Yöntem makalesi

Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

DOI:

10.3791/64344

⸱

17 Ağustos 2022

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, miyokard B-lenfositlerinin intravasküler veya endotel boşluğundaki konumlarına göre akım sitometrisi kullanılarak nicelleştirilmesi ve farklılaştırılması için bir protokol sunulmuştur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Giderek artan sayıda kanıt, B-lenfositlerin miyokard fizyolojisi ve yaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bununla birlikte, literatür miyokard B hücrelerinin prevalansı hakkında zıt veriler bildirmektedir. B hücrelerinin hem kemirgen kalbindeki en yaygın bağışıklık hücreleri arasında olduğu hem de mevcut olduğu, ancak miyeloid hücrelerden belirgin şekilde daha düşük bir prevalansta olduğu veya oldukça nadir olduğu bildirilmiştir. Benzer şekilde, birkaç grup akut iskemik miyokard hasarından sonra miyokard B hücrelerinin sayısının arttığını tanımlamıştır, ancak bir grup yaralı miyokardın B hücrelerinin sayısında herhangi bir değişiklik bildirmemiştir. Miyokard B hücrelerinin prevalansını değerlendirmek için paylaşılan, tekrarlanabilir bir yöntemin uygulanması, farklı araştırma gruplarından gelen gözlemleri uyumlu hale getirmek ve böylece B hücresi miyokard etkileşimleri çalışmasının ilerlemesini teşvik etmek için kritik öneme sahiptir. Deneyimlerimize dayanarak, literatürde bildirilen görünüşte zıt gözlemler muhtemelen murin miyokard B hücrelerinin çoğunlukla intravasküler olması ve mikrovasküler endotele bağlı olması gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, bir murin kalbinden kurtarılan B hücrelerinin sayısı, organı temizlemek için kullanılan perfüzyon koşullarına ve kullanılan sindirim yöntemine karşı son derece hassastır. Burada, bu iki kritik değişkeni belirli bir şekilde açıklayan optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, murin miyokard B hücrelerinin sayısının tekrarlanabilir, akış sitometrisine dayalı analizini güçlendirir ve araştırmacıların ekstravasküler ve intravasküler miyokard B hücrelerini ayırt etmelerini sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B-lenfositler, hem adaptif hem de doğuştan gelen immün yanıtlarda önemli bir rol oynayan oldukça uzmanlaşmış bağışıklık hücreleridir1. İki ana B hücresi popülasyonu vardır: çoğunlukla embriyonik yaşam sırasında üretilen daha küçük bir B1 hücresi popülasyonu ve yetişkin yaşamında kemik iliğinde üretilen baskın bir B2 hücresi popülasyonu1. Kemik iliğinde olgunlaştıktan sonra, B hücreleri birincil ve ikincil lenfoid organlara göç eder. Oradan, kan damarlarından ve lenfatik damarlardan geçen lenfoid organlar arasında sürekli olarak dolaşırlar2. B hücreleri, yüzeylerinde reseptör olarak işlev gören spesifik antikorları eksprese eder. B hücreleri reseptörlerine bağlanan bir antijenle karşılaştıklarında, aktive edici bir sinyal tetiklenebilir. Aktif B hücreleri ya antijenin bulunduğu dokuya göç eder ya da antikor üreten plazma hücrelerine olgunlaşabilecekleri kemik iliğine geri dönerler 3,4.

Son zamanlarda, kalbin büyük bir B hücresi popülasyonunu barındırdığı takdir edilmektedir. Kemirgenlerde yapılan çalışmalar, B hücrelerinin embriyonik gelişim5 sırasında kalbi erken kolonize ettiğini ve miyokardiyal ilişkili B hücrelerinin çoğunlukla endotel 6,7'ye yapışmış intravasküler, naif B2 hücreleri olduğunu ve küçük bir B1 hücresi yüzdesi 7 olduğunu göstermiştir. Hala birçok belirsizlik alanı vardır, ancak mevcut veriler B hücrelerinin hem naif kalpte hem de yaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

Naif murin kalbindeki çalışmalar, başlangıçta miyokard B hücrelerinin çoğunlukla endotele yapışmış intravasküler boşlukta bulunduğunu göstermiştir (murin kardiyak B hücrelerinin %>95'inin intravasküler boşlukta yer aldığı bulunmuştur). Bu B hücrelerinin, periferik kandan izole edilen dolaşımdaki B hücrelerinden farklı gen ekspresyon paternlerine sahip olduğu bulunmuştur. B hücresi eksikliği olan hayvanlardan gelen naif kalplerin analizi ve sinjenik kontroller, B hücresi olmayan hayvanların daha küçük kalplere ve daha yüksek ejeksiyon fraksiyonuna sahip olduğunu bulmuştur6. Tüm bu kanıtlar, B hücrelerinin miyokard büyümesini ve / veya miyokard fonksiyonunu modüle edebileceğini ve sadece interstisyel değil, aynı zamanda intravasküler B hücrelerinin de bu tür gözlemlerden sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. B hücrelerinin ayrıca miyokard yerleşik makrofajlarının fenotipini modüle ettiği bulunmuştur8.

