Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Aşıların temel bir bileşeni olarak, adjuvanlar antijenlerle ilişkili güçlü, yaygın, doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları doğrudan indükleyebilir veya artırabilir. Ophiopogon japonicus bitkisinden ekstrakte edilen saflaştırılmış bir bileşen olan Ophiopogonin D (OP-D), bir aşı adjuvanı olarak yararlı bulunmuştur. OP-D'nin düşük çözünürlüğü ve toksisitesi sorunları, nanoemülsiyon ofiyopogonin D (NOD) hazırlamak için düşük enerjili bir emülsifikasyon yöntemi kullanılarak etkili bir şekilde üstesinden gelinebilir. Bu makalede, hücresel aktivitenin değerlendirilmesi için bir dizi in vitro protokol incelenmiştir. L929'un sitotoksik etkileri, hücre sayma kit-8 testi kullanılarak belirlendi. Daha sonra, immünize farelerden splenositlerin stimülasyonu ve kültürü sonrasında salgılanan sitokin düzeyleri ve buna karşılık gelen immün hücre sayıları ELISA ve ELISpot yöntemleri ile tespit edildi. Ek olarak, C57BL / 6 farelerden izole edilen ve GM-CSF artı IL-4 ile inkübasyondan sonra olgunlaşan kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerde (BMDC'ler) antijen alım yeteneği, lazer taramalı konfokal mikroskopi (CLSM) ile gözlenmiştir. Önemli olarak, makrofaj aktivasyonu, IL-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) sitokinlerinin seviyelerinin, boş farelerden peritoneal makrofajların (PM'ler) adjuvanla 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesinden sonra ELISA kitleri ile ölçülmesiyle doğrulandı. Bu protokolün, diğer araştırmacılara yeni aşı adjuvanlarının hücresel yanıt etkinliklerini değerlendirmek için doğrudan ve etkili deneysel yaklaşımlar sağlayacağı umulmaktadır.
Giriş
Aşılar, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde önemli bir araçtır. Aşı formülasyonlarına adjuvanların ve dağıtım araçlarının uygun şekilde eklenmesi, antijenlerin immünojenitesini arttırmak ve uzun süreli immün yanıtlar oluşturmak için faydalıdır1. Klasik adjuvan şaplara (alüminyum tuzu) ek olarak, şu anda pazarlanan aşılar için altı çeşit adjuvan vardır: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 ve Matrix-M5. Genel olarak, insan vücudu vir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hücre deneyleri, temel ameliyathaneler, tampon odalar, steril kültür odaları, tanımlama ve analiz odaları ile donatılmış bir hücre mühendisliği laboratuvarında gerçekleştirildi. Çalışma ortamı ve koşulları mikrobiyal kontaminasyon ve diğer zararlı faktörlerden arındırılmıştır. Hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuz'a dayanarak yürütülmüş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Otoklavlama ve malzeme hazırlama
- Fosfat tamponlu salin (PBS), makas, forseps ve aşındırıcı ağ gibi reaktifleri ve sarf malzemelerin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
OP-D ve NOD adjuvanlarının hücresel aktivite değerlendirmesi protokole göre in vitro olarak tamamlandı. L929 fibroblastları, NOD'nin in vitro toksisite testi için yararlı bir tarama modelidir (Şekil 1). Dalaktaki inflamatuar sitokin seviyelerinin miktarı, araştırmacıların bağışıklık tepkisini daha iyi anlamalarına yardımcı olabilir (Şekil 2). CTL'lerin ELISpot ile izlenmesi, klinik çalışmalarda antijene özgü T hücresi bağışıklığının değerlendir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Alt ünite aşılar mükemmel güvenlik sağlar, ancak immünojenisitesi zayıftır. İmmünojeniteyi arttırmanın ana stratejisi, antijenleri adjuvanlarla fiziksel olarak adsorbe etmek veya eşleştirmek ve DC'ler tarafından alımını ve sunumunu teşvik etmek için bunları ilaç dağıtım sistemlerine dahil etmektir. quillaia saponin ve türevleri gibi doğal bitki saponinleri oldukça toksiktir ve insan aşılarının geliştirilmesi için uygun değildir17. Bu nedenle, aşıların veya adjuvanların hücreler üzerindeki toksik e.