Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

Summary

Süper çözünürlüklü mikroskopi, mayozdaki sinaptonemal kompleks içindeki bileşenlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bir fikir verebilir. Burada, Caenorhabditis elegans synaptonemal kompleksinin bireysel proteinlerini çözmek için bir protokol gösteriyoruz.

Abstract

Mayoz sırasında, homolog kromozomlar doğru ayrışmalarına izin vermek için birbirlerini tanımalı ve birbirine yapışmalıdır. Homolog kromozomların etkileşimini güvence altına alan anahtar olaylardan biri, mayotik faz I'de sinaptonemal kompleksin (SC) birleşmesidir. Farklı türler arasında SC içindeki protein bileşenleri arasında çok az dizi homolojisi olmasına rağmen, SC'nin genel yapısı evrim sırasında oldukça korunmuştur. Elektron mikrograflarında, SC, yanal elemanlardan veya eksenlerden, enine filamentlerden ve merkezi bir elemandan oluşan üçlü, merdiven benzeri bir yapı olarak görünür.

Bununla birlikte, SC'nin moleküler yapısını belirlemek için kompleks içindeki bireysel bileşenlerin lokalizasyonunu elektron mikroskobu ile kesin olarak tanımlamak zor olmaya devam etmektedir. Buna karşılık, floresan mikroskopi, kompleks içindeki bireysel protein bileşenlerinin tanımlanmasına izin verir. Bununla birlikte, SC sadece ~ 100 nm genişliğinde olduğundan, alt yapısı kırınım sınırlı geleneksel floresan mikroskobu ile çözülemez. Bu nedenle, SC'nin moleküler mimarisinin belirlenmesi, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu veya tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) gibi süper çözünürlüklü ışık mikroskobu teknikleri gerektirir.

SC içindeki bireysel bileşenlerin yapısını ve etkileşimlerini korumak için, kompleksi germ hücrelerindeki doğal ortamına yakın bir ortamda gözlemlemek önemlidir. Bu nedenle, SMLM ve STED mikroskobu ile sağlam, ekstrüde Caenorhabditis elegans germline dokusunda SC'nin alt yapısının incelenmesini sağlayan bir immünohistokimya ve görüntüleme protokolü sunuyoruz. Dokunun doğrudan kapak kapağına sabitlenmesi, görüntüleme sırasında numunelerin hareketini azaltır ve SC'nin altyapısını biyolojik bağlamında görselleştirmek için gereken yüksek çözünürlüğü elde etmek için numunedeki sapmaları en aza indirir.

Introduction

Mayoz sırasında kromozom sayısını yarı yarıya azaltmak, cinsel olarak üreyen organizmalarda sağlıklı soy üretmenin anahtarıdır. Kromozom sayısındaki bu azalmayı sağlamak için, homolog kromozomlar mayoz I sırasında eşleşmeli ve ayrılmalıdır. Homolog kromozomların doğru bir şekilde ayrılmasını sağlamak için, germ hücreleri, homolog kromozomların homologlar¹ arasında fiziksel bağlantılar oluşturmak için eşleştiği, sinaps yaptığı ve yeniden birleştiği genişletilmiş bir faz I'e maruz kalır. SC, mayotik faz² yoluyla doğru ilerlemeyi düzenlemede anahtar olan merkezi yapı olarak ortaya çıkmıştır.

SC, protein bileşenleri arasında çok az homoloji olmasına rağmen, genel yapısı evrimsel olarak korunan bir komplekstir. SC ilk olarak elektron mikrograflarında iki yanal eleman veya eksenden oluşan üçlü, merdiven benzeri bir yapı, enine filamentlerin oluşturduğu merkezi bir bölge ve merkezi bir element ^3,4 olarak tanımlanmıştır. Kompleks içindeki bireysel bileşenlerin organizasyonunu belirlemek, mayotik profaz sırasında SC'nin rolü hakkındaki anlayışımızı ilerletmenin anahtarıdır.

Model organizma C. elegans, SC'nin yapısını ve işlevini incelemek için idealdir, çünkü germ hatları tamamen monte edilmiş SCs⁵ ile çok sayıda mayotik çekirdek içerir. Genetik ve biyokimyasal çalışmalar, kromozom eksenlerinin, C. elegans'ta HTP-1/2/3 ve HIM-3 7,8,9,10,11 olarak adlandırılan üç ayrı kohezin ^{kompleksi 6,7} ve dört HORMA alan proteini tarafından oluşturulduğunu ortaya koymuştur. SC'nin merkezi bölgesinde, sarmal bobin alanları içeren altı protein bugüne kadar 12,13,14,15,16,17 tanımlanmıştır. İki eksen arasındaki mesafeyi köprülemek için, SYP-1, -5 ve -6 kafa kafaya bir şekilde dimerize olurken (Şekil 1), üç ek protein ise^{merkezi element 16,17,18,19'daki} etkileşimlerini stabilize eder.

Bu proteinlerin organizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi edinmek, SC'nin mayoz sırasındaki birçok fonksiyonunu anlamada esastır. SC'nin merkezi bölgesinin genişliği sadece ~ 100 nm olduğundan, alt yapısı kırınım sınırlı floresan mikroskobu ile çözülemez. Bununla birlikte, bu boyuttaki bir yapı içindeki bileşenleri görselleştirmek, süper çözünürlüklü mikroskopi ile kolayca elde edilebilir. Gerçekten de, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), genleşme mikroskobu 20, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu 21 ve tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM)22,23, ^SC'nin moleküler mimarisini 16,24,25,26,27,28,29 türleri arasında incelemek için gerekli araçlar olarak ortaya çıkmıştır^{. 30}.

Çözünürlük sınırının üstesinden gelmek için, STED mikroskopisi, emisyon ışığının kırınım sınırlı noktasını, STED lazerden gelen çörek şeklindeki bir ışınla kaplamaya dayanır ve bu da teorik olarak nokta yayılma fonksiyonunu moleküler boyutlara kadar daraltır^31,32. Bununla birlikte, biyolojik örnekler içinde STED tarafından pratik olarak elde edilebilen çözünürlük, xy^33'te birkaç on nanometre aralığında kalmaktadır.

SMLM teknikleri ile biyolojik örneklerde daha da yüksek çözünürlük elde edilebilir. SMLM, mekansal olarak örtüşen floroforları zaman içinde ayırarak nesneleri alt kırınım seviyesinde çözmek için spesifik floroforların yanıp sönme özelliklerinden yararlanır. Numune daha sonra floroforların farklı alt kümelerini yakalamak için tekrar tekrar görüntülenir. Floroforların numune içindeki konumu daha sonra, nokta yayılma fonksiyonunun (PSF) tüm görüntülerde elde edilen sinyallere takılmasıyla belirlenir ve bu da yapıları 15 nm ^23,34'e kadar çözebilir.

Birlikte ele alındığında, lokalize görüntüler tüm floroforların konumlarını kodlar. SMLM'nin çözünürlüğü, etiketleme yoğunluğu ve floroforun yanıp sönen özellikleri ile belirlenir. Nyquist-Shannon kriterine göre, ortalama etiket-etiket mesafesinin iki katından daha az olan nesneleri güvenilir bir şekilde çözmek imkansızdır. Bu nedenle, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yüksek bir etiketleme yoğunluğuna ihtiyaç vardır. C. elegans'taki SC için, genom düzenleme kullanılarak endojen proteinlerin belirli bölgelerine bağlı epitop etiketleri kullanılarak yüksek bir etiketleme yoğunluğu elde edilebilir. Epitop etiketleri daha sonra yüksek afiniteleri^19,30 olan spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak yüksek yoğunlukta boyanabilir. Aynı zamanda, bireysel floroforların döngü süresi, mekansal olarak örtüşen floroforların aynı anda yakalanmamasını sağlayacak kadar kısa olmalıdır³⁵.