Birçok çalışma, B hücrelerininyaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermiştir 8,9,10,11,12,13. B hücreleri, muhtemelen CXCL13-CXCR5'e bağımlıbir mekanizma 11,13 yoluyla yaralı kalpte geçici olarak birikir. Oradan, B hücreleri, sitokin aracılı monosit alımını içeren çeşitli mekanizmalar yoluyla olumsuz kardiyak yeniden yapılanmayı teşvik eder 9,12. Ek olarak, B hücreleri, çeşitli mekanizmalarla kardiyak hasarın genişlemesini ve olumsuz kardiyak yeniden şekillenmeyi teşvik edebilen kardiyak proteinlere karşı antikorlar üretebilir 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B hücreleri ayrıca IL-10 10'un salgılanması yoluyla yaralı kalp üzerinde koruyucu etkilergösterebilir.

B hücrelerinin naif ve yaralı kalpteki rolünü araştıran grupların sayısı arttıkça, miyokard B hücrelerini uygun şekilde ölçmek ve değerlendirmek ve böylece literatürde ortaya çıkmaya başlamış tutarsızlıklardan kaçınmak için paylaşılan protokolleri tanımlamak giderek daha önemli hale gelmektedir. Şimdiye kadar B hücrelerinin her ikisinin de kemirgen kalbindeki en yaygın bağışıklık hücrelerinden biri olduğu7 ve miyeloid hücrelerden 26,27 veya oldukça nadir28'den belirgin şekilde daha düşük bir prevalansta bulundukları bildirilmiştir. Benzer şekilde, birkaç grup akut iskemik miyokard hasarı 7,9,13'ten sonra miyokard B hücrelerinin sayısının arttığını tanımlamıştır, ancak bir grup yaralı miyokard29'un B hücrelerinin sayısında herhangi bir değişiklik olmadığını bildirmiştir. Kardiyak immün hücreler üzerinde yapılan çalışmalar nadiren perfüzyon koşulları hakkında ayrıntılı bilgi verir ve sindirim koşulları hakkında fikir birliği yoktur. Kemirgen kalbinde, B hücrelerinin büyük bir kısmı intravasküler olduğundan ve bağışıklık hücrelerinin miyokarddan ekstraksiyonu kullanılan sindirim yöntemine büyük ölçüde bağlı olduğundan, literatürde bildirilen farklılıklar organ perfüzyonu ve doku sindirimindeki farklılıkların bir sonucu olabilir.

Burada, perfüzyon ve sindirim koşullarını optimize ederek B hücresi geri kazanımının verimini en üst düzeye çıkaran ve intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücrelerinin ayrımına izin veren murin miyokard B hücrelerinin akış sitometrisine dayalı nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır6. Bu protokol, intravasküler ve interstisyel immün hücreleri birbirinden ayıran diğer benzer protokollerin uyarlanması ve optimizasyonudur 28,30,31.

Bu protokolde, mikrovasküler endotele yapışmış biyolojik olarak ilgili B hücrelerini çıkarmadan intravasküler boşlukta yüzen B hücrelerini ortadan kaldırmak için miyokard perfüzyonunu standartlaştırıyoruz. Ayrıca, intravasküler ile interstisyel immün hücreleri32'yi ayırt etmek için intravenöz antikor enjeksiyonunun kullanımını tanımlayan önceki protokollere dayanarak ve B hücrelerinin yüzey belirteci B22033'ü eksprese etmesinden yararlanarak, hayvan kurban edilmeden ve kardiyak perfüzyondan hemen önce B220'ye özgü bir antikorun intravasküler enjeksiyonu yoluyla intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücrelerinin nasıl ayırt edileceğini gösteriyoruz. Bu protokol, naif ve yaralı kalpteki miyokard B hücrelerinin analizini de dahil etmek isteyen herhangi bir bilim adamının araştırmasıyla ilgilidir. Bu protokolün yaygın olarak uygulanması, araştırma grupları arasındaki tutarsızlıkları azaltacak, intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücre havuzlarındaki değişikliklerin analizine izin verecek ve böylece kardiyak immünoloji alanındaki keşiflerin ilerlemesini destekleyecektir.

