Yüksek verimli izolasyon ve küçük hücre dışı veziküllerin saflaştırılması için akış sitometrik sıralama parametrelerinin optimizasyonu

Summary

Bu protokol, hava püskürtme nozulunun boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, numune akış basıncını, voltajı, kazancı ve tetikleyici eşik parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir izolasyon yöntemi sağlar.

Abstract

Küçük hücre dışı veziküller (sEV) tüm hücre tiplerinden salınabilir ve protein, DNA ve RNA taşıyabilir. Sinyal molekülleri, bir hücrenin fizyolojik ve patolojik durumunun göstergeleri olarak hizmet eder. Bununla birlikte, aşağı akış biyobelirteci tanımlamasını ve ilaç müdahale çalışmalarını önleyen sEV izolasyonu için standart bir yöntem yoktur. Bu yazıda, bir akış hücresi sıralayıcısı ile 50-200 nm sEV'nin izolasyonu ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bunun için, iyi bir sıralama hızı ve kararlı bir yan akış elde etmek için 50 μm'lik bir nozul ve 80 psi kılıf sıvı basıncı seçildi. Standart boyutlu polistiren mikrosferler, 100, 200 ve 300 nm parçacıkların popülasyonlarını bulmak için kullanıldı. Voltaj, kazanç ve ileri saçılma (FSC) tetikleme eşiğinin ek optimizasyonu ile sEV sinyali arka plan gürültüsünden ayrılabilir. Bu optimizasyonlar, yalnızca FSC ve yan saçılma (SSC) kullanarak temsili bir sEV popülasyonu elde edilmesini sağlayan kritik sıralama ayarlarından oluşan bir panel sağlar. Akış sitometrisi tabanlı izolasyon yöntemi sadece yüksek verimli analize izin vermekle kalmaz, aynı zamanda biyobelirteç ekspresyonuna dayalı sEV'nin senkron sınıflandırmasına veya proteom analizine izin vererek çok sayıda aşağı akış araştırma uygulaması açar.

Introduction

Bir hücre, hücreler arası iletişim için önemli olan sinyal molekülleri ve membran kapanımları ile sonuçlanan çeşitli boyutlarda hücre dışı vezikülleri (EV'ler) serbest bırakır¹. Farklı boyutlardaki EV'ler de farklı biyolojik roller oynar, 50-200 nm sEV, RNA, DNA ve proteinleri doğru hücre dışı konuma hassas bir şekilde dağıtabilir. sEV ayrıca, sadece immün sürveyans, kök hücre bakımı, kan pıhtılaşması ve doku onarımı gibi normal fizyolojik süreçlerin düzenlenmesini değil, aynı zamanda tümör ilerlemesi ve metastaz ^2,3 gibi çeşitli hastalıkların altında yatan patolojiyi de içeren salgı me....

Protocol

1. Hücre kültürü

1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) bir kültür ortamını hazırlayın. İnsan pankreas kanseri hücresi PANC-1'i, 1 x 10⁶ hücre / mL yoğunluğunda 75^cm2'lik bir kültür şişesinde kültürleyin. Kültürü 37 °C'de %5 CO₂ ile inkübe edin.
2. Mikroskobik gözlem altında hücre yoğunluğu %75-%80'e ulaştığında hücreleri alt kültüre alır. Ortamı çıkarın ve 3-5 mL fosfat tampon salin (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4) ile 2 kat durulayın.
3. Çözeltiyi atın, 1-2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücrelerin mikroskop altındaki ortamda yuvarlanıp asıla....

Results

Deneysel protokolün akış şeması diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu yöntemde, partikül boyutu dağılımı için referans standartlar olarak standart boyutlu polistiren mikrosferler kullanılmıştır. Belirli enstrümantal parametre koşulu altında, parçacık sinyali, logaritmik form kullanılarak FSC ve SSC grafiğindeki arka plan gürültüsünden açıkça ayırt edilebilir. Geçit stratejileri Şekil 2'de gösterilmiştir. R4, R5 ve R6, sırasıyla 100 nm, 200 nm ve 300 nm mikrosf.......

Discussion

Bu protokol, NTA tarafından doğrulanan bir akış hücresi sıralayıcısı kullanarak 50-200 nm'lik belirtilen parçacık boyutuyla sEV'yi izole etmek ve saflaştırmak için optimize edilmiş bir yöntemi özetlemektedir. Yöntem, düzgün parçacık boyutu ve yüksek saflıkta sEV elde etme darboğazı problemini çözdü ve büyük boyutlu EV'lere sarılmış ilgisiz biyolojik moleküllerin müdahalesini önledi²². Saniyede 100.000 parçacık yakalayabilen ve saniyede 70.000 sıralama kararı alabilen akış sitometrisi ile hızlı, yü.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Santrifüj tüpü	Beckman Coulter	344058
Kültür şişeleri	Corning
Dulbecco' s modifiye kartal ortamı	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal sığır serumu	SUER	SUER050QY
Akış hücresi sıralayıcı	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
İnsan pankreas kanseri hücresi, PANC-1	NA	NA	PANC-1 hücreleri, Zhejiang Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi'nden Profesör Weijun Yang tarafından bağışlandı
Lazer parçacık boyutu ve zeta potansiyeli Analizör	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Fosfat tampon salin	Gibco	C20012500BT
Polistiren floresan mikroküreler	Beckman Coulter	6602336
Transmisyon elektron mikroskobu	JEOL	JEM-1200EX
Tripsin-EDTA çözeltisi	Gibco	1713949
Ultra gökkuşağı floresan parçacıkları	Beckman Coulter	B28479
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultrasantrifüj rotoru	Beckman Coulter	SW32TI