Bu iki gereksinim nedeniyle, SC gibi büyük makromoleküler komplekslerin yapısını çözmek, yeterince fazla sayıda görüntünün görüntülenmesini gerektirir ve bu nedenle birkaç saat sürebilir. Uzun görüntüleme sürelerinin tuzağı, numunelerin sahnenin hareketi veya numune tamponu içindeki küçük akımlar nedeniyle sürüklenme eğiliminde olmasıdır; 10 nm mertebesindeki küçük hareketler bile nm çözünürlükte zararlıdır ve düzeltilmesi gerekir. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan sapma düzeltme yöntemleri, sırayla görüntülenen iki kanalın görüntülerini doğru bir şekilde bindirmek için yeterince sağlam değildir³⁶. Bu sorunludur, çünkü biyolojik sorular genellikle aynı numune içindeki birden fazla hedefin kesin tespitini ve lokalizasyonunu ister. Bu sorunları aşmak için, oranmetrik görüntüleme gibi yöntemler geliştirilmiştir. Oranmetrik görüntüleme, örtüşen uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip çoklu floroforların eşzamanlı görüntülenmesine izin verir ve tespit edilen her sinyalin, spektral olarak farklı kanallardaki yoğunlukların oranına bağlı olarak kendi floroforuna atanmasını sağlar^37,38.

Ek olarak, SC gibi makromoleküler komplekslerin organizasyonunu incelemek, üç boyutlu (3B) bilgi gerektirir. Üç boyutta (3D-SMLM) süper çözünürlük elde etmek için, yayılan ışığın optik yoluna, odak düzleminden uzaklığına bağlı olarak bir floroforun PSF'sinin şeklini bozan silindirik bir lens dahil edilmiştir. Bu nedenle, bir floroforun z-düzlemindeki kesin konumu, emisyon sinyali^35,39'un şeklini analiz ederek tahmin edilebilir. SMLM'deki bu ilerlemeleri birleştirmek, SC de dahil olmak üzere makromoleküler komplekslerin 3D organizasyonunun görüntülenmesini sağlar.

Protocol

1. Çözeltilerin ve kapakların hazırlanması

NOT: Tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna ve bu protokolde kullanılan çözeltilerin bileşimi için Tablo 1'e bakınız.

1. Poli-L-lizin kaplı kapak kapakları
   1. % 0.01 (w / v) poli-L-lizin hazırlayın (bakınız Tablo 1).
   2. Hassas bir kapak kapağını (24 mm çap; 0,17 ± 0,005 mm, No. 1,5) etanol içinde 10-30 dakika boyunca yıkayın. Etanol çıkarmak için kapak kaymasını ddH₂O ile durulayın ve kapak kaymasını oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   3. Plazma, bir plazma temizleyici kullanarak kapak kapağını temizler.
      NOT: Plazma temizliği, kapak kaymasının hidrofilikliğini arttırır ve aşağıdaki adımları kolaylaştırır. Bir plazma temizleyici mevcut değilse, bu adım atlanabilir, ancak bu, poli-L-lizin çözeltisinin hacminin ve / veya konsantrasyonunun ayarlanmasını gerektirebilir. Bu değişiklik test edilmemiştir.
   4. Kapak kapağına %0,01 (w/v) poli-L-lizinden bir damla (120 μL) yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
   5. Kuluçkadan sonra, kapak kaymasını ddH₂O'da durulayın ve oda sıcaklığında kurutun. 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
2. F(ab')2 parçaları floresan organik boyalarla konjuge edilmiş
   1. Bir PCR tüpüne aşağıdaki sırayla ekleyin: PBS'de 10 μL 0.6-0.7 mg / mL F (ab')2 fragmanı, 1 μL 0.1 M NaHCO 3 (pH_8.3 ) ve DMSO'da 1 mM süksinimidil (NHS) ester reaktif floroforun 1 μL (F (ab')2: boyanın molar oranı ~ 1: 17'dir). Yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
   2. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   3. F(ab')2 parçasını, üreticinin spesifikasyonlarına uygun olarak bir tuz giderme sütunu (7K MWCO) kullanarak kalan serbest reaktif boyadan ayırın. Kolonun dengelenmesi ve etiketli F(ab')2 parçasının elüsyonu için 1x PBS kullanın.
   4. Etiketli F(ab')2 parçasını 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
      NOT: 3 aydan uzun depolama süreleri test edilmemiştir.

2. Diseksiyon ve fiksasyon

NOT: Diseksiyon ve fiksasyon prosedürleri, süper çözünürlüklü mikroskopi için en uygun örnekleri elde etmek için daha önce önerilen prosedürler ^16,40'tan değiştirilmiştir.

1. Diseksiyonu
   1. Yaşa uygun C. elegans solucanlarını (bu çalışma için 20 ° C'de yetiştirilen) bir kapak kayması (22 mm x 22 mm, No. 1) üzerinde 30 μL'lik bir EBTT damlasına (% 0.2 iyonik olmayan deterjanla 1x Yumurta tamponu⁴¹) seçin. Daha kolay manipülasyon için kapak kaymasını cam bir kızağın üzerine yerleştirin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek 30 μL EBTT ile yıkayın. Kapak kayması üzerinde 30 μL'lik bir damla bırakmak için çözeltinin 30 μL'sini çıkarın.
      NOT: Solucanların plastik uçlara yapışmasını önlemek için solucanların pipetlendiği tüm çözeltilere az miktarda iyonik olmayan deterjan eklenmelidir.
   2. Gonadı ekstrüzyon yapmak için solucanların kafalarını ve / veya kuyruklarını kesmek için bir neşter bıçağı kullanın (Şekil 2A).
2. Fiksasyon
   1. Pipet 30 μL fiksatif çözelti (Tablo 1) içine disseke solucanlar damla ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için.
      NOT: Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlemek daha fazla gonadın serbest bırakılmasına yardımcı olabilir.
   2. Fiksatif çözeltiyi ekledikten sonra tam olarak 1 dakika boyunca düzeltin.
   3. Solucanları TBST ile doldurulmuş bir PCR tüpüne aktararak fiksasyonu durdurun (Tablo 1). Solucanları mümkün olduğunca az hacimde (~ 15 μL) aktarın.
   4. PCR tüpünü mini tezgah üstü santrifüjde (2.000 × g, 10 sn) döndürün. Süpernatantı çıkarın ve her biri 200 μL TBST ile 2 kat yıkayın.
   5. 5-10 dakika boyunca 200 μL PBST (Tablo 1) ile yıkayın. Disseke edilmiş numuneleri buz üzerinde tutarken en fazla dört numune için 2.1.1 ile 2.2.5 arasındaki adımları tekrarlayın.
      NOT: Dörtten fazla numune işleniyorsa, numune fiksasyonunun tüm numunelerde tutarlı kalmasını sağlamak için her dört numuneden sonra 2.2.6 ila 2.2.7 arasındaki adımlarla devam edin.
   6. Disseke edilmiş numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 sn) üzerinde döndürün, PBST'yi çıkarın ve 50-100 μL soğuk metanol (-20 ° C) ekleyin.
      DİKKAT: Metanol toksiktir. Koruyucu ekipman giyin ve solunmasından kaçının.
   7. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, numuneleri metanol içinde 30-60 sn bekletin. Numuneleri 200 μL PBST'de 2 kat yıkayın.
      NOT: Dörtten fazla numune işleniyorsa, kalan numunelerin diseksiyonuna devam edin (adım 2.1.1 ila 2.2.7).
   8. Numuneleri 200 μL PBST ile üçüncü kez yıkayın.