Özetle, protokol, akış sitometrisi yoluyla miyokard B hücrelerini ölçmek ve analiz etmek için optimize edilmiş bir iş akışını temsil eder ve aynı zamanda ekstravasküler boşlukta ve intravasküler boşlukta bulunan hücreleri ayırt eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede açıklanan tüm deneyler, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki IACUC'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Hazırlıklar

  1. FACS Arabelleğini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
  2. Hayvanları ötenazi yapmak için yeterli CO2 olduğundan emin olun.
  3. Diseksiyon alanını hazırlayın (tezgah pedini yerleştirin ve bant ve diseksiyon aletlerini yakına yerleştirin).
  4. 15 mL tüpleri etiketleyin, her tüpe kalsiyum ve magnezyum içeren 3 mL HBSS koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları buzun üzerine yerleştirin (kalp başına bir tüp ve Referans grup / akış sitometrisi kontrolleri için ekstra bir tüp). Ayrıca, küçük (35 mm) Petri kaplarını HBSS ile doldurun.
  5. Sıcaklık kontrollü çalkalayıcıyı açın, 37 °C'ye ayarlayın ve santrifüjü 4 °C sıcaklıkta önceden soğutun.
  6. Şırınga pompasını hazırlayın ve akış hızını 3 mL / dak'ya ayarlayın. 20 mL'lik bir şırıngayı HBSS ile doldurun, tüp hattını tamponla doldurun ve kabarcıkları çıkarın.

2. İntravasküler B hücresi boyama (in vivo)

  1. C57BL/6J suşunun 12 haftalık erkek faresini tartın. 100 μL B220 antikor seyreltmesi ile 3/10 cc'lik bir insülin şırıngası yükleyin (PBS'de 1:10). Işıktan korumak için şırıngayı alüminyum folyo ile örtün.
  2. Bir fareyi anestezi altına alın.
    1. 400 mg / kg'lık bir doz ile% 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın ve 10-20 dakika bekleyin.
      NOT: Farenin nefes alış verişini ve hareketini izleyin. Fare hareket etmeyi bıraktığında, ayak parmağını sıkıştırarak ağrıyı uyarın; yoksunluk refleksinin olmaması yeterli anesteziyi gösterir.
    2. 20 dakika içinde yeterli anestezi sağlanamazsa, 100 mg / kg'da ek bir anestezi dozu uygulanabilir ve her 5 dakikada bir fare kinetiği, yoksunluk refleksi ve solunum değerlendirmesi yapılmalıdır.
  3. Fareyi laboratuvar tezgahının üzerine bir tarafa doğru eğimli bir tezgah pedine yerleştirin, sırtın derisini yavaşça aşağı çekin ve gözün çıkıntı yapmasını sağlamak için gövdeyi tezgaha hafifçe bastırın.
  4. Seyreltilmiş B220 antikorunu retroorbital enjeksiyonla adım 2.1'den enjekte edin.
    1. Şırıngayı farenin başının sagital düzleminden 45 ° C'de göze sokun. Çözeltiyi yavaşça enjekte edin. Direnç hissedilirse, şırıngayı çıkarın ve tekrar girin. 2 dakika bekleyin.
      NOT: Uzun süreli inkübasyon süresi, intravasküler ve ekstravasküler B hücrelerini ayırt etme yeteneğini tehlikeye atacaktır, çünkü enjekte edilen antikorun vaskülatür dışına yayılması için zaman verecektir.
  5. IACUC düzenlemelerine göre fareyi ötenazileştirin.
    1. CO2 akışını ötenazi odasına 0,5 L/dak hızında veya odanızın büyüklüğüne göre önerilen akış hızında açın.
    2. Fareyi önerilen süre boyunca odaya yerleştirin ve artık nefes almadığından emin olun. Onu çıkarın ve ikincil bir ötenazi yöntemi olarak servikal çıkık gerçekleştirin.
    3. Fare ötenazi yapıldıktan sonra, derhal organ toplama ve perfüzyona geçin.

