İmmünofloresan boyama sırasında tiramid sinyal amplifikasyonu, HSV-1 enfeksiyonundan sonra ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında fosforile RIPK3 ve MLKL'nin hassas tespitini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Kinaz Reseptörü ile etkileşime giren serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve substrat karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), önemli antiviral fonksiyonlara sahip hücre ölümünün enflamatuar bir formu olan nekroptozun kritik düzenleyicileridir. RIPK3'ün otofosforilasyonu, fosforilasyonu ve nekroptoz MLKL'nin gözenek oluşturan cellat proteininin aktivasyonunu indükler. Fosforile MLKL'nin hücre zarında ticareti ve oligomerizasyonu, nekrototik hücre ölümünün karakteristiği olan hücre lizisi ile sonuçlanır. Nükleik asit sensörü ZBP1, RNA ve DNA virüsleri ile enfeksiyondan sonra solak Z formundaki çift sarmallı RNA'YA (Z-RNA) BAĞLANARAK AKTIVE EDILIR. ZBP1 aktivasyonu, enfekte konakçı hücrelerin nekroptozu da dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükleyerek virüs enfeksiyonunu kısıtlar. İmmünofloresan mikroskopi, ZBP1 aracılı nekroptozun aşağı yönünde farklı sinyal basamaklarının hücre bazında görselleştirilmesine izin verir. Bununla birlikte, standart floresan mikroskobunun, insan RIPK3 ve MLKL'ye karşı mevcut ticari olarak temin edilebilen fosfo-spesifik antikorları kullanan duyarlılığı, bu belirteçlerin tekrarlanabilir görüntülenmesini engellemektedir. Burada, herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ile enfekte olmuş insan HT-29 hücrelerinde serin (S) fosforile edilmiş RIPK3 (S227) ve MLKL (S358) için optimize edilmiş bir boyama prosedürünü açıklıyoruz. İmmünofloresan boyama protokolüne bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımının dahil edilmesi, S227 fosforile RIPK3'ün spesifik olarak tespit edilmesini sağlar. Dahası, TSA, S358 fosforile MLKL'nin tespitinin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır. Birlikte, bu yöntem ZBP1 kaynaklı nekroptozun indüksiyonu sırasında bu iki kritik sinyal olayının görselleştirilmesini sağlar.
Giriş
Reseptör etkileşen serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), nekrototik hücre ölümünün merkezi düzenleyicileridir 1,2. Nekrotoz, antiviral bağışıklık ve otoinflamasyonda rol oynayan düzenlenmiş hücre ölümünün litik ve enflamatuar bir şeklidir. Virüs bulaşmış hücrelerin nekroptozu derhal virüs replikasyonunu durdurur. Nekrotoz indüksiyonunu takiben hücre lizisi, antiviral bağışıklığı uyaran hasarla ilişkili moleküler paternleri de serbest bırakır 3,4. Nekrotoz, üç yukarı akış aktive edici molekülden biriyle RI....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Biyotinillenmiş tiramid hazırlanması
- Biotin-tiramidden başlayarak biyotinile tiramid hazırlayın. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için, 1 mL DMSO içinde 3.6 mg biyotin-tiramid çözün. Kaliteyi korumak için çözünmüş ürünü -20 ° C'de alikotlarda saklayın.
2. HT-29 hücrelerinin kültürde tutulması
NOT: ZBP1-eksprese HT-29, insan ZBP1'i kodlayan bir lentivektör27 ile transdüksiyonla üretilmiştir.
- ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini McCoy'un 5A ortamında L-glutamin, sodyum-piruvat ve% 10 fetal sığır serumu (bundan böyle tam ortam ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İnsan hücrelerinde MLKL fosforilasyonunun ve özellikle RIPK3 fosforilasyonunun immünofloresan tespiti teknik olarak zordur26. Burada ZBP1'in aktivasyonu üzerine insan p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) için geliştirilmiş bir boyama protokolü sunuyoruz. Protokol, floresan sinyallerinin algılama sınırını ve hassasiyetini artırmak için bir TSA adımı içerir. Yöntemi doğrulamak için, TSA aracılı immünofloresansın hem p-RIPK3 (S227) hem de p-MLKL'nin (S358) standart dolaylı floresan boyaması ile yan yana k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu immünofloresan boyama protokolü, RIPK3 ve MLKL26'nın fosforilasyonu da dahil olmak üzere tespit edilmesi zor olan insan nekroptotik sinyal yolunun sinyal olaylarına duyarlılığı artırmak için tiramid sinyal amplifikasyonunun (TSA) kullanımını açıklar. Bir TSA adımının dahil edilmesi, p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) algılama eşiğini önemli ölçüde iyileştirir ve p-MLKL (S358) gerilmesinin hassasiyetini artırır. TSA, alaycı muamele görmüş numunelerde zaten mevcut olan bir p-RIPK3 (S227) sinyali ort.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
VIB Bioimaging Core'a eğitim, destek ve cihaz parkına erişim için teşekkür ederiz. J.N., Araştırma Vakfı Flanders'tan (FWO) doktora bursu ile desteklenmektedir. J.M. grubundaki araştırmalar, bir Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), Araştırma Vakfı Flanders'tan (FWO) bir junior research grant (G031022N), bir CRIG genç araştırmacı kavram kanıtı hibesi ve Ghent Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. P.V. grubundaki araştırmalar EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO kıdemli araştırma hibeleri (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Kansere Karşı Vakıf (F/2016/865, F/2020/1....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Antikorlar< / güçlü > | |||
| tavşan önleyici HRP | Agilent Technologies Belçika | K4002 | Envision+ Sistemi-HRP Etiketli Polimer anti-tavşan |
| Keçi anti-fare DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Sekundary antikor |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Fare anti-ICP0 (HSV-1) antikoru |
| IAV-PR8 fare serumu | Ev üretiminde | xx | Fare anti-IAV-PR8 poliklonal antikoru |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Tavşan anti-MLKL-fosfo S358 antikoru |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Tavşan anti-RIPK3-fosfo S227 antikoru |
| Floroforlar | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | Hücrelerin çekirdeğini görselleştirmek için |
| Alexa Fluor 568 ile birleştirilmiş Streptavidin | Thermofisher | S11226 | Biyotin moleküllerini görselleştirmek için |
| bileşikler | |||
| 30% H2<>O2 | Sigma | H1009 | HRP aktivitesi için gerekli oksitleyici substrat |
| %4 PFA | SANBIO | AR1068 | Hücreleri sabitlemek/çapraz bağlamak için |
| Biotinyl-tyramide | R& D Systems | 6241 | Sinyali yükseltmek için, HRP substrat |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP İnhibitörü |
| ve nbsp; | Hücre kültürü için: hücreleri ayırmak için | ||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L EDTA'nın disodyum tuzu | |||
| EDTA %0.04 | Ev içi formülasyon | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0,2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0,2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glikoz | |||
| Fetal Sığır serumu | TICO | FBS EU XXX | Hücre kültürü için, hücre kültürünün sürdürülmesi; Lot numarası: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinaz inhibitörü |
| L-Glutamin | Sigma-Aldrich | G7513 | Hücre kültürü için, hücre kültürünün bakımı |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Engelleme çözümü |
| PBS | Gibco | ||
| Sodyum piruvat | Sigma-Aldrich | S8636 | Hücre kültürü için, hücre kültürünün TNF |
| -&alfa bakımı; | Ev | üretiminde-Sinyal | molekülü, BV6 ve zVAD ile kombinasyon halinde hücre ölümünü tetikleyebilen |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | Hücrelere nüfuz etmek için |
| Tripan mavisi | Merck | 11732 | Hücre sayımı için, %0,1'de canlı/ölü belirteç olarak kullanılır |
| Tripsin | Sigma-Aldrich | T4424 | Hücre kültürü için: hücreleri ayırmak için |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-florometilketon |
| Malzeme | |||
| &mikro;-Slayt 8 kuyu yüksek cam alt | iBidi | 80807 | Hücreleri kültürlemek için |
| Pamuk Preping Topları boyutunda orta | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 71001-10 | Hedefleri temizlemek için |
| Immersol 518 F / 30 ° C | ZEISS | 444970-9000-000 | Numuneyi yüksek büyütme oranlarında görselleştirmek için |
| Lens Temizleyici | ZEISS | 000000-0105-200 | Objektifleri temizlemek için |
| LSM880 Fast Airyscan konfokal mikroskop | Örneği görselleştirmek için | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | Verileri işlemek için |
| Prizma 9 | Graphpad | xx | Verileri analiz etmek için - istatistiksel test ve grafik oluşturma |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | Nicelemeleri gerçekleştirmek için |
| Zen black | ZEISS | xx | Görüntüleri elde etmek ve işlemek için |
| Zen mavisi | ZEISS | xx | Görüntüleri görselleştirmek için |
| Virüsler | |||
| Dr. Jiahuai Han tarafından | ev replikasyonunda | HSV-1 (mutRHIM) F suşu | nekrotoz için bir tetikleyici olarak HSV-1; UL39 / ICP6'nın RHIM çekirdek alanı mutasyona uğramıştır (VQCG > AAAA) |
| HSV-1 (WT) F suşu | Dr. Jiahuai Han tarafından | ev replikasyonunda | üretilmiştir Nekrotoz indüksiyonu için negatif bir kontrol olarak HSV-1 (WT) (ICP6 inhibisyonu) |
| IAV Evde PR8 | stoğunda | replikasyon | Nekrotoz için bir tetikleyici olarak IAV |
Kaynaklar
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic c....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