3. Antikor inkübasyonları

1. Engelleme
   1. Numuneleri oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca 1x Blokaj Çözeltisinde (Tablo 1) bloke edin.
      NOT: Kuluçka süresi oda sıcaklığında 30 dakikadan 4 ° C'de birkaç güne kadar değişebilir (test 3 güne kadar yapılmıştır).
2. Birincil antikor çözeltisi
   1. Anti-HTP-3 (tavuk⁴²) ve anti-HA (fare) antikorlarını (veya tercih edilen antikorları) çalışma çözeltilerine (SMLM için 1:250 ve STED mikroskopi örnekleri için 1:1.000) 1x Bloke Çözeltisinde seyreltin.
      NOT: SMLM örneklerini etiketlemek için kullanılan antikorlar, SMLM mikroskopisi için daha yüksek bir etiketleme yoğunluğu önerildiğinden, STED örneklerinden daha konsantredir.
   2. Numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 s) üzerinde döndürün, bloke edici tamponu çıkarın ve birincil antikor çözeltisinden 30-50 μL ekleyin. Gece boyunca 4 ° C'de (tercih edilen) veya oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca inkübe edin.
   3. Kuluçkadan sonra, PBST ile 3 x 5-15 dakika yıkayın.
3. Floresan boyaya konjuge edilmiş F(ab')2 parçalarının çalışma çözeltisi
   1. Etiketli F(ab')2 parçalarını (adım 1.2.4) 1x Bloke Çözeltisinde çalışma çözeltilerine (SMLM için 1:100 ve STED mikroskopi örnekleri için 1:1.000) seyreltin.
      NOT: Her iki süper çözünürlük tekniği için, daha önce bildirilen florofor çiftleri, yani SMLM için AlexaFluor647 / CF680 ve STED için AlexaFluor594 / Abberior STAR635P kullanılmıştır. AlexaFluor647 ve STAR645P, SYP-5'in C-terminusunu hedeflemek için fare karşıtı (Fab')2 parçalarını ve HTP-3'ü hedeflemek için CF680 / AlexaFluor594 etiketli anti-tavuk (Fab')2 parçalarını etiketlemek için kullanıldı.
   2. Numuneleri mini bir tezgah üstü santrifüj (2.000 × g, 10 s) üzerine döndürün, PBST'yi çıkarın ve 30-50 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında (tercih edilen) 30 dakika ila 2 saat veya 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. PBST ile 3 x 5-15 dakika yıkayın.

4. Numunelerin bir kapak fişi üzerine monte edilmesi

1. Postfixasyon
   NOT: Numuneleri 4.1.1-4.2.1 numaralı adımlarla tek tek işleyin.
   1. Lekeli örnekleri döndürün ve süpernatanı çıkarın. 50 μL PBST^0,2 ekleyin ve lekeli solucanları 22 mm x 22 mm No. 1 kapak kayması üzerine aktarın.
      NOT: Solucanların kapak kaymasına yapışmasını önlemek için bu adım için taze^PBST 0.2 ile %0,2 iyonik olmayan deterjan (Tablo 1) kullanın.
   2. Pipet 5.7-6.3 μL postfiksatif çözelti bir poli-L-lizin kapak kayması üzerine.
      NOT: 4 °C'de saklanan poli-L-lizin kapaklar öncelikle oda sıcaklığına getirilmelidir.
   3. Pipet, disseke edilmiş solucanları aynı hacimde (5.7-6.3 μL) çıkarır ve poli-L-lizin kapak kayması üzerindeki fiksatif damlasına aktarılır (Şekil 2B).
      NOT: Bu ve sonraki adımda, disseke edilmiş dokunun poli-L-lizin kaplı kapak kaymasının merkezinde tutulması çok önemlidir. Bu, özellikle numunelerin burada kullanılan özel yapım SMLM mikroskobuna uyacak şekilde özel bir tutucuya monte edilmesi durumunda önemlidir (bkz. adım 5.1, Şekil 2B).
   4. Numuneyi küçük bir kapak kapağıyla örtün (12 mm çap, Şekil 2B). Küçük bir filtre kağıdı parçası kullanarak fazla sıvıyı çıkarın (Şekil 2B). Karanlık bir odada 3-5 dakika boyunca sabitleyin.
2. "Donma-çatlama"
   1. Numuneleri kuru buzda alüminyum bir blok üzerine yerleştirerek dondurun (Şekil 2B).
      NOT: Alüminyum blok, numuneleri üzerine yerleştirmeden önce kuru buzda iyice soğutulmalıdır. Kalan örneklerin postfiksasyonuna devam edin (adım 4.1.1 ila 4.2.1). Numunenin bir sonraki adımdan önce en az 20 dakika veya 1 saate kadar kuru buz üzerinde olması gerekir (4.2.2).
   2. Küçük kapak kapağını tıraş bıçağı kullanarak çıkarın (Şekil 2B).
      NOT: STED için adım 5.2.1'e geçin. SMLM için adım 4.2.3 ile devam edin.
   3. Kapak kapağını buz gibi soğuk PBS (tercih edilen) veya -20 °C metanol içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yaklaşık 10 s batırın.
      NOT: Sıcaklık bu adım için çok önemli bir faktördür. Bu nedenle, taze çözülmüş veya bir buz / etanol banyosunda tutulan PBS kullanın.
   4. Kapak kapağını PBST tamponuyla doldurulmuş altı delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin. PBST'yi kuyucuklardan çıkarın ve taze PBS ekleyin. Örnekleri PBS'de 5 dakika bekletin.
      NOT: Numunelerin zarar görmesini ve sökülmesini önlemek için PBS'yi kuyunun kenarına pipetin.
   5. Taze PBS ile yıkayın ve görüntülemeye kadar numuneleri 4 °C'de bırakın.
      NOT: Numuneler 2 haftaya kadar stabildir, ancak numuneler 2 gün içinde görüntülendiğinde en iyi sonuçlar elde edilir.
   6. Görüntülemeden önce, numune montajının kalitesini stereo mikroskop altında değerlendirin.
      NOT: Başarıyla monte edilmiş germ hatları, kapak kaymasına göre fark edilebilir bir hareket olmadan sabit bir şekilde tutturulmuştur. Kötü bağlanmış germ çizgileri tampon çözeltisinde çırpınacaktır.