3. Kalp koleksiyonu

  1. Göğüs açıklığı.
    1. Farenin derisini forseps ile epigastrik bölgede tutun. Makas kullanarak ciltte 2 mm'lik bir açıklık açın ve göğüs ve karnın parlak yarı saydam bir tabakası olan fasya tabakasını ortaya çıkarmak için cildi soymak için forsepsleri kullanın. Karın duvarını açmak ve ksifoid süreci ortaya çıkarmak için epigastriyumda fasya ve periton boyunca kesin. Hemostatik forseps kullanarak ksifoid işlemi kelepçeleyin.
    2. Makasla, göğüs duvarından her iki taraftaki orta klaviküler çizgi seviyesinde dikey bir kesim yapın ve açıklığı korumak için ağırlık olarak hemostatik forseps kullanarak mediasten içeriğini ortaya çıkarmak için ön göğüs duvarını kaldırın.
  2. Kalp perfüzyonu ve ekstraksiyonu.
    1. Forseps kullanarak, kalbi çevreleyen yağ veya timik dokuları çıkarın.
    2. Forseps kullanarak aortu arkadan güvenli bir şekilde tutun. Şırınga iğnesini (25 G) kalbin tepesine sokun. 3 mL/dak hızında 3 mL HBSS ile perfüze edin.
      NOT: Perfüzyonu izleyin. Karaciğer dolmalı ve koroner damarlardaki kan tamamen çıkarılmalıdır. Sabit bir akışı korumak için 1 mL / dakikaya kalibre edilmiş bir şırınga pompasının kullanılması önerilir.
    3. Aortu makas kullanarak kesin ve kalbi çıkarın. Kalan kanı çıkarmak için kalbi Petri kabında HBSS ile yıkayın. Makas ve forseps kullanarak yağ, bağ dokusu ve timüsü çıkarın ve kalbi kurutun. İzole edilmiş kalbi tartın ve ağırlığı miligram cinsinden not edin. Kalbi oda sıcaklığında bir bıçakla küçük parçalara (1-2 mm) doğrayın.
      NOT: Yetişkin fare kalpleri 0,090-0,210 mg ağırlığında olabilir.
    4. Kalp dokusunun kütlesini ölçün ve 3 mL HBSS içeren 15 mL'lik bir tüpe sindirilmek üzere 60 mg kıyılmış kalbi yerleştirin. Kalan kalp dokusunu koruyun ve "Referans kontrol dokusu" etiketli bir tüpe yerleştirin; bu, canlı-ölü sinyal ve otofloresan için kompanzasyon kontrolü için kullanılacaktır.

4. Kalp sindirimi ve hücre boyama

  1. Kıyılmış doku içeren her tüpe enzimler ekleyin (bakınız Tablo 1). Tüpe 0.5 μL / mg DNaz 1 (60 mg kalp dokusu için 300 Ünite), 0.5 μL / mg kollajenaz II (60 mg kalp dokusu için 625 Ünite) ve 0.2 μL / mg hyaluronidaz (60 mg kalp dokusu için 50 Ünite) ekleyin.
  2. Sindirim reaksiyonunu çalkalayıcıya 300 rpm'de 30 dakika boyunca yerleştirin. Çalkalayıcı rafını yaklaşık 25° eğime ayarlayın.
  3. 15 mL reaksiyon tüplerinin her birine 7 mL HBSS ekleyin ve hızlanma ve kırma orta veya yavaş olarak ayarlanarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı boşaltın ve kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için her peleti 5 mL ACK lizis tamponunda yeniden askıya alın. ACK lizis tamponunda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Her tüpe 10 mL PBS ekleyin, karıştırın ve ardından 40 μm'lik bir süzgeçle 50 mL'lik bir tüpe filtreleyin. Tüm kalıntıların filtre odasının içinde olduğundan emin olun. Filtre üzerindeki kalıntıları, filtre haznesi içinde tamamen asılı kalana kadar bir şırınga pistonu ile parçalayın.
  5. Ses seviyesi kalp başına 25 mL'ye ulaşana kadar filtreden PBS ekleyin; bu, askıya alınmış hücrelerin filtreden geçmesine izin verecektir. Referans kontrol doku tüpüne ilave 25 mL PBS ekleyin ve hacmi farklı tüplere bölün (her biri 25 mL). Tüplerden birini "Lekesiz" ve diğerini "Canlı ölü" olarak etiketleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj.
    NOT: Bu noktada, canlı-ölü lekesi için seyreltmeyi hazırlayın (seyreltme: 1x PBS'de 1:500).
  6. Süpernatanı boşaltın, peleti 100 μL PBS'de lekesiz tüpte ve diğer peletlerin her birini canlı-ölü leke seyreltmesinin 100 μL'sinde yeniden askıya alın. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın, buz kovasını alüminyum folyo ile kaplayın.
  7. Her numuneye 500 μL FACS tamponu ekleyin ve 40 μm'lik bir filtreden etiketli bir FACS tüpüne aktarın. FACS tüplerini 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın. Peleti 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
  8. Lekesiz ve Canlı ölü tüpler hariç, her tüpe 50 μL Fc bloke edici çözelti ekleyin (bakınız Tablo 1). 5 dakika boyunca karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
  9. Lekesiz ve Canlı ölü tüpler hariç her tüpe 50 μL antikor karışımı çözeltisi ekleyin ( Tablo 1'e bakınız) ve buz kovasını alüminyum folyo ile kaplayarak karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  10. Her boruya 2 mL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve 300-500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.