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek rakip finansal veya kişisel çıkarların olmadığını beyan etmektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı'nın 2021YFC2302603 numaralı hibesi, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Programı'nın 31670938, 32070924, 82041045 ve 32000651 No'lu hibeleri, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı'nın 2014jcyjA0107 ve 2019jcyjA-msxmx0159 no'lu hibeleri, Chongqing'in Lisansüstü Araştırma ve İnovasyon Projesi'nin CYS21519 no'lu hibesi, Ordu Tıp Üniversitesi Özel projelerinin 2020XBK24 numaralı hibesi ve üniversite öğrencileri için Ulusal İnovasyon ve Girişimcilik Programı'nın 202090031021 numaralı hibe.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 Tripsin-EDTA (1x) | GIBCO, ABD | 25200056 | |
| 96 oyuklu filtre plakaları | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | Genel Kimya Şirketi, ABD | boş | |
| Otomatik Hücre Sayacı | Countstar, Çin | IC1000 | |
| BALB/c fareler ve C57BL/6 fareler | Pekin HFK Bioscience Co. Ltd | boş | |
| kaprilik/kaprik trigliserit (GTCC) | Pekin Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Pekin, Çin | boş | |
| CCK-8 kitleri | Dojindo, Japonya | CK04 | |
| Hücre Sayma Plakası | Costar, Corning, ABD | CO010101 | |
| Hücre Elek | biosharp, Çin | BS-70-CS | |
| Santrifüj 5810 R | Eppendorf, Almanya | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | D9542 | |
| DMEM temel (1x) orta | GIBCO, ABD | C11885500BT | |
| DSZ5000X Ters Mikroskop | Nikon, Japonya | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, Hindistan | boş | |
| ELISpot klasik | AID, Almanya | ELR06 | |
| Fetal Sığır Serumu | GIBCO, ABD | 10099141C | |
| Tam Fonksiyonlu Mikroplaka Okuyucu | Thermo Fisher Scientific, ABD | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, ABD | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, ABD | 35050061 | |
| Granülosit Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör | GM-CSF, R& D Systems, ABD | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, ABD | 15630106 | |
| HF 90/240 İnkübatör | İyileştirme Gücü, İsviçre | null | |
| IL-4 | PeproTech, ABD | 042149 | |
| L929 hücre hattı | FENGHUISHENGWU, Çin | NCTC klonu 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopi | Zeiss, Almanya | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, Fransa | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, Fransa | 36372K | |
| Fare IFN-&gama; ELISA kiti | Dakewe, Çin | 1210002 | |
| Fare IFN-&gama; ön kaplamalı ELISPOT kiti | Dakewe, Çin | DKW22-2000-096 | |
| Fare IL-17A ELISA kiti | Dakewe, Çin | 1211702 | |
| Fare IL-17A ELISpotPLUS Kiti | ebiosciences, ABD | 3521-4HPW-2 | |
| Fare IL-1 ve beta; ELISA kiti | Dakewe, Çin | 1210122 | |
| Fare IL-6 ELISA kiti | Dakewe, Çin | 1210602 | |
| Fare TNF-&alfa; ELISA kiti | Dakewe, Çin | 1217202 | |
| Esansiyel olmayan amino asitler (100x) | Invitrogen, ABD | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co., Ltd | 945619-74-9 | |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi | Invitrogen, ABD | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, Çin | CA1620 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu | Tuzlu ZSGB-BIO, Çin | ZLI-9062 | |
| Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu | Solarbio, Çin | R1010 | |
| RPMI 1640 orta | Hidroklon (Yaşam Teknolojisi), ABD | SH30809.01 | |
| Sodyum piruvat (100 mM) | Invitrogen, ABD | 11360070 | |
| Skualen | Sigma, ABD | S3626 | |
| ve beta; - Merkaptoetanol | Invitrogen, Amerika Birleşik Devletleri | 21985023 |
Kaynaklar
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeuti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