5. Görüntüleme

1. Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu
   NOT: Görüntüler, daha önce bildirildiği gibi, özel bir cisim etrafında inşa edilmiş özel yapım tek moleküllü bir lokalizasyon mikroskobu kullanılarak EMBL Görüntüleme Merkezi'nde elde edilmiştir.^38,43, 'de belirtilen benzersiz özelliklere sahip Malzeme Tablosu; https://www.embl.org/about/info/imaging-centre'ye bakınız
   1. 3D boncuk kalibrasyonu edinme
      1. Daha önce açıklandığı gibi yapışkan 100 nm floresan boncuklarla hassas bir kapak kayması (24 mm çap; 0,17 ± 0,005 mm, No. 1,5) hazırlayın^38,44.
      2. Adım 5.1.1.1'den itibaren kalibrasyon numunesini bir numune tutucuya yerleştirin.
      3. Temiz 100x/1,5 yağ hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin ve kalibrasyon numunesini mikroskopa monte edin.
      4. MicroManager 2 45,46 içinde^, kalibrasyon numunesinde^15-20 konum belirtin.
      5. EMU eklentisi penceresi^47'de, adım 5.1.1.5'teki pozisyonların her biri için bir z-stack görüntüsünün alınmasını ayarlayın.
         NOT: Burada, bileşik silindirik bir lens, 3D görüntüleme için gereken astigmatizmayı sağlar ve 10 nm'lik bir artışla -1 μm ila 1 μm arasındaki aralığı kapsayan her bir pozisyon için 201 z-dilimi elde edilmiştir. Her z-dilimi için²⁵ ms için 2 kW/cm2 640 nm lazer aydınlatma kullanılmıştır.
      6. Adım 5.1.11'de örnek görüntüler elde etmek için kullanılacak aynı optik yoldan 100 nm floresan boncukların z-stack görüntülerini elde edin.
      7. Süper çözünürlüklü mikroskopi analiz platformunu (SMAP⁴⁸) kullanarak, adım 5.1.13'teki 3D-SMLM verilerine uymak için kullanılacak deneysel nokta yayılma fonksiyonunun (PSF) bir cspline modelini oluşturun.
   2. Numune tutucuyu hazırlayın. Burada kullanılan, görüntüleme odasını oluşturmak için manyetik bir halka kullanan özel yapım tutucu için (Şekil 2B), manyetik halkayı parafilm ile sarın.
      NOT: Alternatif olarak, içbükey çöküntü boşluğuna sahip bir mikroskop slaydı, slayt tutuculu mikroskoplar için numuneleri monte etmek için kullanılabilir.
   3. 1 mL görüntüleme tamponu⁴⁴ hazırlayın (Tablo 1).
   4. Adım 4.2.6'dan bir kapak kapağı alın ve ısmarlama tutucuya yerleştirin. Tutucudaki kapak kaymasını parafilm sarılı manyetik halka ile sabitleyin (adım 5.1.2).
   5. Numunenin üstündeki manyetik halka tarafından oluşturulan hazneye görüntüleme tamponunu (adım 5.1.3) nazikçe pipetleyin (Şekil 2B). Odayı bir parça parafilm ile kapatın.
   6. Numuneyi monte etmek için, temiz 100x/1,5 yağ hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin. Daldırma yağına herhangi bir hava sokmadan, numune tutucuyu monte edilmiş numuneyle (adım 5.1.5) mikroskop aşamasına yavaşça yerleştirin.
      NOT: Numuneyi mikroskopa yerleştirmeden önce, kapak kapağının tabanını doku ve% 70 etanol ile temizleyin.
   7. MicroManager 2^45,46 içindeki EMU eklenti penceresi^47'yi kullanarak^, kadran fotodiyotunda (QPD) odak kilidi lazerinden gelen sinyal algılanana kadar piezo aşamasını hareket ettirin.
      NOT: Görüntüleme süresi boyunca sabit bir odağı korumak için, odak kilitleme, yakın kızılötesi fiber bağlantılı bir lazerin kapak kaymasından toplam dahili yansıması ve ardından bir kadran fotodiyot (QPD) üzerinde yüksekliğe duyarlı algılama ile elde edilir. QPD sinyali, objektif lens piezo yuvasının kapalı döngü kontrolünü sağladı.
   8. Daldırma yağında hava kabarcıklarının olmadığını doğrulamak için düşük güçte (yani% 1-5) 640 nm uyarma lazeri ile bir arka odak düzlemi görüntüsü elde edin.
      NOT: Bir hava kabarcığı algılanırsa numuneyi sahne alanından çıkarın. Kapak fişinin alt kısmını ve hedefi temizleyin ve 5.1.6-5.1.8 adımlarını tekrarlayın. Aksi takdirde, DAÜ yazılımı^47'deki odağı kilitlemeye devam edin.
   9. Parlak alan aydınlatmasını kullanarak gonad dokusunu lokalize edin. Düşük yoğunluklu 640 nm aydınlatma kullanarak, dokunun birçok SC gerilmesini içeren bölümüne odaklanın.
      NOT: Kapak kaymasından 2 μm'den daha uzak olan yapılara odaklanmayın. Numuneyi bulmak için daha yüksek bir lazer gücü kullanmayın, çünkü bu bazı floroforları erken yanıp sönen bir duruma dönüştürebilir. Burada, 1.000'e ayarlanmış bir darbe ile yükselen modda 1 kW /^cm2 kullanıldı.
   10. Uygun bir yanıp sönme hızı elde edilene kadar numuneyi ~30 s boyunca yüksek ışımada (27 kW /^cm2) 640 nm aydınlatma ile pozlamaya devam edin (Ek Video 1).
   11. MicroManager 2^45,46'daki çok boyutlu alma aracını kullanarak 20 ms pozlama süresiyle 200.000 kare elde edin^.
   12. Bu arada, istenen yanıp sönme hızını korumak için EMU eklentisi ^38,47'nin etkinleştirme seçeneğini kullanarak UV aktivasyonunu ayarlayın.
       NOT: UV lazeri, maksimum darbe uzunluğu 10.000 olarak ayarlanmış şekilde yükselen modda 3 kW/^cm2 parlaklıkta kullanın.
   13. SMLM görüntü rekonstrüksiyonu ve postprocessing gerçekleştirin.
       NOT: Ham SMLM verilerinden görüntüleri yeniden oluşturmak için, yayımlanmış yöntemlere bakın. Burada sunulan veriler SMAP^48,49 yazılımı kullanılarak işlenmiştir. SMAP⁴⁸ yazılımında süper çözümlenmiş görüntü yeniden yapılandırma, kanal atama, sapma düzeltme ve yerelleştirmelerin zayıf yerelleştirme hassasiyeti ve maksimum olasılık filtresiyle filtrelenmesi gerçekleştirildi.
2. Uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu
   NOT: Görüntüler, beyaz ışık lazeri, 775 nm darbeli STED lazer ve EMBL Görüntüleme Merkezi'ndeki (https://www.embl.org/about/info/imaging-centre) FALCON Fluorescence Lifetime IMyaşlanma modülü (Malzeme Tablosu) ile donatılmış entegre STED mikroskobik sistemde elde edilmiştir.
   1. Bir mikroskop slaytına 20 μL'lik bir damla montaj ortamı (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Adım 4.2.2'den bir kapak kayması alın ve numuneyi montaj ortamına bakan kızağa yavaşça yerleştirin (Şekil 2B).
      NOT: Montaj ortamının içine hava cepleri sokmaktan kaçının.
   2. Montaj ortamının gece boyunca sertleşmesine izin verin.
      NOT: Numuneleri ertesi gün görüntüleyin veya görüntülemeye kadar 4 °C'de tutun.
   3. Numuneyi monte etmek için, 5.2.2 adımından numunenin kapak kapağına bir damla daldırma yağı ekleyin. 100x/1.40 yağ hedefi kullanarak numuneyi yavaşça mikroskop aşamasına yerleştirin.
   4. Numuneye odaklanın ve parlak alan aydınlatmasını kullanarak germline dokusunu bulun.
   5. Mikroskop yazılımını kullanarak, TauSTED görüntüsünün elde edileceği ilgi alanını belirtin.
   6. Numunede kullanılan floroforları uyarmak için kullanılan uyarma lazerlerini ve uygun güçlerini seçin.
      NOT: Burada, AlexaFluor 594-konjuge F(ab')2 sekonder antikor fragmanlarını ve STAR 635P-konjuge F(ab')2 parçalarını görüntülemek için %3 güçte 635 nm %4 güçte 580 nm lazer kullanılmıştır.
   7. Mikroskop yazılımını kullanarak, uygun bir STED tükenme lazer gücü seçin ve görüntü algılamayı ayarlayın.
      NOT: Burada, 775 nm STED tükenme lazer gücü% 40 olarak ayarlanmıştır. Dedektör, foton algılama için 10 kazanç değerine sahip, 100 Hz tarama hızıyla ve 17 nm piksel boyutunda sayım modunda kullanıldı. TauSTED edinimi için dört satırlı birikim kullanılmıştır.

