
Triton X-100	ThermoFisher	327372500
Software
BioFormatlar	OpenMicroscopy.org		Açık kaynak yazılım https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1	CellProfiler.org		Açık kaynak yazılım https://cellprofiler.org
Fiji	nih.gov		Açık kaynak yazılım https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
KARA	nih.gov		Açık kaynak yazılım https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021	Matematik Eserleri		ticari yazılım - "Görüntü İşleme Araç Kutusu" gerektirir
R v.4.. 0.3	r-project.org		Açık kaynak yazılım https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3			Açık kaynak yazılım https://zitmen.github.io/thunderstorm/
mikroskoplar:
AF 7000	Leica
Leica GSD	Leica
SMLM Mikroskobu	Cremer Laboratuvarı		Dr. S-Y tarafından özel olarak üretildi. Çetin