5. Akış sitometrisi

  1. Cihaz kontrol ayarlarını yapın.
    NOT: Bu protokolde numune 4 lazerli Cytek Aurora akış sitometresi ile analiz edilir. İlgilenilen belirteçleri tespit etmek için başka bir uygun akış sitometresi kullanılabilir.
    1. Cihaz kontrol yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu). Pencerenin üst kısmında, Edinme sekmesini seçin ve Yeni + 'ya tıklayın. Yeni Deneme Oluştur adlı bir pencere görüntülenir.
    2. Kitaplık bölümünde, Filtre uygulanacak tür alanına PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 ve Zombie Aqua yazın ve her birini yazdıktan sonra Ekle'yi tıklatın. Florofor isimleri sağda görülmelidir. Ardından, Grup sekmesine devam etmek için İleri'yi tıklatın.
    3. Grup sekmesinde, analiz için kalbi eklemek üzere tüplü sembolü tıklatın.
    4. + Referans grubuna tıklayın ve bir pencere açılacaktır. Floresan etiket sütununda Zombie Aqua'yı seçin ve kontrol türü sütununda Hücreler'i seçin, ardından Kaydet'i tıklayın.
    5. İleri > İşaretçiler sekmesini tıklatın; floroforların adlarını içeren bir tablo görüntülenecektir. Her florofor sütununun ilk satırına karşılık gelen hücre işaretleyicisini yazın ve PerCP-Cy5.5 için Enter: CD45 yazın; BV421 için CD19; Alexa Fluor 700 için CD11b; PE için B220; ve Zombie Aqua için canlı-ölü.
    6. Edinme sekmesine gitmek için İleri'yi iki kez tıklatın. Deney grubunun Kaydedilecek Olaylar'da 10.000.000 ve referans grubu satırı için aynı alana 200.000 yazın. Kaydet ve Aç'ı tıklayın. Diğer ayarlar varsayılan olarak kalmalıdır: Durma Süresi 10.000 ve Durdurma Düzeyi 3.000 olmalıdır.
    7. Sol altta Enstrüman kontrolü'ne tıklayın. Voltajı FSC-50, SSC-175, SSC-B-175 olarak ayarlayın. Ardından, Edinme Denetimi'ni seçin. Akış hızı seçeneği için açılır menüden Yüksek'i seçin.
  2. Bir sitometre ile referans örnekleri alın ve yazılımda karışımını çözün.
    1. Lekesiz kalp tüpünü vorteksleyin ve numune enjeksiyon portuna (SIP) güvenli bir şekilde yerleştirin. Yeşil gösterge okunun doğru numuneyi işaret ettiğinden emin olun, ardından sitometre yazılımının Edinme Kontrol panelinde Başlat'ı tıklayın ve olaylar kaydedilene kadar bekleyin. Aynı şeyi Live-dead-stained kalp dokusu için de yapın.
    2. Mix Çıkar menüsünü seçin ve aşağıdaki kontrolleri ayarlayın:
      1. Kitaplıktaki sütunda PE, PerCP-Cy5.5, BV421 ve Alexa Fluor 700 onay kutularını seçin. Zombie Aqua'nın aynı sütunda işaretli olmadığından emin olun. Alt kısımda, Floresan Etiketi olarak Otofloresan seçeneğini işaretleyin.
      2. Pozitif/Negatif Popülasyonları Tanımla sekmesine gitmek için İleri'yi tıklatın. Bu sekmede, FSC-A ve SSC-B-A arasındaki bir çizim görüntülenir. FSC-A ekseninde 1,0 M ile 4,0 M arasında ve SSC-B-A ekseninde 0,2 M ile 3,0 M arasında bir alan seçmek için çokgenin noktalarını tıklatıp sürükleyin.
      3. Sağdaki bir sonraki grafikte, V5-A X ekseninde görüntülenecektir. En sağdaki zirvenin yarısını pozitif ve grafiğin sol tarafındaki bir bölgeyi negatif olarak seçmek için kapıları hareket ettirin. Referans Grubu - Lekesiz başlıklı grafikte, benzer bir aralıkta bir popülasyon seçin. Bunun için lekesiz pozitif-negatif ayarlanmak zorunda değildir.
  3. Deneysel örnekler edinin.