Results

SMLM ile C. elegans germline dokusu içindeki SC'yi görüntülemek için, kromozom eksenlerinin bir bileşeni olan HTP-3'ü ve enine filament SYP-5'in C-terminusunu bir hemaglutinin (HA) etiketi ile endojen olarak etiketlenmiş olarak lokalize etmek için 2 renk oranmetrik 3D-SMLM kullandık. Her iki proteinin de C. elegans'ın SC'si içindeki yeri daha önce diğer çalışmalarla^16,30 olarak belirlenmişti.

Kalın biyolojik örneklerde bulunan ışık saçılımını ve optik sapmaları en aza indirmek için, SC'leri içeren mayotik çekirdeklerin en alttaki z bölümünü görüntüledik (Şekil 3, sarı çizgiler). Elde edilen her görüntü için, görüntüleme düzleminin piezo sahne konumu, hedef kapak kaymasına odaklandığında piezo sahne konumuna göre işaretlendi. Bu, piezo mesafesinin kapak fişinden hesaplanmasına izin verdi. Başarılı bir şekilde monte edilmiş numuneler, kapak kaymasına yakın bir yere istikrarlı bir şekilde tutturulur ve gonad şeklini korur (yani, postfiksasyon adımı sırasında doku iki kapak kayması arasında ezilmez). Numune montajının kalitesi stereo mikroskop altında kolayca değerlendirilebilir, çünkü iyi tutturulmuş gonadlar çözeltide herhangi bir hareket göstermez (adım 4.2.6). Bununla birlikte, montaj işleminin stokastikliği nedeniyle, gonad dokusu mutlaka kapak kayması üzerine tamamen düz bir şekilde yerleştirilmeyecektir. Bu nedenle, SC'leri içeren çekirdeklerin alt düzlemi, aynı gonad içindeki örtü kaymasına göre değişen mesafelerde bulunabilir.

Dokunun kapak kaymasına bağlanmasına bağlı olarak çözünürlüğün nasıl değiştiğini göstermek için, kapak kaymasına farklı piezo mesafelerinde görüntüler elde ettik. Tek bir görüntünün kalitesini değerlendirmek için, Fourier halka korelasyon (FRC) eğrileri^50,51 hesaplandı ve çözünürlük, SMAP yazılımı⁴⁸ içindeki FRCResolution eklentisi kullanılarak belirlendi. Kapak kaymasına farklı mesafelerde çekilen iki ayrı 3D-SMLM görüntüsünden çıkarılan iki temsili çekirdek Şekil 4'te gösterilmiştir. Örtü kaymasının yakınında bulunan SC'lerde, kromozom eksenleri ve SYP-5::HA'nın C-terminusu her üç boyutta da iyi bir şekilde çözülmüştür (Şekil 4A, kapak kaymasından 0.8 μm). Belirli bir mesafe ile ayrılmış iki yapıyı çözmek için, elde edilen FRC çözünürlüğü genellikle eksenel çözünürlükte bu mesafenin yarısından daha küçük olmalıdır.

Aynı yapıları yanal olarak ayırmak için, daha küçük FRC çözünürlük değerlerinin elde edilmesi gerekir. Gerçekten de, kapak fişine yakın bir yerde bulunan örneklerde, FRC çözünürlüğü AlexaFluor 647 kanalı için 38 nm ve CF680 kanalı için 34 nm'dir ve bu nedenle SYP-5^16'nın C-termini arasındaki beklenen 84 nm mesafenin çok altındadır. Bu nedenle bu karar, SC'nin organizasyonunu sadece cephede değil, aynı zamanda yanal görüşlerde de kolayca çözmektedir (Şekil 4B i,ii). Buna karşılık, ışık saçılması ve küresel sapmalar nedeniyle kapak kaymasından 5 μm mesafede bulunan SC'lerde çözünürlük bozulur (Şekil 4B). Bu mesafedeki FRC çözünürlükleri, SYP-5'in C-terminini tam olarak çözemeyen 47 nm (AlexaFluor 647) ve 41 nm'ye (CF680) düşer. Optik sapmalar yanal çözünürlüğü eksenel çözünürlükten daha ciddi şekilde bozduğundan, HTP-3 ve SYP-5 bantları artık kapak kaymasından 5 μm mesafede bulunan örneklerde yanal görünümün kesitinde net bir şekilde çözülmemektedir (Şekil 4B ii). Kapak kaymasından farklı piezo mesafelerinde elde edilen görüntülerin FRC çözünürlüğünün karşılaştırılması, görüntülenen dokunun kapak kaymasından 2 μm'den daha fazla olmaması gerektiğini ortaya koymuştur (Şekil 5). Bu sonuç, postfiksasyon adımının doğru bir şekilde uygulanmasının önemini vurgulamaktadır, bu sırada doku, kapak kaymasının poli-L-lizin kaplamasına başarılı bir şekilde çapraz bağlanmalıdır.

Başka bir süper çözünürlük tekniği ile elde edilebilir çözünürlüğü göstermek için, SC'leri TauSTED mikroskobu ile sabit bozulmamış germline dokusunda da görüntüledik. Şekil 6A, SC'nin önden görünümdeki çizgi profillerinden tahmin edildiği gibi, bu çalışmada elde edilen en yüksek ve en düşük çözünürlüğe sahip TauSTED görüntülerini göstermektedir (Şekil 6B). Her iki çekirdekte de, kromozom eksenlerinde HTP-3'ün iki lokalizasyon bandını ve merkezi bölgedeki SYP-5'in C-terminini çözebiliriz, bu da TauSTED'de bu optimize edilmiş protokolü kullanarak elde edilebilecek çözünürlüğün 84 nm'nin altında olduğunu göstermiştir. En uygun koşullar altında (Şekil 6A, üstte), C-termini SC'nin sadece 50 nm ile ayrılmış hafif eğimli görünümlerinde çözebiliriz (Şekil 6A, sarı dikdörtgen ve 6C).

Şekil 1: Caenorhabditis elegans'taki sinaptonemal kompleksin organizasyonunun şeması. Karikatür, C. elegans'taki SC'nin basitleştirilmiş bir yapısını, iki homolog kromozomu (gri) birbirine bağlayan bir yapıyı göstermektedir. Yapı ön, yanal ve kesitsel görünümlerde gösterilir. Kromozom eksenleri kırmızı çubuklar olarak görüntülenirken, enine filamentler camgöbeği içinde gösterilir. Enine filament proteinleri (C. elegans'ta SYP-1, 5, 6), iki eksen arasındaki mesafeyi köprülemek için merkezi bölgede kafa kafaya bir şekilde (camgöbeği bilyalı çubuk grafikleri) yönlendirilir. Eksenler ve enine filamentlerin C-termini arasındaki beklenen mesafeler belirtilmiştir. Kısaltma: SC = synaptonemal complex. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Çalışmada kullanılan örnek preparatın illüstrasyonu . (A) Genç C. elegans yetişkinleri başlarına veya kuyruklarına (yeşil, kesikli çizgiler) diseke edilir ve protokolde açıklandığı gibi işlenir. (B) Yöntemin bireysel adımları, gri oklarla bağlanmış grafiklerle gösterilir. Kısaltmalar: STED = uyarılmış emisyon tükenmesi; SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ile gözlenebilen doku kesitinin yeri. Bütün bir montaj C. elegans gonadının dönen disk konfokal görüntüsünün MIP'si. Doku HTP-3 ve SYP-5'in C-terminali (SYP-5::HA) için boyandı ve kombine sinyal gri renkte gösterildi. Bireysel konfokal görüntüler, tüm gonadın bir görüntüsünü oluşturmak için Izgara / Koleksiyon dikiş Fiji eklentisi⁵² kullanılarak dikildi. İç kısım, SC'leri içeren en alttaki z-düzleminin xy görünümünü gösterir. Bu düzlemin lokalizasyonu, gonadın MIP görüntüsünde bir dikdörtgenle gösterilen doku bölümünün ortogonal görünümlerinde gösterilir (sarı çizgiler). Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: MIP = maksimum yoğunluk projeksiyonu; SC'ler = sinaptonemal kompleksler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: HTP-3'ün tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu ve SYP-5'in C-termini. (A,B) Sol: HTP-3 (kırmızı) için boyanmış pakiten çekirdeklerini gösteren SMLM görüntüleri ve SYP-5'in C-terminusu (SYP-5::HA, camgöbeği) (ölçek çubuğu = 1 μm). Orta: A ve B'de belirtilen, her görüntünün altında karşılık gelen kesit görünümleriyle birlikte gösterilen ilgi çekici bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri (i, ii; ölçek çubuğu = 100 nm). SC'nin yakınlaştırılmış görüntülerdeki uzantıları, kromozom eksenlerini y eksenine paralel olarak yönlendirmek için döndürülür. Sağ: SC içindeki ilgili proteinlerin lokalizasyonunun grafiksel gösterimi, SC'nin şeklin merkezinde görüntülenen yakınlaştırılmış bölgelerdeki yönelimini tasvir eder. Kısaltmalar: SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi; SC = sinaptonemal kompleks. SMLM görüntülerini yeniden oluşturmak için ham veriler BioStudies veritabanı⁶⁰ (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi görüntülerinin Fourier halka korelasyon çözünürlüğü, görüntülenen z-düzleminin kapak kayması düzleminden uzaklığına bağlıdır. Renkli çizgiler, kapak kapağından farklı mesafelerde (renk çubuğuyla gösterildiği gibi) elde edilen görüntülerin FRC eğrilerini gösterir. FRC çözünürlüğünü belirlemek için kullanılan 1/7 eşiği siyah yatay bir çizgi ile gösterilir. Girintiler, FRC çözünürlüğünün kapak fişinden piezo mesafesine bağımlılığını gösterir. Çizim, orijinal eğrilerin "ggplot2" paketindeki işlevlerle düzgünleştirildiği özel olarak yazılmış bir R komut dosyası (sürüm 4.1.2, Ek Dosya 1) tarafından gerçekleştirildi. Kısaltmalar: FRC = Fourier halka korelasyonu; SMLM = tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu; SC = sinaptonemal kompleks. FRC eğrileri ve SMLM verileri BioStudies veritabanı⁶⁰ (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla edinilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Floresan ömür boyu tabanlı bilgi (TauSTED) ile geliştirilmiş uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu, hem HTP-3 hem de SYP-5'in C-terminusu için iki lokalizasyon bandını çözer. (A) İki temsili TauSTED görüntüsü, HTP-3 (kırmızı) ve SYP-5'in C-terminusu (SYP-5::HA, camgöbeği) için boyanmış pakiten çekirdeklerini, daha yüksek (üst) ve alt (alt) yapısal tanım (ölçek çubuğu = 1 μm) ile göstermektedir. Dikdörtgenler, SYP-5'in çözülmüş C-termini ile bölgeleri önden (beyaz) ve SC'nin hafif eğimli bir görünümü (sarı) ile işaretler. (B, C) HTP-3 (kırmızı) dağılımı ve TauSTED tarafından çözülen SYP-5 (camgöbeği) sinyalinin C-terminusu. SC'yi önden (B) veya hafif eğimli (C) görünümlerde içeren ilgili bölgelerin çizgi profilleri, yoğunluğu maksimum değere normalleştirilmiş tam çizgiler olarak gösterilir. Çizgi profilleri Fiji ImageJ kullanılarak oluşturulmuştur. B'deki kesikli çizgiler , her protein için ortalama verileri gösterir. C'deki kalın camgöbeği çizgisi , SYP-5'in C-termini arasındaki en kısa çözülmüş mesafeye sahip çizgi profiline karşılık gelir. Spesifik proteinleri hedef alan antikorlar arasındaki mesafeleri belirlemek için, çizgi profilleri (n = 9 (B), n = 7 (C)), özel olarak yazılmış bir R betiği (sürüm 4.1.2, Ek Dosya 1) kullanılarak çift gaussianlar ile donatıldı. Ortalama mesafe ± standart sapma (B) ve minimum değeri kalın (C) olarak vurgulanan aralık sırasıyla her grafiğin üstünde gösterilir. Kısaltmalar: STED = uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu; SC = sinaptonemal kompleks. Çizilen çizgi profillerinin görüntülenen görüntüleri ve veri noktaları BioStudies veritabanı⁶⁰ (Katılım Kimliği: S-BIAD504) aracılığıyla kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponların ve çözeltilerin bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Video 1: Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi edinimi. Floroforların uygun bir hızda yanıp söndüğünü gösteren video (50 kare gösterilir, ölçek çubuğu = 5 μm, 20 ms/kare). Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Veri analizi komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Homolog kromozomların doğru rekombinasyonu ve ayrışması için gerekli olan SC'nin merdiven benzeri organizasyonu, ilk olarak yaklaşık 70 yıl önce elektron mikroskobu ^3,4'te gözlemlenmiştir. SC'nin genel organizasyonu elektron mikroskobunda kolayca çözülürken, bu kompleks içindeki bireysel bileşenlerin lokalizasyonu daha hedefli bir yaklaşım gerektirir. Sadece ~ 100 nm genişliğiyle, SC'nin alt yapısı geleneksel floresan mikroskobu ile çözülemez. Bununla birlikte, süper çözünürlüklü mikroskopi, sinaptonemal kompleksin yapısı ve işlevi üzerine yeni keşifler için önemli bir itici güç haline gelmiştir 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Bu araştırmayı kolaylaştırmak için, SMLM ve STED mikroskobu ile C. elegans gonad dokusu içindeki SC'nin mimarisini incelemeye izin veren bir montaj prosedürü gösterdik.

SMLM görüntülemede çözünürlüğü optimize etmek için kritik bir adım, germ hattı dokusunu poli-L-lizin kaplı bir kapak kaymasına doğrudan çapraz bağlamaktır (adım 4). Dokunun kapak kaymasına kovalent olarak bağlanması, numune içindeki hareketleri azaltmak ve SMLM için uzun süre görüntülemeyi imkansız hale getirecek şekilde büyük sapmalara neden olacak şekilde gereklidir. Ek olarak, SC'leri içeren çekirdekleri kapak kaymasından uzakta bırakan optimal olmayan bir bağlantı bile, küresel sapmalardan kaynaklanan ulaşılabilir çözünürlükte önemli bir düşüşe yol açar (Şekil 4). Burada kullanılan kovalent ataşmana alternatif olarak, lekeli germline dokusu, küçük bir görüntüleme tamponu^19,30 damlasında iki kapalı kapak kapağı arasında hareketsiz hale getirilebilir. Bununla birlikte, bu immobilizasyon yöntemi, numunedeki görüntüleme tamponunun hacmini, burada optimize edilmiş protokolde kullanılan 1 mL'den sadece birkaç μL'ye düşürür, bu da görüntüleme tamponunun asitlenmesine neden olur ve numunenin görüntülenebileceği süreyi ciddi şekilde azaltır 38,53,54.