    1. Tek bir fare için bir örnek içeren her tüp için, tüpü vortekse edin ve güvenli bir şekilde SIP üzerine yerleştirin. Yeşil gösterge okunun doğru numuneyi işaret ettiğinden emin olun, ardından sitometre yazılımının Edinme Kontrol panelinde Başlat'ı tıklayın ve olaylar kaydedilene kadar bekleyin.
  4. Geçit stratejisi.
    1. Varsayılan Karıştırılmamış Çalışma Sayfası sekmesini seçin. Üstteki Nokta çizimi aracını kullanarak FSC-A ve SSC-A grafiği oluşturun. Poligon seçim aracını kullanarak FSC-A ekseninde 0,4 M'den yüksek ve SSC-A ekseninde 0,8 M'den yüksek olayları seçin. Bu seçime çift tıkladığınızda yeni bir grafik görüntülenecektir.
    2. Yeni oluşturulan grafikten, X ekseni etiketine sağ tıklayın ve AF-A'yı seçin; Y ekseni etiketine sağ tıklayın ve Canlı ölü lekesi'ni seçin. Üstteki Dikdörtgen seçim aracına tıklayın ve alt canlı-ölü sinyaline karşılık gelen canlı-ölü ekseninde 105'in altındaki tüm olayları seçin. Bu seçime çift tıkladığınızda yeni bir grafik görüntülenecektir.
    3. Yeni grafikte, X ekseni için PerCP-Cy5.5-A'yı ve Y ekseni için SSC-A'yı seçmek için sağ tıklayın. Dikdörtgen seçim aracını kullanarak,CD45 pozitif hücrelerine karşılık gelen PerCP-Cy5.5-A ekseninde 10 4'ten yüksek olayları seçin. Seçime çift tıklayın ve yeni bir grafik görüntülenecektir.
    4. Yeni grafikte, X ekseni için FSC-A'yı ve Y ekseni için FSC-H'yi seçmek üzere sağ tıklatın. Poligon seçim aracını kullanarak, FSC-A değeri ile SSC-A değerinin aynı olduğu bir eğilimi izleyen olayları seçin; bununla hücre çiftleri çıkarılacak ve seçimdeki popülasyon CD45+ popülasyonu olarak adlandırılacaktır. CD45+ popülasyonuyla yeni bir grafik görüntülemek için seçime çift tıklayın.
    5. CD45+ popülasyon grafiğinden, X ekseninde BV421 ve Y ekseninde SSC-A'yı seçmek için sağ tıklayın. Poligon seçim aracını kullanarak BV421 ekseninde sağdaki popülasyonu seçin. Bu B hücresi popülasyonudur. B hücresi popülasyonuyla iki yeni arsa oluşturmak için bu popülasyonda iki kez çift tıklayın.
      1. X ekseninde PE-A ve Y ekseninde BV421-A ile ilk B hücresi grafiğini ayarlamak için sağ tıklatın. Sağdaki popülasyon intravasküler B hücrelerine karşılık gelir ve soldaki popülasyon interstisyel B hücrelerini temsil eder. Her ikisinden de seçim yapmak için Poligon seçim aracını kullanın.
      2. X ekseninde Alexa Fluor 700-A ve Y ekseninde SSC-A ile ikinci B hücresi grafiğini kurmak için sağ tıklayın. Soldaki popülasyon CD11b hücrelerine karşılık gelir ve sağdaki olaylar (varsa) CD11b + hücrelerine karşılık gelir.
      3. Her seçime sağ tıklayın ve ardından Kapı Özellikleri'ne tıklayın. Boyutları ve yüzdeleri görüntülemek için Count ve % Parent (Ebeveyn Sayısı) ve % Parent (Ebeveyn Yüzdesi ) öğelerine tıklayın. Daha fazla veri analizi için olay sayısını ve yüzdeleri kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Edinme tamamlandıktan ve tüm olaylar toplandıktan sonra, veriler standart akış sitometrisi uygulamasına göre analiz edilmelidir. Analizin odağı, her deneyin bireysel amacına bağlı olarak değişecektir. Bu durumda, intravasküler ve ekstravasküler B hücrelerinin nicelleştirilmesi takip edildi ve mg doku başına düşen hücre sayısı olarak ifade edildi.