Hem SMLM hem de STED mikroskopisi için uzun elde etme süreleri, bu yöntemlerin kullanımını kimyasal olarak sabitlenmiş numunelerin görüntülenmesiyle sınırlar. Burada, paraformaldehit fiksasyonu, numune hazırlama ve görüntüleme sırasında SC'nin yapısının korunmasını sağlar. Bununla birlikte, SC'yi sağlam doku içinde görüntülemek için burada alınan önlemlere rağmen, fiksasyondan sonra SC'nin ortaya çıkan yapısı, canlı bir organizma içindeki doğal durumundaki yapıyla aynı olmak zorunda değildir. Dahası, sabit SC'nin tek bir görüntüsü biyolojik yapının tek bir "anlık görüntüsünü" temsil ettiğinden, bu yaklaşım in vivo olarak doğal yapının dinamiklerine kör kalır.

Bununla birlikte, makromoleküler yapıların dinamikleri ve değişkenliği hakkında bilgi, sadece tek bir değil, birçok "anlık görüntü" elde edilerek de elde edilebilir. Bu yaklaşım, pachytene¹⁹ sırasında SC'nin yapısındaki değişiklikleri çözebilirken, bu protokol kullanılarak hazırlanan tek bir örneklemden elde edilebilecek görüntü sayısını sınırlayan birkaç faktör vardır. İlk olarak, görüntü elde etme sırasında kullanılan yüksek lazer güçleri, floroforların kalıcı olarak ağartılmasına yol açar ve bitişik ilgi alanlarının veya çoklu z-düzlemlerinin görüntülenmesini engeller, böylece tek bir numuneden elde edilebilecek görüntü sayısını önemli ölçüde azaltır. İkincisi, bu yöntemle hazırlanan kapak kayması üzerindeki numune/doku yoğunluğu düşüktür, bu da tek bir kapak kaymasından elde edilebilecek görüntü sayısını önemli ölçüde sınırlar. Düşük numune yoğunluğu,^diğer biyolojik sorulara ışık tutmaya yardımcı olan otomatik görüntü toplama boru hatlarının kullanımını da yasaklar 34,55,56,57,58,59. Bununla birlikte, numune yoğunluğu deneyimli bir kullanıcı tarafından biraz arttırılabilir.

Burada sunulan protokol, SMLM^35'te optimum çözünürlük elde etmek için gerekli olan yüksek etiketleme yoğunluğunu elde etmek için optimize edilmiştir. Önceki protokoller, immün boyama^16'dan önce dokuyu kovalent olarak kapak kaymasına bağlarken, bu yeni protokol, dokuyu yalnızca numuneler çözelti içinde boyandıktan sonra kapak kaymasına çapraz bağlar. Bu modifikasyon, immünoetiketleme için kullanılan antikorların dokuya her taraftan serbestçe erişmesine izin verirken, dokunun kapak kaymasına kovalent bağlanması, antikorların kapak kaymasına en yakın çekirdeğe ulaşmasını kısıtlayabilir ve böylece etiketleme derecesini azaltabilir. Birlikte, burada açıklanan modifikasyonlar çözünürlüğü 40-50 nm'den (FRC çözünürlüğü)^16'dan 30-40 nm'ye (bu protokol) yükseltir.

Önemli olarak, SMLM için yüksek etiketleme yoğunluğu ve yüksek konsantrasyonda antikor gerekli olsa da, daha düşük antikor konsantrasyonları kullanılarak daha iyi STED mikroskopi görüntülerinin elde edildiğini bulduk. Onlarca nanometrelik bir çözünürlükte, ilgilenilen proteini etiketlemek için kullanılan moleküllerin boyutu giderek daha önemli hale geliyor. Bu nedenle, tam uzunluktaki antikorların yarısı büyüklüğünde olan F (ab')2 fragmanlarını kullandık. Daha küçük bir sinyal kaynağı nedeniyle lokal kontrasttaki iyileşme ve dolayısıyla tam uzunlukta ikincil antikorların kullanılmasına kıyasla bu modifikasyonla elde edilen çözünürlük, merkezi bölge içindeki SYP-5'in iki C-termininin TauSTED tarafından çözülmesine izin verdi, bunlar tam uzunlukta antikorlar kullanılarak geleneksel STED ile çözülmedi (¹⁶ ve veriler gösterilmedi). Bozulmamış C. elegangerm hatlarındaki SC'leri görüntülemek için optimize edilmiş bu protokolün, mayoz sırasında SC'nin yapı-fonksiyon ilişkisinin araştırılmasını kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.5 yağ objektifi	Olympus	UPLAPO100XOHR	UPLAPO100XOHR
2-merkaptoetilamin (MEA)	Sigma-Aldrich	30070-10G	MilliQ suda 5 M çözeltiye çözülür, pH   8.7 HCl ile ayarlanır. Tek kullanımlık bir hacme alınır, dondurulur ve -80 ° C'de tutulur.
Ek 640 nm güçlendirici lazer	Toptica	IBEAM-SMART-640-S-HP
AlexaFluor 594, NHS ester	ThermoFischer Scientific	A37572	DMSO içinde 1 mM çözeltiye çözülür, tek kullanımlık hacme ayrılır, dondurulur ve -80 °C'de tutulur; C
AlexaFluor 647, NHS ester	ThermoFischer Scientific	A37573	DMSO içinde 1 mM çözeltiye çözülür, tek kullanımlık hacme ayrılır, dondurulur ve -80 °C'de tutulur; C
anti-HA	Thermo Fisher Scientific	2-2.2.14	Fare monoklonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Mikroskopi)
anti-HTP-3	Abby F. Dernburg	MacQueen ve ark.'dan bir hediye, 2005	Tavuk poliklonal, 1:250 (SMLM), 1:1,000 (STED Mikroskobu)
Caenorhabditis elegans suş  YKM349	Yumi Kim	Hurlock ve ark.'dan bir hediye, 2020	syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II
CF6680, NHS ester	Biotium	92139	DMSO'da 1mM çözeltiye çözüldü, tek kullanımlık hacme aliquoted, donduruldu ve -80 &°C'de tutuldu; C
Dairesel kapak camı 12 mm No. 1	Menzel-Glä ser; VWR	631-0713
Dairesel kapak camı 24 mm No. 1.5	Carl Roth	PK26.1
Silindirik lensler	Thorlabs	LJ1516RM-A, LK1002RM-A
Yumurta Tamponu (10x)		Edgar 1995	250 mM HEPES, 1.18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7.4
Etanol (analiz için mutlak)	Merck	64-17-5
F(ab')2 parçalı anti-tavuk IgY	Jackson İmmünoresearch	AB_2340347	Eşek poliklonal, 1:100 (SMLM), 1:1.000 (STED Mikroskobu)
F(ab')2 parçalı anti-fare IgG	Jackson İmmünoresearch	AB_2340761	Eşek poliklonal, 1:100 (SMLM), 1:1.000 (STED Mikroskobu)
Fisherbrand Mikroskop slaytları T/F Zemin 0.8-1.0 mm kalınlığında	Fisher scientific	7107
Ölçer Solucan Kazma 30 çap 0.254 mm - İridyum %10	Kisker	789265
Glikoz oksidaz/Katalaz enzim karışımı (GlOX/Cat)	Jonas Ries'ten	bir hediyeHoess, Mund, Reitberger ve Ries, 2018	20x, 1916 U/mL glikoz oksidaz (Sigma G7141), 42350 U/mL katalaz (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, %51 gliserol, MilliQ su. -20 ° C'de saklanır.
Görüntüleme tamponu tabanı	Jonas Ries	Hoess, Mund, Reitberger ve Mund'dan bir hediye Ries, 2018	50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, %10 D-Glikoz. Tek kullanımlık bir hacme (950 μ L), dondurulur ve -80 ° C'de tutulur.
Invitrogen ProLong Cam Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36982
Leica Stellaris 8 STED FALCON	Leica	N/A	Mikroskop, en yeni nesil beyaz ışık lazeri, 775nm darbeli STED lazer, FALCON F< / güçlü>luorescence L< / güçlü>ifetime IM<>güçlü modülü, HC PL APO CS2 100x/1.40 yağ objektifi ve Leica HyD X dedektörü. Sistem, bir boyanın spesifik floresan ömrünü ölçen FLIM modülü ile geliştirilmiş Tau-STED yeteneğine sahiptir ve bu nedenle boyaların floresan ömürlerindeki farklılıklara ve numunedeki boya koşullarına bağlı olarak arka plan sinyalini kaldırabilir. Ek olarak, tükenme çöreğinin farklı alanlarındaki floresan ömürlerinin değişimi hesaba katılarak çözünürlük artırılır.
Uzun dalga kanal emisyon filtresi	AHF Analysentechnik	F47-702	700/100 nm bant geçiren
Metanol (analiz için mutlak)	Merck	67-56-1
NaHCO3	Sigma-Aldrich/Merck	S5761-500G	100 mM NaHCO3, pH 8.3
Yakın kızılötesi fiber bağlantılı lazer	Toptica	IBEAM-SMART-PT-CD	Özel Tasarım, 808 nm - 75mW
Objektif lens piezo yuvası (PIFOC)	Physik Instrumente	P-726.1.CD	100 & mikro; m hareket aralığı
Orca Fusion BT sCMOS kamera	Hamamatsu	C15440-20UP
PCR tüpleri	Greiner Bio-One	673283	0,2 mL
Fosfat Salin Tamponu (PBS 10x)		N/A	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4
Pierce %16 formaldehit (a/h), metanol içermez	ThermoFischer Scientific	28906	%16 formaldehit, orijinal cam ampulden 1.5 mL'lik tüpe aktarılır ve oda sıcaklığında tutulur.
PlasmaPrep2 plazma temizleyici	GaLa Instrumente GmbH	N/A
Poli-L-lizin hidrobromür	Sigma-Aldrich/Merck	P2636-25MG	%0.1 w/v çözeltisi Milli-Q suda hazırlandı ve -20 ° C'de alikotlarda saklandı.
Birincil dikroik (aydınlatma yansıtıcı)	AHF Analysentechnik	F73-866S	dörtlü bant geçişi @ 405, 488, 561, 640
Dörtlü filtre	AHF Analysentechnik	F40-072	405/488/561/640 nm
Kadran fotodiyot (QPD)	Lazer Bileşenleri	SD197-23-21-041, LC301DQD-PV
Tıraş bıçakları	Apollo Herkenrath Solinger	N/A
Kırılma ışını şekillendirici	AdlOptica	PiShaper 6_6_VIS
Roche Bloke Edici Reaktif	Roche	11096176001	10x solüsyonu tavsiyeye göre hazırlanmıştır. Dondurulmuş alikotlar -20 ° C'de saklandı.
Neşter bıçağı (Tüy markası #11, No. 3)	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1110911
Neşter çıkarma kutusu	Fisher scientific	10002-50
İkincil dikroik (emisyon yansıtıcı)	AHF Analysentechnik	F38-785S	750 nm uzun geçiren
Kısa geçiren filtre	Semrock	BSP01-785R-25	750 nm
Kısa dalga kanal emisyon filtresi	AHF Analysentechnik	F37-677	676/37 nm bant geçişli
Tek molekül lokalizasyon mikroskobu	EMBL Görüntüleme Merkezi	Diekmann ve diğerleri, 2020 modifikasyonlarla	Mikroskop, tek modlu fiber bağlantılı lazer motoru, ek güçlendirici lazer ve tek tip bir aydınlatma alanı sağlamak için kırılma ışını şekillendirici aracılığıyla geniş alan epi-aydınlatması sağlar (Stehr ve diğerleri, 2019). Geniş alan görüntüleri bir sCMOS kamerada yakalanır  ve 61x sistem büyütmesi ve 106 nm piksel boyutu için uygun röle optiği<> Spektral olarak örtüşen uzak kırmızı boyaların oransal görüntülemesi için, bir görüntü ayırıcı kamerada spektral olarak farklı iki görüntü üretir (bölme dikroik: 665 nm uzun geçiş, kısa dalga kanalı emisyon filtresi: 676/37 nm bant geçişi, uzun dalga emisyon filtresi: 700/100 nm bant geçişi. Ek bir 405/488/561/640 nm dörtlü çentik filtre ve 750 nm kısa geçiren filtre, iki yol için ortaktır ve ek lazer engelleme sağlar). Bileşik silindirik lens, 3D görüntüleme için gereken astigmatizmayı sağlar. Zaman içinde 2 saati aşan çekimler arasında sabit bir odak sağlamak için (200.000 - 250.000 görüntüden oluşan), odak kilitleme, yakın kızılötesi fiber bağlantılı bir lazerin toplam iç yansıması ile elde edilir  lamel ve müteakip bir kadran fotodiyot (QPD) üzerinde yüksekliğe duyarlı algılama. QPD sinyali, objektif lens piezo yuvasının kapalı döngü kontrolünü sağladı. Bu mikroskoba erişim için https://www.embl.org/about/info/imaging-centre veya ic-contact@embl.de başvurun
Tek modlu fiber bağlantılı çoklu lazer motoru	Toptica	iCHROME MLE-LFA-HP	405, 488, 561, 640 nm'de 100 mW'lık geniş alan epi-aydınlatması sağlar
Yarma dikroik	AHF Analysentechnik	F48-665SG	665 nm uzun geçişli
Kare kapaklı cam 22 x 22 mm No.1	Menzel-Glä ser; VWR	630-2882
STAR 635P, NHS ester	Abberior	ST635P-0002-1MG	DMSO içinde 1 mM çözeltiye çözülür, tek kullanımlık hacme eklenir, dondurulur ve -80 °C'de tutulur; C
Stereo mikroskop Stemi 305 Stand K LAB	Zeiss	N/A
Tetramisol hidroklorür	Sigma-Aldrich/Merck	T1512-2G	%1 (a/h) çözelti Milli-Q suda hazırlandı. Donmuş alikotlar -20 ° C. Çözülmüş alikot 4 ° C'de saklandı; C ve birkaç ay boyunca kullanılır.
TetraSpeck Mikroküreler	ThermoFischer Scientific	T7279	0.1 ve mikro; m, floresan mavi/yeşil/turuncu/koyu kırmızı
Tris Salin Tamponu (TBS 10x)		N/A	200 mM Tris-HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5
TWEEN 20	Sigma-Aldrich/Merck	P9416-50ML	Orijinal ambalajında oda sıcaklığında saklanır.
WormStuff solucan toplama	Kisker	789277
XY mikroskop aşaması	Smaract	N/A	Özel Tasarım
Zeba Micro Spin Tuz Giderme Kolonu	ThermoFischer Scientific	89877	7K MWCO, 75 ve mikro; L