Bir spektral sitometre kullanırken, analize, bağışıklık hücrelerine karşılık gelen bir aralıkta olmayan boyutlardaki kalıntıları çıkarmak için bir ba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Giderek artan sayıda kanıt, B hücrelerinin miyokard fizyolojisi ve miyokard yeniden şekillenmesi / yaralanmaya adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir 7,8,9,10,11,12,13,36. Akış sitometrisi, herhangi bir dokudaki bağışıklık hücresi p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Luigi Adamo, kalp yetmezliğinin tedavisi için immünomodülatör moleküllerin geliştirilmesine odaklanmış bir şirket olan i-Cordis, LLC'nin kurucu ortağıdır ve B hücresi modüle edici ilaç pirfenidonun türevlerine özel bir ilgi duymaktadır. Geri kalan yazarların beyan edecek herhangi bir çelişkisi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Luigi Adamo'ya verilen NHLBI hibeleri 5K08HLO145108-03 ve 1R01HL160716-01 tarafından finanse edilmiştir.

Bu çalışmayı geliştirmek için kullanılan Aurora Akış Sitometresi, NIH Grant S10OD026859 tarafından finanse edildi. JHU Ross Flow Cytometry Core'un desteğini kabul ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 700 anti-fare/insan CD11b Antikoru101222BioLegend100 & G 200 ve mikro; L
(CellTreat 29481) Hücre Süzgeci, 40 & m, BlueQBIAP303Southern Labware
0.5 mL Doğal Mikrosantrifüj Tüpü1605-0000SealRite, ABD Bilimsel
% 0.9 Sodyum Klorür Enjeksiyonu, USP114-055-101Kalite Biyolojik0.90
1.5 mL Doğal Mikrosantrifüj Tüpü1615-5500SealRite, ABD Bilimsel
10 ve mikro; L Dereceli TipOne Filtre Uçları11213810USA Scientific
1000 & L Dereceli TipOne Filtre Uçları11267810USA Scientific
15 mL Santrifüj Tüpü, Tapa Conta Kapağı, Polipropilen, RNase-/DNase İçermeyen430052Corning
1 Stop Vanası, PolikarbonatSVPT951ECT İmalatı
2,2,2-TribromoetanolT48402Sigma-Aldrich
200 & mikro; L Dereceli TipOne FiltreUçları 11208810ABD Bilimsel
3 Stop Vanası, PolikarbonatSVPT953ECT İmalatı
5 mL Polistiren Yuvarlak Tabanlı Boru, 12 x 75 mm stil352054Falcon, Corning Marka
50 mL Santrifüj Tüpü, Tapa Conta Kapağı, Polipropilen, RNase-/DNase içermeyen430290Corning
ACK ( Amonyum-Klorür-Potasyum) Lizing Tamponu118-156-101Kalite BiyolojikOzmolalite: 290 + veya -%5 mOsm/Kg H20
Adaptör 4x50ml, Rotor A-4-63'te 250 mL dikdörtgen kova için15Eppendorf
Adaptörü, Adaptör başına 9 Tüp, Eppendorf
22638289 Rotor Model A-4-62 ile kullanım için Konik Alt15 yuvarlak tabanlı boru için adaptör 2.6 – 7 mL, Rotor A-4-62'de 250 mL dikdörtgen kova için22638246Eppendorf
Alüminyum Folyo 12 inç x 75' Rulo .0007UPC 109153Reynolds Wrap
Anestezi İndüksiyon Odası - FareRWD-AICMV-100Davranış Bilimi
BD Luer Slip Tip Şırınga, ekli iğne ile 25 G x 5/8 inç, steril, tek kullanımlık, 1 mL309626BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra İnce İnsülin Şırıngaları 29G 1cc 1/2" 100'lü PaketCMD 2613Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-fare CD19 Antikor115537BioLegend50 & g/mL
Süzgeç örgülü 35 ve mikro Akış Tüpleri için KAPAKLAR; m, 12 x 75 mm tüpler için çift konum, sterilT9009Güney Labware
Karbon Dioksit USP E CGA 940  CD USPEAirGas USA
Cole-Parmer Essentials Düşük Formlu Beher, Cam, 500 mLUX-34502-46Cole-Parmer
Kollajenaz 2LS004176Sigma-Aldrich
Konnektör Pirinç Krom Kaplama 1/4" Dişi NPT x 1/4" DikenY992611-AGAirGas USA
Cytek Aurora Akış SitometresiCytek Biosciences
Diss 1080 Nipel 1/4 BARB CPM-08-12AirGas USA
DNase I - 40.000 UD4527Sigma-Aldrich
Easypet  3 - Elektronik Pipet Kontrol Cihazı4430000018Eppendorf
Elektronik Terazi, AX223/E30100606Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R santrifüj5810REppendorf
Eppendorf Research plus 1 kanallı değişken pipetlerEppendorf
FlowJo 10.8.1BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, üçlü yoğunluklu Buz Tavası (IPAN-3100)Z740287Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076gibco1x
HyaluronidazH3506Sigma-Aldrich
Kelly Kanama Durdurucular, Düz13018-14Güzel Bilim Araçları
Luer Slip Şırınga steril, tek kullanımlık, 20 mL302831BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI / CGA940M1-940-PGAirGas USA
McKesson Alt Pedler, Orta4033- CS150McKesson
Navigator Çok Amaçlı Taşınabilir TeraziNV2201Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]10010023gibco1x
PE anti-fare / insan CD45R / B220 Antikor103208BioLegend200 & mikro; g/mL
PerCP/Siyanin5.5 anti-fare CD45 Antikoru103132BioLegend100 & mikro; g 500 uL
Petri kabı, İstiflenebilir 35 mm x 10 mm Steril PolistirenFB0875711YZFisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Somun/CO2/CO2-02M08-1AirGas USA
Güçlü 6 Watt LED Çift Kaz Boyunlu AydınlatıcıLED-6WAmScope
PrecisionGlide İğne 25 G x 5/8 (0,5 mm x 16 mm)305122BD Becton, Dickinson and Company
Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16 / CD32 (Fare BD Fc Bloğu) Klon 2.4G2 (RUO)553141BD Becton, Dickinson ve Company Biosciences0.5 mg / mL
R 4.1.1R Vakfı
Tıraş Bıçakları9501250000Accutec Blades Inc
Regülatör analitik iki aşamalı 0-25 psi teslimat CGA320 3500 psi girişY12244A320-AGAirGas USA
Rotor A-4-62, 4 x 250 mL dikdörtgen kova dahilRotor A-4-62Eppendorf
Serolojik pipet, tıkalı, 10 mL, steril, pirojenik olmayan/endotoksin içermeyen, sitotoksik olmayan, 1 adet/blister86.1254.001Sarstedt AG & Co KG
Sigma etiket bandıL8394Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0Cytek Biosciences
, PP, Düz, Erkek Luer Kilidi x 1/8" Hortum Dikeni; 1/EAMTLL230-6005Spex
Std Duvar Laboratuvarı Borusu, Boyut S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Duvar x 50' UzunCG-730-003Excelon Laboratuvarı
İğnesiz şırınga PP / PE, 3 mLZ683566Millipore Sigma
Şırınga pompası55-1199 (95-240)Harvard Apparatus
Thomas 3 Kanallı Alarm Zamanlayıcı TM105009371W13Thomas Scientific
Tüp Rafı, 12  pozisyonlar, 5.0  için 6; mL ve 15  mL tüpler ve 25  için 6; mL ve 50  mL tüpler, polipropilen, numaralı pozisyonlar, otoklavlanabilir30119835Eppendorf
Tüp Rafı, 12  pozisyonlar, 5.0  mL ve 15  mL tüpler, polipropilen, numaralı pozisyonlar, otoklavlanabilir30119827Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratuvar Boruları, ID & zamanlar; OD 1/4 inç & kez; 3/8 inçT8913 (Millipore Sigma)Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2SI-0236Bilimsel Endüstriler, Inc.
Kavisli Uçlu Kılavuz Pimli VWR Diseksiyon Forseps89259-946Avantor, VWR
VWR Diseksiyon Makası, Keskin Uç, 4½ "82027-578Avantor, VWR
VWR İnkübe Orbital Çalkalayıcı, Model 3500I12620-946Avantor, VWR
Zombie Aqua Tamir Edilebilir Canlılık Kiti423102BioLegend
% mL Santrifüj Tüpleri için 5810759005 Spex VapLock Luer Bağlantı Elemanı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
  3. Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
  4. Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
  5. Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
  6. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377(2020).
  7. Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
  8. Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
  9. Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
  10. Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
  11. Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
  12. Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
  13. Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
  14. Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
  15. Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
  16. Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
  17. Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
  18. Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603(2017).
  19. Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
  20. Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
  21. Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
  22. Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
  23. Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
  24. Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
  25. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  26. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  27. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  28. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  29. Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
  30. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  31. Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015(2019).
  32. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  33. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  34. Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
  35. Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
  36. Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
  37. Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

B H cre Kantifikasyonumm n H cre zolasyonuKalp DigestionuAntikor Boyamantravask ler B H crelerinterstisyel B H creleriCD45 Pozitif H crelerB220 Antikoru

İlgili makaleler